Informatie

5.3: Laboratoriumprocedures - Levensvatbaar aantal bloedplaatjes - Biologie

5.3: Laboratoriumprocedures - Levensvatbaar aantal bloedplaatjes - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Leerresultaten

  • Leer microbiologische vaardigheden zoals pipetteren, het uitvoeren van seriële verdunningen, het voorbereiden van spreidplaten voor een levensvatbare plaattelling en het uitvoeren van een kolonietelling.
  • Schat het aantal microben in een monster met behulp van seriële verdunningstechnieken, waaronder: a. juiste keuze en gebruik van pipetten en pipetteerapparatuur b. correct spreiden van verdunde monsters voor het tellen c. het inschatten van geschikte verdunningen d. extrapolatie van plaattellingen om de juiste CFU in het uitgangsmonster te verkrijgen.

Materialen:

Culturen: bouilloncultuur in stationaire fase van Serratia marcescens

Media: Verdunningsbuizen met steriel water

Benodigdheden: voedingsagarplaten, P-1000 Pipetman, steriele tips, steriele L-vormige blauwe celspreiders ("hockeystick" of "spreader")

Procedure:

A. Monsterverdunning en gespreid plateren

1. Label een plaat op de bodem voor elk van de volgende verdunningen: 10-5,10-6 , 10-7, 10-8en 10-9. Zie afbeelding 1.

2. Label de verdunningsbuisjes als volgt: label de twee buisjes (marineblauwe doppen) met 9,9 ml steriel water als 10-2 en 10-4; label de vier buisjes (groene doppen) met 9,0 ml steriel water als 10-5, 10-6, 10-7, en 10-8.

3. Voorzichtig en aseptisch verwijder 0,1 ml (100 µL) van de Serratia marcescens cultuur en pipet het in de buis gemarkeerd met 10-2. Meng de buis volledig, zorg ervoor dat u niets van de inhoud morst. De vortexmixer helpt je bij het mengen van de inhoud van de tube.

• Je hebt nu een 10 . voorbereid-2 (1/100) verdunning. Waarom is het 10-2? Omdat 0,1 ml onverdunde kweek werd verdund in 9,9 ml water, waardoor een totaal volume van 10,0 ml in de verdunningsbuis werd verkregen. Dat maakt dit een 10-2 verdunning (0,1/0,1 + 9,9 = 0,1/10,0= 1/100= 10-2).

4. Chang de pipetpunt op, en neem 100 µL (0,1 ml) van de 10-2 verdunning en pipet het in het volgende verdunningsbuisje van 9,9 ml met de markering 10-4. Goed mengen. U heeft nu een opeenvolgende 1/100 verdunning voorbereid, resulterend in 10-4 verdunning van de origineel cultuur (1/100 vermenigvuldigd met 1/100 = 1/10.000 = 10-4, wat hetzelfde is als 10-2 x 10-2=10-4).

5. CHBreng uw pipetpunt opnieuw aan.

• Waarom steeds pipetten verwisselen? Omdat vloeistof die in de pipetpunt van de vorige verdunning achterblijft, veel meer cellen per ml zal bevatten dan elke opeenvolgende verdunning en, indien gebruikt, de uiteindelijke resultaten ernstig zal verwarren door een hoger aantal cellen aan te geven dan in het oorspronkelijke monster aanwezig was.

Nu gaan we een reeks van 1/10 verdunningen doen. Stel uw Pipetman in op 1.000 µL en verwijder een aliquot van 1.000 µL (1,0 ml) uit de 10-4 verdunning buis. Breng het over naar de verdunningsbuis van 9,0 ml met de markering 10-5 en meng goed. De originele cultuur is nu verdund 1/100.000, of 10-5 (10-4 x 10-1 = 10-5),

• Je hebt zojuist een 10 . voorbereid-1 (1/10) verdunning van de eerder verdunde cultuur. Waarom is het 10-1? Omdat 1,0 ml verdunde kweek verder werd verdund in 9,0 ml water, wat een totaal volume van 10,0 ml in de verdunningsbuis opleverde. (1,0/1,0 + 9,0 = 1,0/10,0 = 1/10 = 10-1). Nu weet je waarom deze reeksen verdunningen worden aangeduid als seriële verdunningen.

