Informatie

Aanzicht en vlak/doorsnede van neurale buis

Aanzicht en vlak/doorsnede van neurale buis


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ik heb een vraag over de volgende afbeelding:

In mijn boek staat dat dit een dorsaal aanzicht is dat de vorming van de neurale buis laat zien. Is dit echter geen caudaal aanzicht van een dwarsdoorsnede? Een dorsaal en ventraal aanzicht zou niet van toepassing zijn op een dwarsdoorsnede toch?


Het lijkt me een dorsaal aanzicht, zoals je boek zegt.

Het is helemaal geen sectie, dit zijn embryonale structuren die van buitenaf zichtbaar zijn.

Misschien wordt u misleid door de oriëntatie van de neuraxis die verschilt tussen organismen? Het hoofd zal zich ontwikkelen bij de voorste neuroporie; de wervelkolom zal zich in het midden ontwikkelen. Je kijkt naar wat de achterkant zal zijn.

Hier is nog een weergave van Gray's (gedownload van Wikipedia op https://en.wikipedia.org/wiki/Somite#/media/File:Gray20.png">


Genetica en ontwikkeling van neurale buisdefecten †

Aangeboren afwijkingen van de sluiting van de neurale buis (neurale buisdefecten NTD's) behoren tot de meest voorkomende en meest ernstige aandoeningen van de foetus en pasgeborene. Verstoring van een van de opeenvolgende gebeurtenissen van embryonale neurulatie produceert NTD's, waarbij het fenotype (bijv. anencefalie, spina bifida) varieert afhankelijk van het gebied van de neurale buis dat open blijft. Hoewel bekend is dat mutatie van > 200 genen NTD's bij muizen veroorzaakt, suggereert het patroon van voorkomen bij mensen een multifactoriële polygene of oligogene etiologie. Dit benadrukt het belang van gen-gen- en gen-omgevingsinteracties bij het ontstaan ​​van deze defecten. Een aantal celbiologische functies zijn essentieel voor het sluiten van neurale buis, met defecten van het cytoskelet, celcyclus en moleculaire regulatie van cellevensvatbaarheid prominent onder de muis NTD-mutanten. Veel transcriptionele regulatoren en eiwitten die de chromatinestructuur beïnvloeden, zijn ook vereist voor het sluiten van neurale buisjes, hoewel de stroomafwaartse moleculaire routes die door deze eiwitten worden gereguleerd, onbekend zijn. Er zijn enkele belangrijke signaalroutes voor NTD's geïdentificeerd: overactivering van sonische hedgehog-signalering en functieverlies in de vlakke celpolariteit (niet-canonieke Wnt) route zijn krachtige oorzaken van NTD, met vereisten ook voor retinoïde- en inositolsignalering. Foliumzuursuppletie is een effectieve methode voor primaire preventie van een deel van NTD's bij zowel mensen als muizen, hoewel het embryonale mechanisme van folaatwerking onduidelijk blijft. Foliumzuurresistente gevallen kunnen worden voorkomen door inositolsuppletie bij muizen, waardoor de mogelijkheid bestaat dat dit in de toekomst zou kunnen leiden tot een aanvullende preventieve strategie voor menselijke NTD's. Copyright © 2009 Pathologische Vereniging van Groot-Brittannië en Ierland. Uitgegeven door John Wiley & Sons, Ltd.


Neurale buisdefecten en foliumzuur: zaak verre van gesloten

Neurale buissluiting vindt plaats tijdens vroege embryogenese en vereist interacties tussen genetische en omgevingsfactoren. Het niet sluiten van de neurale buis is een veel voorkomende aangeboren afwijking die leidt tot morbiditeit en mortaliteit. Een belangrijke klinische prestatie is het gebruik van periconceptionele foliumzuursupplementen, die ongeveer 50-75% van de gevallen van neurale buisdefecten voorkomt. Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de gunstige effecten van foliumzuur is echter verre van duidelijk. Biochemische, genetische en epidemiologische waarnemingen hebben geleid tot de ontwikkeling van de methyleringshypothese, die suggereert dat foliumzuur neurale buisdefecten voorkomt door cellulaire methyleringsreacties te stimuleren. Het onderzoeken van de methyleringshypothese zou ons kunnen leiden naar aanvullende strategieën om neurale buisdefecten te voorkomen.

Belangenconflict verklaring

Concurrerende belangenverklaring

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Figuren

Figuur 1. Neurale buissluiting in de…

Figuur 1. Neurale buissluiting in de zich ontwikkelende muis

Figuur 2. Structuren van folaten

Figuur 2. Structuren van folaten

De bioactieve vorm van folaat is 5,6,7,8-tetrahydrofolaat. Hoewel foliumzuur…

Figuur 3. Vereenvoudigd foliumzuurmetabolisme

Figuur 3. Vereenvoudigd foliumzuurmetabolisme

In de bloedsomloop is folaat voornamelijk aanwezig als 5-methyltetrahydrofolaat (5-MeTHF),…

Figuur 4. De drie MTHFR genotypen beïnvloeden…

Figuur 4. De drie MTHFR genotypen beïnvloeden methylatie en DNA-synthese in verschillende mate

Figuur 5. Het foliumzuurmetabolisme wordt beïnvloed door…

Figuur 5. Het foliumzuurmetabolisme wordt beïnvloed door omgevings- en genetische factoren


Spreker Bio

Philip Keller

Dr. Philipp Keller behaalde zijn Master of Science in de natuurkunde aan de Universiteit van Karlsruhe en aan de Universiteit van Heidelberg in 2005. Hij vervolgde zijn afstudeerstudie aan het European Molecular Biology Laboratory (EMBL). Na een korte postdoc bij EMBL trad hij in 2010 toe tot de faculteit van de Janelia Research Campus van de HHMI. Zijn laboratorium gebruikt '8230 Continue Reading


Referenties

Schoenwolf, G. C. & Smith, J. L. Mechanismen van neurulatie: traditioneel gezichtspunt en recente ontwikkelingen. Ontwikkeling 109, 243–270 (1990).

Harding, B.N. & Copp, A.J. in Neuropathologie van Greenfield 357-483 (Arnold, Londen, 2002).

Wald, N. et al. Preventie van neurale buisdefecten: resultaten van de vitaminestudie van de Medical Research Council. Lancet 338, 131–137 (1991). Dit is de definitieve gerandomiseerde klinische studie naar vitaminesuppletie, waaruit bleek dat foliumzuur herhaling van ∼ 70% van de neurale buisdefecten kan voorkomen.