  • Ga door met uw verdunningsreeks, zoals aangegeven in afbeelding 1, tot en met de 10-8 verdunning buis.

Afbeelding 1: Seriële verdunning en plating

6. Met behulp van een nieuwe pipetpunt, breng 100 µL (0,1 ml) van de 10-8 verdunning op het midden van het agar-oppervlak van de plaat gemarkeerd met 10-9.

Bedenk waarom dit een 10 . is-9 plaat nadat u 100 L (0,1 ml) inoculum van de 10-8 verdunningsbuisje erop. Onthoud dat u het aantal levensvatbare cellen probeert te bepalen in elke hoeveelheid van 1,0 ml van het origineel Serratia marcescens monster, en je doet slechts 10% van 1,0 ml (0,1 ml) op de voedingsagarplaat.

Herhaal met de rest van de verdunningen, breng 100 µL (0,1 ml) van elk verdunningsbuisje over op het juiste agar-oppervlak, met een nieuwe pipetpunt tussen elk verdunningsbuisje.

7. Spreidplaten: Neem met een goede aseptische techniek één steriele blauwe L-vormige celverspreider uit de zak en sluit de zak opnieuw. Beginnend met de plaat gemarkeerd met 10-9 , met behulp van de spreider, duw voorzichtig het vloeibare entmateriaal dat op het midden van de plaat is aangebracht, twee of drie keer met de klok mee rond de schaal, dan meerdere keren tegen de klok in, draai de plaat op de draaitafel als dat nodig is om te verkrijgen compleet Dekking.

Ga verder met de rest van de spreidplaten hetzelfde gebruiken celverspreider. Zorg dat je blijft werken achteruit (vanaf 10- 9 , dan 10-8 , dan 10-7, dan 10-6 enz.) van de meest verdunde suspensie tot de meest geconcentreerde suspensie om de hoeveelheid overdracht van plaat naar plaat te minimaliseren. Gebruik opnieuw een goede aseptische techniek, werk snel, raak de celverspreider niet aan op andere oppervlakken dan de agarplaat die u gebruikt. Als u de strooier per ongeluk "vervuilt" door een oppervlak (tafel of iets anders) aan te raken, gooi deze dan weg en koop een nieuwe strooier. We proberen het gebruik van de strooiers te minimaliseren om afval te verminderen, maar als het in gevaar komt, vervang het dan door een nieuwe steriele spreider.

Gooi de celstrooier weg in de kleine oranje biohazard-bak op uw bank als u klaar bent met uw strooiplaten.

Vergeet niet dat de platen moeten worden geëtiketteerd als een tienvoudig hogere verdunning dan de verdunningsbuis van het monster van 0,1 ml dat wordt geplateerd. Bijvoorbeeld 0,1 ml van de 10-6 verdunningsbuis moet worden geplateerd op de agarplaat met de markering 10-7. Nogmaals, als je hulp nodig hebt om dit te visualiseren, zie figuur 6.1.

Het is over het algemeen wenselijk om duplicaat te maken of drievoudige aanplant van elke verdunning en om de resulterende tellingen te middelen. Aangezien uw laboratoriummonster echter uit dezelfde stamcultuur komt, zou het klassegemiddelde een nauwkeurige opsomming moeten geven van de oorspronkelijke stamcultuur.

8. Laat de borden na het uitstrijken ten minste 30 minuten met de agarzijde naar beneden liggen. zodat het inoculum op de agar kan absorberen, keer de platen om en incubeer bij 30°C.