Colas, J.F. & Schoenwolf, G.C. Op weg naar een cellulair en moleculair begrip van neurulatie. ontwikkelaar Din. 221, 117–145 (2001).

Knecht, A. K. & Bronner-Fraser, M. Inductie van de neurale lijst: een multigenproces. Natuur Rev. Genet. 3, 453–461 (2002).

Jessell, T. M. Neuronale specificatie in het ruggenmerg: inductieve signalen en transcriptionele codes. Natuur Rev. Genet. 1, 20–29 (2000).

Juriloff, D. M. & Harris, M. J. Muismodellen voor sluitingsdefecten van neurale buizen. Brommen. Mol. Genet. 9, 993–1000 (2000).

Copp, A. J. & Brook, F. A. Komt lumbosacrale spina bifida voor door falen van neurale vouwing of door gebrekkige kanalisatie? J. Med. Genet. 26, 160–166 (1989).

Schoenwolf, G. C. Histologische en ultrastructurele studies van secundaire neurulatie van muizenembryo's. Ben. J. Anat. 169, 361–374 (1984).

O'Rahilly, R. & Müller, F. De twee plaatsen van fusie van de neurale plooien en de twee neuroporiën in het menselijke embryo. Teratologie 65, 162–170 (2002).

Juriloff, D.M., Harris, M.J., Tom, C. & MacDonald, K.B. Normale muizenstammen verschillen in de plaats van initiatie van sluiting van de craniale neurale buis. Teratologie 44, 225–233 (1991).

Fleming, A. & Copp, A. J. Een genetische risicofactor voor neurale buisdefecten bij muizen: het definiëren van de embryonale basis. Brommen. Mol. Genet. 9, 575–581 (2000).

Nakatsu, T., Uwabe, C. & Shiota, K. Neurale buissluiting bij mensen begint op meerdere locaties: bewijs van menselijke embryo's en implicaties voor de pathogenese van neurale buisdefecten. Anat. embryo. 201, 455–466 (2000).

Stiefel, D., Shibata, T., Meuli, M., Duffy, P. & Copp, A. J. Tethering van het ruggenmerg bij muisfoetussen en pasgeborenen met spina bifida. J. Neurochirurg. (in de pers).

Jacobson, A.G. & Gordon, R. Veranderingen in de vorm van het zich ontwikkelende zenuwstelsel van gewervelde dieren, experimenteel, wiskundig en door computersimulatie geanalyseerd. J. Exp. Zool. 197, 191–246 (1976).

Schoenwolf, G. C. & Alvarez, I. S. Rollen van herschikking en deling van neuro-epitheelcellen bij het vormen van de neurale plaat van vogels. Ontwikkeling 106, 427–439 (1989).

Keller, R. et al. Mechanismen van convergentie en uitbreiding door celintercalatie. Fil. Trans. Koninklijke Soc. Londen. B 355, 897–922 (2000).

Curtin, J.A. et al. Mutatie van Celsr1 verstoort de vlakke polariteit van haarcellen in het binnenoor en veroorzaakt ernstige neurale buisdefecten bij de muis. Curr. Biol. 13, 1–20 (2003).

Kibar, Z. et al. Ltap, een zoogdierhomoloog van Drosophila scheelzien/Van Gogh, is veranderd in de neurale buismutant van de muis lus-staart. Natuur Genet. 28, 251–255 (2001).

Murdoch, J.N., Doudney, K., Paternotte, C., Copp, A.J. & Stanier, P. Ernstige neurale buisdefecten in de lus-staart muis resultaat van mutatie van Lpp1, een nieuw gen dat betrokken is bij de specificatie van vloerplaten. Brommen. Mol. Genet. 10, 2593–2601 (2001).

Murdoch, J.N. et al. Verstoring van krabbel (Scrb1) veroorzaakt ernstige neurale buisdefecten in de cirkelstaart muis. Brommen. Mol. Genet. 12, 87–98 (2003).

Montcouquioi, M. et al. Identificatie van Vangl2 en Scrb1 als genen voor vlakke polariteit bij zoogdieren. Natuur 423, 173–177 (2003).

Hamblet, N.S. et al. Disheveled 2 is essentieel voor de ontwikkeling van het hartuitstroomkanaal, de segmentatie van de somiet en het sluiten van de neurale buis. Ontwikkeling 129, 5827–5838 (2002).

Murdoch, J.N. et al. cirkelstaart, een nieuwe muismutant met ernstige neurale buisdefecten: chromosomale lokalisatie en interactie met de lus-staart mutatie. genomica 78, 55–63 (2001).

Park, M. & Moon, R. T. Het gen voor vlakke celpolariteit stbm regelt het celgedrag en het lot van de cellen in embryo's van gewervelde dieren. Natuur Cel Biol. 4, 20–25 (2001). Dit was een van de eerste studies die een rol liet zien voor de gewervelde homoloog van Drosophila strabismus in convergente extensie tijdens gastrulatie en neurulatie.

Darken, R.S. et al. Het gen voor vlakke polariteit scheelzien regelt convergente extensiebewegingen in Xenopus. EMBO J. 21, 976–985 (2002).

Wallingford, J.B. & Harland, R.M. Xenopus Slordige signalering reguleert zowel neurale als mesodermale convergente extensie: parallelle krachten die de lichaamsas verlengen. Ontwikkeling 128, 2581–2592 (2001).

Wallingford, J.B. & Harland, R.M. Neurale buissluiting vereist Disheveled-afhankelijke convergente verlenging van de middellijn. Ontwikkeling 129, 5815–5825 (2002).

Jessen, J.R. et al. Zebravistrilobiet identificeert nieuwe rollen voor scheelzien in gastrulatie en neuronale bewegingen. Natuur Cel Biol. 4, 610–615 (2002).

Marlow, F., Topczewski, J., Sepich, D. & Solnica-Krezel, L. Zebrafish Rho-kinase 2 werkt stroomafwaarts van Wnt11 om celpolariteit en effectieve convergentie- en extensiebewegingen te mediëren. Curr. Biol. 12, 876–884 (2002).

Greene, N.D.E., Gerrelli, D., Van Straaten, H.W.M. & Copp, A.J. Afwijkingen van vloerplaat-, notochord- en somietdifferentiatie in de lus-staart (Lp) muis: een model van ernstige neurale buisdefecten. Mech. ontwikkelaar 73, 59–72 (1998).