B. Kolonies op platen tellen

1. Kijk naar je verdunningsplaten die de afgelopen periode zijn voorbereid en kies de platen met 30-300 kolonies erop. Aangezien dit enige oefening in het tellen van platen kan vergen, moet u mogelijk alle platen kiezen met wat lijkt op een redelijk aantal te tellen kolonies.

A. Die platen die geen microbiële groei hebben, kunnen worden geregistreerd als: 0 of NG, Geen groei.

B. Die platen waarop kolonies niet afzonderlijk te onderscheiden zijn (hun randen lopen samen) kunnen worden geregistreerd als: TNTC, tooo Nomslachtig tO Ctante.

C. Die platen waarop je geen individuele kolonies kunt onderscheiden, het hele oppervlak is bedekt met microbiële groei, kunnen worden geregistreerd als: samenvloeiend.

2. Tel elke kolonie om een ​​totaal aantal kolonies te krijgen voor elke gekozen plaat. U voorkomt dat u een kolonie twee keer telt door de kolonies op de bodem van de plaat te markeren terwijl u ze telt. Dit vereist natuurlijk dat de plaat ondersteboven ligt. Zorg ervoor dat u eventuele kleine kolonies telt. Noteer uw resultaten op het rapportblad.

C. Berekening van het aantal levensvatbare cellen/ml in het originele monster

• Kies de plaat met 30 tot 300 kolonies.

• Vermenigvuldig de aantal kolonies op de plaat door de uiteindelijke verdunningsfactor. Dit geeft de totale levensvatbare cellen/mL in het oorspronkelijke monster.

• Bereken de kolonievormende eenheden, KVE, per ml voor de Serratia marcescens cultuur.

D. Bekijk deze video over het uitvoeren van een seriële verdunning en het maken van spreidplaten.

Bekijk video 1: Verdunningen en Plating bij NC State Microbiology labs. URL: https://youtu.be/IJcw4fRsYnU


Gietplaatmethode: procedure, gebruik, (dis)voordelen

De gietplaatmethode is meestal de voorkeursmethode voor het tellen van het aantal kolonievormende bacteriën dat aanwezig is in een vloeibaar monster. Omdat het monster wordt gemengd met het gesmolten agarmedium, kan een groter volume worden gebruikt dan met de spreidplaat. Bij deze methode wordt een vaste hoeveelheid inoculum (in het algemeen 1 ml) uit een bouillon/monster in het midden van een steriele petrischaal geplaatst met behulp van een steriele pipet. Gesmolten gekoelde agar (ongeveer 15 ml) wordt vervolgens in de petrischaal met het inoculum gegoten en goed gemengd. Na het stollen van de agar wordt de plaat omgekeerd en 24-48 uur bij 37°C geïncubeerd.

Micro-organismen zullen zowel op het oppervlak als in het medium groeien. Kolonies die in het medium groeien, zijn over het algemeen klein van formaat en kunnen samenvloeien, de weinige die op het agar-oppervlak groeien, zijn van dezelfde grootte en lijken op die op een strookplaat. Elke (zowel grote als kleine) kolonie wordt zorgvuldig geteld (indien nodig met behulp van een vergrotende kolonieteller). Elke kolonie vertegenwoordigt een "kolonievormende eenheid" (CFU).

Het aantal micro-organismen dat in het specifieke testmonster aanwezig is, wordt bepaald met behulp van de formule:

KVE/ml= KVE * verdunningsfactor * 1/aliquot

Voor nauwkeurige tellingen moet de optimale telling binnen het bereik van 30-300 kolonies/plaat liggen. Om een ​​telbare plaat te verzekeren, moet een reeks verdunningen worden geplateerd. De gietplaatmethode voor het tellen van bacteriën is nauwkeuriger dan de streak plaat methode:, maar gemiddeld zal het een lager aantal opleveren, omdat warmtegevoelige micro-organismen kunnen afsterven wanneer ze in contact komen met heet, gesmolten agarmedium.