Shum, A.S.W. & Copp, A.J. Regionale verschillen in morfogenese van het neuroepitheel suggereren meerdere mechanismen van spinale neurulatie bij de muis. Anat. embryo. 194, 65–73 (1996).

Ybot-Gonzalez, P., Cogram, P., Gerrelli, D. & Copp, A.J. Sonic hedgehog en de moleculaire regulatie van neurale buissluiting. Ontwikkeling 129, 2507–2517 (2002). Deze studie leverde het eerste bewijs op van een rol voor sonische hedgehog-signalering bij het reguleren van het patroon van neurale plaatbuiging tijdens spinale neurulatie van de muis.

Echelard, Y. et al. Sonic hedgehog, een lid van een familie van vermeende signaalmoleculen, is betrokken bij de regulatie van de polariteit van het CZS. Cel 75, 1417–1430 (1993).

Hui, C. & Joyner, A.L. Een muismodel van het Greig cephalopolysyndactyly-syndroom: de extra tenen J mutatie bevat een intragene deletie van de Gli3 gen. Natuur Genet. 3, 241–246 (1993).

Ding, Q. et al. Verminderde Sonic hedgehog-signalering en gebrek aan differentiatie van vloerplaten in Gli2 gemuteerde muizen. Ontwikkeling 125, 2533–2543 (1998).

Matise, M.P., Epstein, D.J., Park, H.L., Platt, K.A. & Joyner, A.L. Gli2 is vereist voor inductie van vloerplaat en aangrenzende cellen, maar niet voor de meeste ventrale neuronen in het centrale zenuwstelsel van de muis. Ontwikkeling 125, 2759–2770 (1998).

Goodrich, L.V., Milenkovic, L., Higgins, K.M. & Scott, M.P. Veranderde het lot van neurale cellen en medulloblastoom in gepatchte mutanten van muizen. Wetenschap 277, 1109–1113 (1997). Dit artikel geeft een beschrijving van het knock-out-fenotype van de gepatched1 gen, waaronder het vinden van ernstige neurale buisdefecten bij homozygoten en de ontwikkeling van medulloblastomen, belangrijke hersentumoren van de kindertijd, bij heterozygoten.

Huang, Y., Roelink, H. & McKnight, G. S. Eiwitkinase A-deficiëntie veroorzaakt axiaal gelokaliseerde neurale buisdefecten bij muizen. J. Biol. Chem. 277, 19889–19896 (2002).

Günther, T., Struwe, M., Aguzzi, A. & Schughart, K. open brein, een nieuwe muismutant met ernstige neurale buisdefecten, vertoont veranderde genexpressiepatronen in het zich ontwikkelende ruggenmerg. Ontwikkeling 120, 3119–3130 (1994).

Nagai, T. et al. Zic2 regelt de kinetiek van neurulatie. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 97, 1618–1623 (2000).

Eggenschwiler, J.T., Espinoza, E. & Anderson, K.V. Rab23 is een essentiële negatieve regulator van de Sonic hedgehog-signaleringsroute van muizen. Natuur 412, 194–198 (2001).

Nakata, K., Nagai, T., Aruga, J. & Mikoshiba, K. Xenopus Zic-familie en zijn rol in de ontwikkeling van neurale en neurale lijst. Mech. ontwikkelaar 75, 43–51 (1998).

Eggenschwiler, J.T. & Anderson, K.V. Dorsale en laterale lotgevallen in de neurale buis van de muis vereisen de cel-autonome activiteit van de open brein gen. ontwikkelaar Biol. 227, 648–660 (2000).

Smith, J.L. & Schoenwolf, G.C. De rol van de celcyclus bij het reguleren van de vorm van neuro-epitheelcellen tijdens het buigen van de neurale plaat van het kuiken. Celweefselonderzoek. 252, 491–500 (1988). Dit artikel beschrijft celcyclusanalyse in embryo's in het neurulatiestadium van kippen die het eerste bewijs leverden voor een heterogeniteit in de celcycluskinetiek van verschillende regio's van de neurale plaat. Een verlenging van de celcyclus in cellen van het mediane scharnierpunt werd beschreven.

Karfunkel, P., Hoffman, M., Phillips, M. & Black, J. Veranderingen in celadhesie in neurulatie en vorming van optische bekers. zoon 6, 23–31 (1978).

Geelen, J.A.G. & Langman, J. Ultrastructurele observaties over sluiting van de neurale buis in de muis. Anat. embryo. 156, 73–88 (1979).

Moran, D. & Rice, R. W. Een ultrastructureel onderzoek van de rol van celmembraanoppervlaktecoatingsmateriaal tijdens neurulatie. J. Cell Biol. 64, 172–181 (1975).

Sadler, T. W. Verdeling van oppervlaktelaagmateriaal op het samensmelten van neurale plooien van muizenembryo's tijdens neurulatie. Anat. Aanbeveling 191, 345–350 (1978).

O'Shea, K. S. & Kaufman, M. H. Phospholipase C induceerde neurale buisdefecten in het muizenembryo. Ervaringen 36, 1217–1219 (1980).

Holmberg, J., Clarke, D.L. & Frisén, J. Regulatie van afstoting versus adhesie door verschillende splitsingsvormen van een Eph-receptor. Natuur 408, 203–206 (2000). In deze studie laten knock-out fenotypes van ephrin-A5 en EphA7 in de muis een rol zien voor dit signaleringssysteem bij celadhesie tijdens neurulatie, in tegenstelling tot de traditionele rol van deze moleculen bij axonafstoting.

Rutishauser, U. & Jessell, T. M. Celadhesiemoleculen in neurale ontwikkeling van gewervelde dieren. Fysiol. ds. 68, 819–857 (1988).

Detrick, R.J., Dickey, D. & Kintner, C.R. De effecten van N-cadherine-misexpressie op morfogenese in Xenopus embryo's. neuron 4, 493–506 (1990).

Fujimori, T., Miyatani, S. & Takeichi, M. Ectopische expressie van N-cadherine verstoort histogenese in Xenopus embryo's. Ontwikkeling 110, 97–104 (1990).

Levine, E., Lee, C.H., Kintner, C. & Gumbiner, B. M. Selectieve verstoring van de E-cadherine-functie in het begin Xenopus embryo's door een dominante negatieve mutant. Ontwikkeling 120, 901–909 (1994).