5.3: Laboratoriumprocedures - Levensvatbaar aantal bloedplaatjes - Biologie

MICROBILE TESTPROCEDURES

1. Onderzoek van voedingsmiddelen op de aanwezigheid, soorten en aantallen MO en/of hun metabolieten is de basis van de voedselmicrobiologie.

2. Bij het gebruik van deze technieken is het belangrijk om te onthouden dat, vanwege specifieke groeivereisten of limieten tussen verschillende MO, geen van de veelgebruikte methoden geeft een exacte telling van de MO in een voedsel.

3. In het geval van sommige pathogene organismen of hun toxines, je wilt het gewoon weten of ze nu wel of niet aanwezig zijn.

eerste beslissing te maken tijdens het microbiologisch testen van voedingsmiddelen is:

B. Een gehomogeniseerd monster van het voedsel.

Hoewel de meeste voedselmonsters worden gehomogeniseerd, kan in sommige voedingsmiddelen, zoals stukken vlees waarvan de binnenkant in wezen steriel is, een oppervlaktemonster belangrijker zijn omdat homogenisatie porties voedsel omvat die geen MO bevatten en verdunde resultaten.

Andere toepassingen waarbij oppervlaktemetingen belangrijk zijn bij MO-testen zijn onder meer voedselcontactoppervlakken in een plant.

Hoewel het niet altijd mogelijk is om alle micro-organismen van een oppervlak te herstellen, biedt het consequent bewaken van specifieke gebieden in een voedselplant door middel van oppervlaktetesten waardevol inzicht in de relatieve reinheid van dat gebied.

1. zwabberen – MO verzameld van een oppervlak met steriele wattenstaafjes van katoen of calciumalginaat (alginaatstaafjes zijn de beste omdat het alginaat gemakkelijk kan worden opgelost in hexametafosfaat), overgebracht naar bouillon waar ze worden losgemaakt, vervolgens verdund en gebruikt met verdere tests om het totaal te bepalen nummers. Sponzen kunnen worden gebruikt om grotere gebieden af ​​te vegen en vervolgens in een met buffer gevulde zak te plaatsen.

C. Zeer geschikt voor flexibele, oneffen en sterk verontreinigde oppervlakken

1. MO-herstel kan slecht zijn (10% in sommige onderzoeken, maar zelfs dat is nog steeds acceptabel voor veel toepassingen)

2. Contactplaten (Rodac platen) – verhoogde agarplaat die tegen een oppervlak wordt gedrukt en vervolgens wordt geïncubeerd.

1. Methode naar keuze voor gladde, stevige en niet-poreuze ondergronden (bijv. kuip in een kaasfabriek)

2. Elk type media kan worden gebruikt

1. Overgroei van kolonies maakt telling moeilijk op sterk verontreinigde oppervlakken

2. Verwijdert slechts ongeveer 0,1% van de contactflora - veel minder dan wattenstaafjes

Een aangepaste versie van deze techniek is de agarspuit of worst. Buis vol agar, monsters worden tegen een oppervlak gedrukt en vervolgens in een Petri-plaat gesneden voor incubatie.

3. Excisie methode: Er wordt een plug met een bekend oppervlak uit het voedsel gehaald en vervolgens wordt 1-3 mm van het oppervlak genomen, gehomogeniseerd en geplateerd om het totale aantal te bepalen. Veel gebruikt in hele stukken vlees.

1. Blender – wordt nu niet zo veel gebruikt (zie redenen hieronder)

2. Colwell maag is de methode van keuze.

Voedsel wordt in een steriele plastic zak met verdunningsmiddel geplaatst en vervolgens in de machine gestoken. De maag heeft twee peddels die het voedsel krachtig verstoren en een mooie homogene vloeistof geven voor het nemen van monsters.