Cremer, H. et al. Inactivering van de N-CAM gen in muizen resulteert in verkleining van de bulbus olfactorius en tekorten in ruimtelijk leren. Natuur 367, 455–459 (1994).

Radice, G.L. et al. Ontwikkelingsdefecten in muizenembryo's zonder N-cadherine. ontwikkelaar Biol. 181, 64–78 (1997).

Copp, A.J., Brook, F.A., Estibeiro, J.P., Shum, A.S.W. & Cockroft, D.L. De embryonale ontwikkeling van neurale buisdefecten bij zoogdieren. prog. neurobiol. 35, 363–403 (1990).

Morriss, G. M. & Solursh, M. Regionale verschillen in mesenchymale celmorfologie en glycosaminoglycanen in rattenembryo's in de vroege neurale fase. J. Embryol. Exp. Morfol. 46, 37–52 (1978).

Morriss-Kay, G. M. Groei en ontwikkeling van patroon in het craniale neurale epitheel van rattenembryo's tijdens neurulatie. J. Embryol. Exp. Morfol. 65 (Suppl.), 225-241 (1981).

Van Straaten, H.W.M., Hekking, J.W.M., Consten, C. & Copp, A.J. Intrinsieke en extrinsieke factoren in het mechanisme van neurulatie: effect van kromming van de lichaamsas op sluiting van de achterste neuroporie. Ontwikkeling 117, 1163–1172 (1993).

Chen, Z.-F. & Behringer, R.R. twist is vereist in het hoofdmesenchym voor craniale neurale buismorfogenese. Genen Dev. 9, 686–699 (1995).

Zhao, Q., Behringer, R.R. & De Crombrugghe, B. Prenatale foliumzuurbehandeling onderdrukt acrania en meroanencefalie bij muizen die gemuteerd zijn voor de Winkelwagen1 homeobox-gen. Natuur Genet. 13, 275–283 (1996). Dit artikel beschrijft de eerste muisknock-out met een fenotype van neurale buisdefecten waarbij foliumzuur het neurulatiedefect kon voorkomen, wat een parallel met de menselijke situatie oplevert.

Morriss-Kay, G. M., Tuckett, F. & Solursh, M. De effecten van Streptomyces hyaluronidase op weefselorganisatie en celcyclustijd in rattenembryo's. J. Embryol. Exp. Morfol. 98, 59–70 (1986).

Hildebrand, J.D. & Soriano, P. Shroom, een PDZ-domein-bevattend actine-bindend eiwit, is vereist voor neurale buismorfogenese bij muizen. Cel 99, 485–497 (1999).

Xu, W.M., Baribault, H. & Adamson, E.D. Vinculin knock-out resulteert in hart- en hersenafwijkingen tijdens de embryonale ontwikkeling. Ontwikkeling 125, 327–337 (1998).

Stumpo, D.J., Bock, C.B., Tuttle, J.S. & Blackshear, P.J. MARCKS-deficiëntie bij muizen leidt tot abnormale hersenontwikkeling en perinatale sterfte. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 92, 944–948 (1995).

Brouns, M.R. et al. Het adhesiesignaleringsmolecuul p190 RhoGAP is vereist voor morfogenetische processen in neurale ontwikkeling. Ontwikkeling 127, 4891–4903 (2000).

Lanier, L.M. et al. Mena is nodig voor neurulatie en commissuurvorming. neuron 22, 313–325 (1999).

Koleske, A.J. et al. Essentiële rollen voor de Abl- en Arg-tyrosinekinasen bij neurulatie. neuron 21, 1259–1272 (1998).

Morriss-Kay, G. M. & Tuckett, F. De rol van microfilamenten bij craniale neurulatie bij rattenembryo's: effecten van kortdurende blootstelling aan cytochalasine D. J. Embryol. Exp. Morfol. 88, 333–348 (1985).

Ybot-Gonzalez, P. & Copp, A. J. Het buigen van de neurale plaat tijdens spinale neurulatie van de muis is onafhankelijk van actine-microfilamenten. ontwikkelaar Din. 215, 273–283 (1999).

Morriss-Kay, G. & Tan, S.-S. In kaart brengen van craniale neurale celmigratieroutes in zoogdierembryo's. Trends Genet. 3, 257–261 (1987).

Ewart, J.L. et al. Hart- en neurale buisdefecten bij transgene muizen die de tot overexpressie brengen Cx43 gap junction gen. Ontwikkeling 124, 1281–1292 (1997).

Morriss-Kay, G. M. & Tuckett, F. Immunohistochemische lokalisatie van chondroïtinesulfaat-proteoglycanen en de effecten van chondroitinase ABC in 9- tot 11-daagse rattenembryo's. Ontwikkeling 106, 787–798 (1989).

Erickson, C.A. & Weston, J.A. Een SEM-analyse van neurale migratie bij de muis. J. Embryol. Exp. Morfol. 74, 97–118 (1983).

Franz, T. Neurale buisdefecten zonder neurale lijstdefecten in vlekje muizen. Teratologie 46, 599–604 (1992).

Estibeiro, J.P., Brook, F.A. & Copp, A.J. Interactie tussen vlekje (Sp) en gekrulde staart (ct) muismutanten in de embryonale ontwikkeling van neurale buisdefecten. Ontwikkeling 119, 113–121 (1993).

Pani, L., Horal, M. & Loeken, M.R. Redding van neurale buisdefecten in Pax-3-deficiënte embryo's door p53-functieverlies: implicaties voor Pax-3-afhankelijke ontwikkeling en tumorigenese. Genen Dev. 16, 676–680 (2002).

Wilson, D. B. Proliferatie in de neurale buis van de vlekje (Sp) gemuteerde muis. J. Comp. neurol. 154, 249–256 (1974).

Morris, G. L. & O'Shea, K. S. Anomalieën van neuro-epitheliale celassociaties in de vlekje gemuteerd embryo. ontwikkelaar Hersenonderzoek. 9, 408–410 (1983).

Schluter, G.Ultrastructurele observaties van celnecrose tijdens de vorming van de neurale buis in muizenembryo's. Z. Anat. Entwickl. Gesch. 141, 251–264 (1973).

Lawson, A., Schoenwolf, G.C., Engeland, M.A., Addai, F.K. & Ahima, R.S. Geprogrammeerde celdood en de morfogenese van de dakplaat van de achterhersenen in het kippenembryo. Anat. embryo. 200, 509–519 (1999).

Harris, B.S. et al. Voorhersenen overgroei (mist): een nieuwe mutatie in de muis die de ontwikkeling van de neurale buis beïnvloedt. Teratologie 55, 231–240 (1997).

Kotch, L.E. & Sulik, K.K. Patronen van door ethanol geïnduceerde celdood in het zich ontwikkelende zenuwstelsel van neurale vouwtoestanden van muizen door de tijd van sluiting van de voorste neurale buis. Int. J. Dev. neurosci. 10, 273–279 (1992).

Jacobson, A.G. & Tam, P.P.L. Cephalic neurulatie in het muizenembryo geanalyseerd met SEM en morfometrie. Anat. Aanbeveling 203, 375–396 (1982).

Peeters, M.C.E., Shum, A.S.W., Hekking, J.W.M., Copp, A.J. & Van Straaten, H.W.M. Relatie tussen veranderde axiale kromming en neurale buissluiting in normaal en mutant (gekrulde staart) muisembryo's. Anat. embryo. 193, 123–130 (1996).

Weil, M., Jacobson, M.D. & Raff, M.C. Is geprogrammeerde celdood vereist voor sluiting van neurale buis. Curr. Biol. 7, 281–284 (1997). Dit is de enige experimentele studie die een rol laat zien voor geprogrammeerde celdood bij het sluiten van neurale buisjes. De apoptose-remmer Zvad-fmk bleek celdood in de neurale plaat te voorkomen en de sluiting van de neurale buis in kippenembryo's te remmen.

Oke, C. et al. Verstoring van de muis RBP-Jκ gen resulteert in vroege embryonale dood. Ontwikkeling 121, 3291–3301 (1995).

Ishibashi, M. et al. Gerichte verstoring van zoogdieren harig en Enhancer van gesplitste homoloog-1 (HES-1) leidt tot opregulatie van neurale helix-lus-helix-factoren, vroegtijdige neurogenese en ernstige neurale buisdefecten. Genen Dev. 9, 3136–3148 (1995).

Zhong, W.M. et al. Muis gevoelloos is een essentieel gen dat betrokken is bij corticale neurogenese. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 97, 6844–6849 (2000).

Hirata, H., Tomita, K., Bessho, Y. & Kageyama, R. Hes1 en Hes3 reguleren het onderhoud van de isthmische organisator en de ontwikkeling van het midden / achterhersenen. EMBO J. 20, 4454–4466 (2001).

Lardelli, M., Williams, R., Mitsiadis, T. & Lendahl, U. Expressie van het intracellulaire domein van Notch 3 in voorlopercellen van het centrale zenuwstelsel van muizen is dodelijk en leidt tot een verstoorde ontwikkeling van de neurale buis. Mech. ontwikkelaar 59, 177–190 (1996).

Honarpour, N., Gilbert, S.L., Lahn, B.T., Wang, X.D. & Herz, J. Apaf-1 deficiëntie en defecten in de sluiting van de neurale buis worden gevonden in: mist muizen. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 98, 9683–9687 (2001).

Wilson, D.B. & Center, E.M. De neurale celcyclus in de lus-staart (Lp) gemuteerde muis. J. Embryol. Exp. Morfol. 32, 697–705 (1974).

Wilson, D. B. Cellulaire proliferatie in de exencefale hersenen van het muizenembryo. Hersenonderzoek. 195, 139–148 (1980). Dit artikel beschrijft een celcyclusanalyse van de aanhoudend open neurale plooien in de hersenen van de lus-staart muis, die een verlengde celcyclus vertoonde, in plaats van overproliferatie, zoals vaak wordt aangenomen bij exencefalie.

Fleming, A. & Copp, A. J. Embryonaal folaatmetabolisme en neurale buisdefecten bij muizen. Wetenschap 280, 2107–2109 (1998).

Carter, M., Ulrich, S., Oofuji, Y., Williams, D.A. & Ross, M.E. kromme staart (CD) modelleert menselijke folaat-responsieve neurale buisdefecten. Brommen. Mol. Genet. 8, 2199–2204 (1999).

Martinez-Barbera, J.P. et al. Foliumzuur voorkomt exencefalie in geciteerd2 gebrekkige muizen. Brommen. Mol. Genet. 11, 283–293 (2002).

Chen, Z.T. et al. Muizen met een tekort aan methyleentetrahydrofolaatreductase vertonen hyperhomocysteïnemie en verminderde methyleringscapaciteit, met neuropathologie en afzetting van lipiden in de aorta. Brommen. Mol. Genet. 10, 433–443 (2001).

Fujinaga, M. & Baden, J.M. Methionine voorkomt door lachgas geïnduceerde teratogeniteit bij in kweek gekweekte rattenembryo's. anesthesiologie 81, 184–189 (1994).

Gu, L.Y., Wu, J.X., Qiu, L., Jennings, C.D. & Li, G.M. Betrokkenheid van DNA-mismatchreparatie bij door folaatdeficiëntie geïnduceerde apoptose. J. Nutr. Biochem. 13, 355–363 (2002).

Verkoper, M.J. in Neurale buisdefecten (Ciba Foundation Symposium 181) (eds Bock, G. & Marsh, J.) 161-173 (Wiley & Sons, Chichester, 1994).

Essien, F. B. & Wannberg, S. L. Methionine maar niet folinezuur of vitamine B12 verandert de frequentie van neurale buisdefecten in Axd gemuteerde muizen. J. Nutr. 123, 27–34 (1993).

Greene, N.D.E. & Copp, A.J. Inositol voorkomt folaatresistente neurale buisdefecten bij de muis. Natuur Med. 3, 60–66 (1997). Deze studie rapporteert een preventief effect van exogene inositoltherapie, zowel: in de baarmoeder en in gekweekte embryo's, op de ontwikkeling van spinale neurale buisdefecten in een folaatresistent genetisch muismodel.

Copp, A.J., Brook, F.A. & Roberts, H.J. Een celtype-specifieke afwijking van celproliferatie in mutant (gekrulde staart) muisembryo's die spinale neurale buisdefecten ontwikkelen. Ontwikkeling 104, 285–295 (1988).

Smith, J.L. & Schoenwolf, G.C. Neurulatie: bijna afgesloten. Trends Neurosci. 20, 510–517 (1997).