Voordelen ten opzichte van blenders zijn onder meer::

1. Geen schoonmaak omdat het eten in een zak zit

2. Geen warmteontwikkeling die Mo verwondt (betere overleving in het monster)

3. Homogenaten kunnen indien nodig in de zakken worden ingevroren voor verder gebruik

C. METHODEN OM TOTALE MICROBILE AANTALLEN TE BEPALEN

Nadat het monster is voorbereid, zijn er verschillende methoden beschikbaar om het totale aantal cellen in het voedsel te bepalen. Veel van deze methoden maken het ook mogelijk om belangrijke groepen bacteriën, zoals coliformen, te tellen. Met een paar kunt u het aantal microben van een specifiek geslacht tellen, zoals: Salmonella.

1. Standaard plaatgetal (SPC) Veruit de meest gebruikte methode om het aantal levensvatbare kolonievormende eenheden (CFU) in een voedingsmiddel te bepalen. Gebruik een spreid- of gietplaat (psychrotrofen overleven mogelijk niet zo goed in gietplaten) die een gehomogeniseerd voedselmonster bevat. De incubatie is aëroob bij 35 o C gedurende 48-2 uur.

APC's 8211aërobe plaatgetal –-cellen verspreiden zich over het agar-oppervlak en worden aeroob geïncubeerd.

2. AOAC (Assoc. of Official Analytical Chemists) goedgekeurd voor veel voedingsmiddelen

1. Resultaten zijn minimaal 16-18 uur niet beschikbaar (vaak veel langer)

2. Tellingen in een voedingsmiddel worden beïnvloed door verschillende factoren, waaronder:

A. Bemonsteringsmethode en de verdeling van MO in het voedsel

B. Aard van de voedselflora (krijgt meestal mesofiele aeroben en fac. aeroben)

NS. Intrinsieke parameters van het groeimedium weerspiegelen de MO die wordt gedetecteerd

e. Incubatietijd en temperatuur (extrinsieke parameters)

F. Microbieel antagonisme tussen soorten op het voedsel

2. Spiraalvormige platenteller – Een geautomatiseerde versie van SPC is de spiral plater, een apparaat dat een continu afnemend volume vloeistof verdeelt over een enkele roterende agarplaat (de afgiftearm beweegt als een naald op een draaitafel, alleen achteruit). De agar wordt vervolgens geïncubeerd en er worden tellingen gedaan.

-Het kan effectief een concentratiebereik van 10 5 op één plaat leveren, maar voor de telling is een speciaal telrooster vereist.

1. Eenvoudig uit te voeren (weinig training vereist)

2. Er worden minder materialen gebruikt (agarplaten, verdunningsblanco's, pipetten)

3. 3-4X meer monsters kunnen per uur worden uitgevoerd;

4. Spiraalbeplating komt goed overeen met SPC-waarden en is een AOAC-methode.

1. Voedseldeeltjes kunnen de afgiftearm verstoppen - 'Meer geschikt voor vloeistoffen zoals melk'

Twee plastic folies die aan één kant bij elkaar worden gehouden en als een sandwich bedekt zijn met

ingrediënten van kweekmedia, tetrazoliumkleurstof (een reducerende kleurstof) en een water

oplosbaar geleermiddel. 1 ml monster in verdunningsmiddel wordt tussen de films geplaatst en voorzichtig verspreid door op de 2 zijden van de film te drukken. Na incubatie vermindert celgroei de kleurstof en geeft rode kolonies.

1. niet-selectieve en selectieve media zijn beschikbaar in de films. Er zijn films beschikbaar voor het uitvoeren van totale plaattellingen van bacteriën of schimmels, coliformtellingen en specifieke tests voor hemorragische E coli 0157:H7

2. het product heeft AOAC-goedkeuring;

3. lange tijd bewaren, geen autoclaaf nodig;

2. moeilijk te lezen zonder training

4. Meest waarschijnlijke getallen : Een methode gebaseerd op statistische waarschijnlijkheid. Voedselmonsters worden bereid zoals SPC. Er worden drie seriële verdunningen bereid en vervolgens overgebracht naar 9 of 15 buizen (methode met 3 of 5 buizen). Vervolgens worden de aantallen organismen/g geschat met behulp van standaard MPN-tabellen.