Imamoto, A. & Soriano, P. Verstoring van de csk gen, dat codeert voor een negatieve regulator van tyrosinekinasen uit de Src-familie, leidt tot neurale buisdefecten en embryonale letaliteit bij muizen. Cel 73, 1117–1124 (1993).

Copp, A. J. Dood voor de geboorte: aanwijzingen van gen-knockouts en mutaties in de muis. Trends Genet. 11, 87–93 (1995).

Golden, J.A. & Chernoff, G.F. Intermitterend patroon van neurale buissluiting in twee muizenstammen. Teratologie 47, 73–80 (1993). Dit was de eerste studie die aantoonde dat sluiting van de neurale buis begint op drie verschillende locaties in het muizenembryo, met een intermitterend patroon van daaropvolgende sluiting. Dit was in tegenspraak met de traditionele leerboekopvatting dat het sluiten van de neurale buis bestaat uit een eenvoudige 'ritssluiting' in beide richtingen vanaf een startpunt halverwege de lichaamsas.

Copp, A. J. & Bernfield, M. Etiologie en pathogenese van menselijke neurale buisdefecten: inzichten uit muismodellen. Curr. Opin. Kinderarts 6, 624–631 (1994).


Aanzicht en vlak/doorsnede van neurale buis - Biologie

Lab 5 - Sectionele anatomie van de menselijke voorhersenen

  1. Onderzoek platen door de menselijke voorhersenen
    • Leerdoel: herkennen van de belangrijkste kenmerken van de voorhersenen (en hersenstam) die met het blote oog zichtbaar zijn, met inbegrip van de belangrijkste structuren van grijze stof en witte stof in de hersenhelften.
    • exemplaren: hele hersenplaten gesneden in het coronale, axiale/horizontale of parasagittale vlak Sylvius4 Online
    • Activiteiten:
      • Begin met een reeks voorhersenplaten die in het coronale vlak zijn gesneden, identificeer in het weefsel alle grijze en witte stofstructuren die worden geïdentificeerd in Figuren 5.8,5.9, 5.10, 5.11, en 5.12.
      • Let vooral op: Uitdaging 5.1met als doel het identificeren van de interne capsule en de diepe grijze materiestructuren eromheen.
      • Herhalen Uitdaging 5.1met behulp van voorhersenen platen gesneden in het axiale/horizontale of parasagittale vlak, verwijzend naar de Sectional Anatomy Photographic Atlas of MR Atlas in Sylvius4 Online (en extra bron is de MRI-atlas op headneckbrainspine.com).
      • Werk door Uitdaging 5.2door te focussen op de mediale temporale kwab. Overweeg de relatieve locatie van de amygdala en de hippocampus ten opzichte van de temporale hoorn van de laterale ventrikel

Nu je een raamwerk hebt verworven voor het begrijpen van de regionale anatomie van het menselijk brein, gezien vanaf de oppervlakte, en enig begrip van de bloedtoevoer naar zowel oppervlakkige als diepe hersenstructuren, ben je klaar om de interne organisatie van de hersenen te verkennen. . Dit hoofdstuk zal zich concentreren op de sectionele anatomie van de voorhersenen (denk eraan dat de voorhersenen de afgeleiden van de embryonale prosencepahlon omvatten). Gezien de complexiteit van de hersenstam en het belang ervan voor diagnose en klinische praktijk, zal dat deel van de hersenen in een apart hoofdstuk worden behandeld. Maar voordat u begint met het bestuderen van de interne anatomie van de hersenen, is het nuttig om uzelf vertrouwd te maken met enkele algemene conventies die worden gebruikt om de diepe structuren van het centrale zenuwstelsel te beschrijven.

Interne anatomie van de voorhersenen

In de rest van dit hoofdstuk zullen we het uiterlijk van secties door de voorhersenen bespreken, zodat u de structuren kunt leren identificeren die niet zichtbaar zijn aan de oppervlakte. De anatomie van de voorhersenen zoals te zien in secties is relatief eenvoudig, maar de geometrie van sommige van deze diepe structuren kan een uitdaging zijn om te waarderen. Let bijvoorbeeld op het uiterlijk van de hippocampus formatie en de laterale ventrikel in het licht van gedeeltelijk ontleed hersenen in Afbeelding 5.1. Je zult snel ontdekken waarom deze structuren verschijnen waar ze verschijnen.

Zorg ervoor dat u bij het doornemen van de rest van dit hoofdstuk de volgende structuren herkent en lokaliseert op secties die in een van de drie standaardvlakken zijn gesneden:

Grijze massa

Witte materie

caudale kern

nucleus accumbens

Laten we onze studie van de anatomie van de interne voorhersenen beginnen met de hersenschors. De hersenschors is een dunne laag grijze stof die het hele oppervlak van de hemisferen bedekt. Het grootste deel van de cortex die zichtbaar is vanaf het oppervlak bij mensen staat bekend als: neocortex, cortex die is opgebouwd uit zes lagen neuronen (zie bijlage 5 met betrekking tot de histologie van het zenuwstelsel). Fylogenetisch oudere cortex, die minder cellagen heeft (paleocortex en archicortex), bevindt zich op het inferieure oppervlak van de temporale kwab, gescheiden van de neocortex door de rhinale spleet (Afbeelding 5.2). De cortex met de minste lagen (drie) staat bekend als de zeepaardje (archicortex van de parahippocampale gyrus). De hippocampus is de mediale rand van de temporale cortex die dubbelgevouwen wordt in het mediale aspect van de temporale kwab. Het is alleen zichtbaar in ontlede hersenen (zie Afbeelding 5.1) of in secties. Het is de moeite waard eraan te denken dat de hele hersenschors is afgeleid van de wanden van de grootste en meest voorste zwelling van de embryonale hersenen, het prosencephalon. Dus, ondanks zijn diepe sulci en kloven en fylogenetische delingen, is de hele hersenschors in één halfrond een ononderbroken vel neuraal weefsel.

De cortex bestaat uit neuronale cellichamen, hun dendrieten en de terminale arborisaties van axonen afkomstig van de thalamus en andere bronnen, voornamelijk van andere neuronen in de hersenschors. Inderdaad, veel neuronen in de cortex sturen axonen die een aanzienlijke afstand afleggen in het centrale zenuwstelsel om synaptische verbindingen te maken met andere neuronen. Axonen die de cortex binnenkomen en verlaten, vormen de witte stof die een groot deel van de hemisferen vormt. We spreken vaak over axonen alsof ze in beweging zijn, met woorden als &lsquo-entergaan,&rsquo &lsquo-bladeren,&rsquo &lsquodescending,&rsquo &lsquotrafelen, &lsquoprojecteren,&rsquo enz. Natuurlijk ligt hun plaats vast in de volwassene, en waar we het eigenlijk over hebben zijn de richtingen waarin actiepotentialen zich normaal langs de axonen voortplanten.