2. resultaten van het ene laboratorium zijn waarschijnlijker dan SPC om overeen te komen met die van een ander laboratorium

3. specifieke groepen organismen (bijv. coliformen - dit is de voorkeursmethode) kunnen worden geteld met behulp van verschillende selectieve media

4. AOAC voor coliformen, S. aureus & B. cereus (vele anderen) in verschillende voedingsmiddelen

1. veel buizen nodig (intensief opruimen)

2. gebrek aan precisie, over het algemeen hoger dan SPC-resultaten

1. Zeer nuttig voor microscopisch onderzoek van watervoorraden (bijv. tellingen van coliformen), aangezien de meeste voedingsmiddelen de filters zullen verstoppen. Filters met poriën van 0,45 m laten water door maar vangen bacteriën op.

2. Filters zijn vooral handig voor monsters met een laag aantal bacteriën, omdat er grote hoeveelheden vloeistof kunnen worden doorgelaten.

3. Polycarbonaatfilters zijn beter dan de cellulosefilters omdat bacteriën efficiënter op het filteroppervlak worden opgevangen.

4. Een bepaald volume vloeistof wordt door het filter geleid:

A. het membraan wordt op een agarplaat geplaatst en geïncubeerd

B. Directe microscopische telling (DMC) kan op het filter worden gemaakt

DMC op filters is vereenvoudigd door het gebruik van fluorescerende kleurstoffen die zich binden aan bacteriën.

1. Riep de Directe epifluorescerende filtertechniek (DEFT), deze methode maakt gebruik van kleurstoffen en fluorescentiemicroscopie om bacteriën op een filter snel op te sommen.

2. Deze procedure omvat een voorfiltratiestap om grote voedseldeeltjes te verwijderen (-indien nodig een filter van 5 m gebruikt) en vervolgens wordt het filtraat behandeld met een detergens en een protease om somatische cellen af ​​te breken die de kleine 0,6 m zullen verstoppen polycarbonaat filter hierna gebruikt.

3. Het filter wordt gekleurd met acridine-oranje, gedroogd en vervolgens geteld met epifluorescentiemicroscopie.

4. Resultaten zijn beschikbaar in minder dan 30 minuten.

2. morph kan worden bepaald

3. herhaalbaarheid is beter dan SPC

4. vast voedsel kan worden onderzocht met behulp van de voorfiltratiestap

2. kan leven niet onderscheiden van dode cellen

3. voedseldelen lijken soms op cellen

4. cellen zijn meestal niet gelijkmatig verdeeld

5. verschillende MO kleuren niet gelijk

Hydrofobe rastermembraanfilters (HGMF)

1. Een speciaal filter dat 1.600 wasroosters bevat die de groei van kolonies beperken tot enkelvoudige roosters.

2. 10 tot 9 x 104 cellen kunnen worden geteld op een enkel filter met behulp van een statistische procedure voor de meeste waarschijnlijke getallen.

3. Gehomogeniseerd voedsel wordt door het filter geleid en vervolgens op een agarplaat geplaatst en een nacht geïncubeerd.

4. De kolonies worden geteld en vervolgens wordt het MPN berekend.

1. kan slechts 10 CFU/g . detecteren

2. kan totale CFU of specifieke groepen opsommen (coliformen, schimmels, pseudomonaden, salmonellae)

3. AOAC-goedkeuring voor totale coliformen, fecale coliformen en salmonella's

6. Kleurstofvermindering : Supernatanten van voedsel worden toegevoegd aan standaardoplossingen van methyleenblauw of resazurin:

A. Blauw --> Wit voor vermindering van methyleenblauw

B. Leisteenblauw --> roze of wit voor resazurin

De tijd die nodig is voor het verminderen van de kleurstof is omgekeerd evenredig met het totale aantal micro-organismen.

Techniek leent zich voor automatisering en heeft een lange geschiedenis van gebruik in zuivelproducten.

Een geautomatiseerde colorimeter ontwikkeld die AOAC-goedkeuring heeft voor het bepalen van totaaltellingen en coliformen.

1. eenvoudig, snel en goedkoop

2. alleen levensvatbare cellen verminderen kleurstof

1. niet alle MO verminderen kleurstof even goed

2. Sommige voedingsmiddelen, zoals vlees, bevatten een hoog gehalte aan natuurlijke reductiemiddelen die de resultaten vertroebelen. Het is aangetoond dat het gebruik van een maagsapje in plaats van een blender om vlees te homogeniseren dit probleem vermindert. Blijkbaar geeft de maag niet zoveel NADH of andere reductiemiddelen uit het weefsel af.

7. Impedantie: Impedantie is een meting op basis van de weerstand in een elektrisch circuit tegen de stroom van wisselstroom. Micro-organismen metaboliseren substraten met een lage geleidbaarheid tot producten met een hogere geleidbaarheid. Dientengevolge neemt de weerstand af met toenemende celaantallen. Met de juiste instrumenten kan de verandering in impedantie worden gevolgd en gebruikt om slechts 10 tot 100 cellen in een monster binnen ongeveer 6 uur te detecteren (impedantiedetectietijd of IDT). De techniek is sneller dan SPC en geeft resultaten die binnen 90-95% overeenkomen met de vorige techniek, maar is niet AOAC-goedgekeurd.

Speciale zorg metabolisch beschadigde cellen :

1. Verwerkingsomstandigheden omvatten vaak behandelingen zoals milde verwarmings- of afkoelingsstappen (en vele andere) die micro-organismen verwonden maar niet doden.

2. Metabolisch beschadigde cellen (MI) groeien mogelijk niet goed op agar-agar en geven u dus de indruk dat uw verwerkingsstap meer MO doodt dan het in werkelijkheid doet en dat het voedsel minder MO bevat dan het in werkelijkheid doet (aangezien deze cellen zal uiteindelijk herstellen en groeien in het voedsel als de omstandigheden gunstig zijn).

3. Als u werkt voor een bedrijf dat een voedselproces gebruikt waar mogelijk MI-cellen aanwezig zijn, dan is het handig om een ​​herstelstap voor MI-cellen op te nemen in uw microbiële testprocedure.

4. Over het algemeen rich media, soms aangevuld met pyruvaat of katalase, begunstigen het herstel van MI-cellen.

Pyruvaat en katalase breken peroxidasen af ​​en men denkt dat MI-cellen niet in staat zijn deze giftige zuurstofderivaten af ​​te breken.

Techniek om MI-cellen op te sommen :

1. plaat voedselmonsters op normale (minimale en rijke media)

2. voeg een extra dag incubatietijd toe

3. vergelijking tussen media (platen) – Rich media zullen MI en niet-verwonde cellen omvatten, minimaal zal alleen niet-verwonde cellen bevatten. Dit geeft u een idee van hoe effectief uw verwerkingsstap is bij het doden van MO.

NS. Moleculaire methoden om bacteriën of metabolieten te detecteren:

1. Behalve voor die toepassingen waarbij coliform of Salmonella is betrokken opsomming, zijn de methoden die we tot nu toe hebben onderzocht voornamelijk bedoeld om de houdbaarheid van producten te voorspellen en bederf te voorkomen.

2. De volgende groep testprocedures is in plaats daarvan bedoeld om specifieke geslachten of soorten door voedsel overgedragen pathogenen (of hun metabolieten) te detecteren.

3. Helaas maken veel van deze tests gebruik van dure reagentia en vanwege de kosten is het gebruik ervan over het algemeen (maar niet altijd) meer diagnostisch dan preventief (d.w.z. alleen gebruikt na een uitbraak).