Basale ganglia en interne capsule

Diep begraven in de hemisferen zijn de basale ganglia (Afbeelding 5.3), dit zijn grote grijze-stofstructuren die zich bezighouden met het moduleren van thalamische interacties met de frontale kwab. (De term &lsquoganglion&rsquo is niet meestal gebruikt voor clusters van neuronen in het centrale zenuwstelsel, dit is een uitzondering.) De basale ganglia liggen gedeeltelijk rostraal en gedeeltelijk lateraal van het diencephalon (zie de de grafiek van figuur A24 (Neurowetenschappen, 5e ed.)voor hun embryonale relaties). Ze kunnen worden onderverdeeld in vier hoofdstructuren: de caudaat, de putamen, de nucleus accumbens, en de globus pallidus.

Structureel en functioneel zijn de caudate, putamen en nucleus accumbens vergelijkbaar, en ze worden vaak gezamenlijk de striatum, vanwege de strepen of &ldquostriations&rdquo van grijze stof die door een prominente bundel witte stof (de interne capsule) lopen die anders de caudate van het putamen scheidt. (De caudate en putamen worden ook wel het &ldquoneostriatum&rdquo genoemd om hun evolutionaire en functionele relatie met neurale circuits in de neocortex te benadrukken.) Ventraal naar de caudate en putamen zijn aanvullende afdelingen van het striatum, die belangrijk zijn voor het begrijpen van gemotiveerd gedrag en verslaving. De meest prominente van deze structuren in dit zogenaamde ventrale striatum is de nucleus accumbens.

Deze drie delen van het striatum ontvangen input van verschillende delen van het telencephalon die de functionele rollen van elke striatale divisie bepalen. Over het algemeen reguleert het striatum (en de circuits door de basale ganglia die hier beginnen) de beweging, waarbij de drie delen van het striatum verschillende bewegingsdomeinen beheersen. Het zou dus leerzaam moeten zijn om te onthouden dat:

  • de putamen houdt zich bezig met de regulering van lichamelijke beweging
  • de caudaatkern (vooral zijn grote voorste &lsquohead&rsquo) reguleert beweging van geest en ogen (die vaak aangeven waar we aan denken) en
  • de nucleus accumbens is begaan met beweging van emotie of gemotiveerd gedrag.

Uiteraard spreken we over het begrip beweging in losse termen. Desalniettemin is het belangrijk om te erkennen dat elke striatale divisie (en de verschillende circuits door de basale ganglia die van elk afkomstig zijn) gemeenschappelijke structurele en functionele motieven delen die hun bijdrage aan de modulatie van gedrag helpen verklaren. Elk circuit is betrokken bij de initiatie of onderdrukking van een programma voor gedrag. Om deze functies te vervullen, projecteert elke afdeling van het striatum naar een of andere afdeling van de pallidum de globus pallidus is de grootste afdeling van het pallidum en krijgt voornamelijk input van het putamen. Het pallidum reguleert op zijn beurt de thalamo-corticale interacties. Een volledige overweging van de basale ganglia-circuits valt buiten het bestek van dit onderzoek, maar deze belangrijke circuits zullen elders in de cursus en in Bijlage 3.

Laten we nu onze aandacht verleggen van grijze stof naar witte stof.

Er zijn drie bundels axonen in het halfrond die al zijn geïdentificeerd op sagittale weergaven: het corpus callosum, de commissuur anterior en de fornix (zie Laboratorium 2). Een extra systeem van axonale vezels moet nu worden gewaardeerd. Veel van de axonen die de cortex binnenkomen of verlaten, vormen geen compacte bundels, behalve in de buurt van de thalamus en de basale ganglia, waar ze een structuur vormen die bekend staat als de interne capsule.

De interne capsule ligt net lateraal van het diencephalon, en zoals hierboven kort vermeld, scheidt een deel ervan de caudate van het putamen. Veel van de axonen in de interne capsule eindigen of ontstaan ​​in de thalamus. Andere systemen van axonen die van de cortex afdalen, lopen door de interne capsule en gaan verder langs het diencephalon om de cerebrale steeltjes van de middenhersenen. Tussen de cortex en de interne capsule zijn de axonen van de witte stof niet zo dicht opeengepakt. Hier worden ze soms de &lsquocorona radiata&rsquo genoemd, een verwijzing naar de manier waarop ze lijken uit te stralen vanuit de compacte interne capsule om meerdere delen van de cortex te bereiken. (Individuele groepen axonen kunnen ook op deze manier worden aangegeven. U zult bijvoorbeeld verwijzingen horen naar de visuele stralingen of de auditieve stralingen, axonen die respectievelijk van de thalamus naar de visuele en auditieve cortex gaan.) de interne capsule in relatie tot de belangrijke structuren van diepe grijze stof na het bekijken van dwarsdoorsneden door de voorhersenen.

Er zijn verschillende andere bundels van axonen die longitudinaal door de witte stof van de voorhersenen lopen in elke hersenhelft en die verschillende corticale gebieden (associatieve witte stof) met elkaar verbinden, maar u hoeft zich nu geen zorgen te maken over het identificeren ervan.

Dat is bijna alles voor structuren in de hemisferen! Maar er zijn nog twee andere grijze-stofstructuren die u moet kennen.

Basale voorhersenen kernen en Amygdala

Een van de extra grijze-stofstructuren die u moet kennen, is een groep complexe kernen, bekend als de basale voorhersenen kernen, die in verband zijn gebracht met de tekenen en symptomen van ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (zie Afbeelding 5.9). Net als de basale ganglia bestaan ​​de basale voorhersenenkernen uit clusters van cellen (in plaats van lagen), maar in tegenstelling tot de basale ganglia zijn deze clusters veel kleiner en doorgaans veel minder compact. Ze bevinden zich ventraal van de voorste commissuur en onder de basale ganglia, tussen het ventrale striatum en de hypothalamus.