1. Oligonucleotide DNA-sondes - Deze test is gebaseerd op DNA of DNA-RNA complementaire basenparen of hybridisatie.

- Ga door een hybridisatieprocedure, inclusief koloniehyb (kan oplopen tot 69 filter met 48 CFU per filter in één Rxn), dot-blots of blots van restrictiedigesten.

-kan radioactieve of niet-isotopische labels op sondes gebruiken. Reacties kunnen tussen de 10 uur en 2 dagen duren.

Deze techniek vereist dat de sequentie van het doelnucleïnezuur (vaak een gen voor toxineproductie of een soortspecifieke 16S rRNA-sequentie) wordt bepaald en uniek is voor de gezochte organismen. Zoals we eerder in de lezingen over taxonomie hebben besproken, bevat 16S-rRNA zowel algemeen geconserveerde als soort- (en soms ondersoorten)-specifieke regio's. Sondes naar de soortspecifieke regio's worden gebruikt om bepaalde bacteriën zoals Salmonella te detecteren. Een voordeel van het richten op het 16S-rRNA versus een DNA-sequentie in het chromosoom is dat er meerdere kopieën van het 16S-rRNA per cel zijn. Hetzelfde voordeel geldt voor genen die zich op multicopy-plasmiden bevinden. Genprobes kunnen gebaseerd zijn op de DNA-sequentie van bepaalde toxines zoals: Clostridium perfringens of stafylokokken enterotoxinen. Ten minste één test voor Salmonella heeft AOAC-goedkeuring.

2. Polymerasekettingreactie (PCR-DNA-amplificatie). Deze techniek is nuttiger dan DNA-sondering wanneer kleine aantallen van een bepaalde microbe aanwezig zijn. Het kan een enkele kopie van elke DNA-sequentie 107 keer binnen een paar uur amplificeren. Geamplificeerd DNA kan vervolgens worden gedetecteerd door agarosegelelektroforese of hybridisatie.

-PCR vereist primers op basis van de bekende nucleïnezuursequentie van het amplificatiedoelwit.

PCR is gebruikt om 1-5 CFU van E. coli te detecteren in 100 ml water, bruikbaar voor elk organisme waarvan een unieke nucleïnezuursequentie bekend is, ook voor diagnose door amplificatie van 16s-rRNA (ASM-handout - nieuwe vergezichten voor bacteriologen).

-Heel krachtig hulpmiddel met vele, vele toepassingen de nieuwste klinische handleiding voor diagnostische microbiologie is bijna volledig gebaseerd op PCR-assays.

3. Enzymgebonden immunosorbantassay (ELISA). Een andere zeer krachtige techniek die gebruikmaakt van mono- of polyklonale antilichamen om specifieke antigenen in een monster te detecteren.

Commerciële ELISA-kits zijn beschikbaar voor een verscheidenheid aan toepassingen (bijv. zwangerschapstests voor thuis), waaronder de detectie van verschillende microben, waaronder Salmonella, S. aureus en zijn enterotoxinen, schimmels en mycotoxinen, botulinale toxinen en E. coli stammen en toxines.

4. Immunoprecipitatie (Immunodiffusie) - Een andere immunologische techniek die vaak wordt gebruikt voor toxine-identificatie. Verschillende variaties, maar het basisprincipe is een reactie tussen antigeen (toxine) en antilichaam dat een neerslag vormt in een agargel.

Immunodiffusiemethoden kunnen slechts 0,1-0,01 g toxine detecteren. Incubatietijden nemen toe met kleinere hoeveelheden antigeen (1-6 d bereik).

Samengevat, als het gaat om het selecteren van een microbiële testprocedure, onthoud dan het volgende: SNEL, NAUWKEURIG, GOEDKOOP (kies er twee)


Bekijk de video: Why does your voice change as you get older? - Shaylin A. Schundler (September 2022).


Opmerkingen:

  1. Fem

    Het einde is vanaf het begin voorspelbaar

  2. Lachie

    Bravo, woorden ... wat een ander idee

  3. Chogan

    Het is onvergelijkbaar))))))))))



Schrijf een bericht