De andere extra grijze stofstructuur is de amygdala, wat een grote massa grijze stof is, begraven in het anterior-mediale deel van de temporale kwab, anterieur aan de laterale ventrikel en de hippocampus (zie Afbeelding 5.10). De amygdala is een belangrijk onderdeel van het ventraal-mediale voorhersenencircuit en is betrokken bij het ervaren en uiten van emoties. Het werd ooit geclassificeerd als onderdeel van de basale ganglia, maar het is structureel en functioneel heterogeen, met systemen van neuronen en intrinsieke verbindingen die vergelijkbaar zijn met die in het striatum en de hersenschors.

Er is één kleine complicatie die u zult tegenkomen als u de structuren van de voorhersenen in secties begint te identificeren. Dat wil zeggen, soms zie je dezelfde structuren twee keer in dezelfde sectie op hetzelfde halfrond. Om te begrijpen waarom dit zo is, raadpleegt u: Figuren 5.3& 5.4.

Het diencephalon komt mediaal van de hemisferen te liggen. De thalamus is de grootste onderverdeling van het diencephalon (zie Afbeelding 5.5). Het is eivormig en bestaat uit vele onderverdelingen (bijv. de VPL- en VPM-kernen geassocieerd met somatische sensaties van respectievelijk de ledematen en het gezicht). De hypothalamus ligt ventraal van de thalamus. Voorafgaand aan de hypothalamus bevindt zich het optische chiasme. (Klinisch is de fysieke nabijheid van het chiasma tot de hypofyse erg belangrijk, aangezien een combinatie van visuele en endocriene problemen een sterke aanwijzing is voor een hypofysetumor.) De borstlichamen maken deel uit van de hypothalamus en liggen in het caudale deel ervan net op de kruising met de middenhersenen.

Ten slotte, voordat je de uitdaging aangaat om de voorhersenen in dwarsdoorsneden te bekijken, bestudeer je de foto van een brein met het cerebellum weggesneden zodat je het dorsale oppervlak van de hersenstam en het achterste oppervlak van de dorsale thalamus kunt zien (Afbeelding 5.6). Overweeg ook de driedimensionale configuratie van het ventriculaire systeem in de voorhersenen en hersenstam (Afbeelding 5.7 en de Sylvius Zelfstudie Oefening onderstaand). Het is belangrijk om de relaties tussen deze structuren te begrijpen, zodat u begrijpt waarom dwarsdoorsneden door de hersenen in verschillende vlakken verschijnen zoals ze zijn (terwijl u dit doet, wilt u misschien opnieuw verwijzen naar de grafiek van figuur A24 (Neurowetenschappen, 5e ed.).

Sylvius Zelfstudie Oefening&mdashVerschillende gezichtspunten (klik hier om Sylvius te starten)

Met wat studie van de grafiek van figuur A24 (Neurowetenschappen, 5e ed.) en Afbeelding 1.1, je kunt behoorlijk vertrouwd raken met de ventriculaire compartimenten van het menselijk brein, hun relatie tot de omliggende onderverdelingen van het volwassen brein en hun embryologische voorlopers waaruit deze complexe vormen zijn voortgekomen.

Als een aandachtspunt voor deze zelfstudie, onthoud dat de ventrikels het product zijn van de morfogene gebeurtenissen die het lumen van de embryologische neurale buis verbogen, samenknijpen en uitbreidden en de dikte en complexiteit van zijn wanden aanzienlijk vergrootten (nu dat is een understatement !). Het doel van deze oefening is om de visuele herkenning onder de knie te krijgen van de verschillende compartimenten die het ventriculaire systeem van het volwassen brein vormen. Dit houdt in dat er vier hoofdventrikels worden herkend, de gepaarde laterale ventrikels, de derde ventrikel, en de vierde ventrikel, evenals een smal kanaal, de cerebrale aquaduct. Onderweg maak je ook kennis met standaardaanzichten van de voorhersenen en hersenstam in dwarsdoorsnede.

Zorg om te beginnen dat u bekend bent met de illustraties in Afbeelding 5.7 ze vormen de basis voor uw verkenning van de ventrikels in doorsneden van de hersenen. Open vervolgens Sylvius4 en ga naar Sectionele anatomie, Fotografische atlasen klik vervolgens op ventrikels. Bekijk nu de meest rostrale coronale sectie (& ldquo Coronale 1 & rdquo zou moeten verschijnen als uw muis over de juiste miniatuurafbeelding in het navigatievenster blijft hangen). Begin met het snijden van deze hersenen van rostraal naar caudaal (klik op de pijl naar rechts in het navigatievenster) en let op het uiterlijk van de frontale hoorn van de laterale ventrikel in coronale sectie 3 . Met uw aandacht op de laterale ventrikel, ga verder met het snijden en let op het uiterlijk van de temporale hoorn van de laterale ventrikel in de mediale temporale kwab (coronale secties 5 & 6). Let ten slotte op de caudale uitbreiding van de laterale ventrikel wanneer deze de occipitale kwab binnendringt als de occipitale hoorn van de laterale ventrikel (coronale secties 7 & 8).

Snijd nu de voorhersenen opnieuw in het axiale (horizontale) vlak van dorsaal naar ventraal (klik op een axiale miniatuurafbeelding of pak de dorsale-ventrale schuifregelaar in het navigatievak om een ​​axiaal beeld te selecteren). Zoek naar dezelfde compartimenten in de laterale ventrikel. Merk je op hoe de laterale ventrikel zich wijd opent in zijn centrale deel of lichaam (horizontale sectie 2), dan meer posterieur verschijnt in een gebied dat het atrium wordt genoemd (horizontale sectie 3) voordat hij meer naar voren in de temporale kwab verschijnt (horizontale sectie 4)? Raadpleeg de illustraties in Afbeelding 5.7 terwijl u in het axiale vlak snijdt.

Om de derde ventrikel te waarderen, vergelijk horizontale sectie 3 met coronale secties 4 & 5 . Zie je de smalle spleetachtige ruimte gedefinieerd door de derde ventrikel aan de mediale basis van het diencephalon? Op welke manier stroomt cerebrospinale vloeistof van het laterale ventrikel, waar het wordt gesynthetiseerd door choroïde plexus, naar het derde ventrikel? (Zie Afbeelding A22 op pagina 743 van Neurowetenschappen, 5e druk. of Netter 103 en Netter 96A voor het antwoord)

Het derde ventrikel communiceert met het vierde ventrikel door middel van een smal kanaal door de dorsale middenhersenen (mesencephalon), het cerebrale aquaduct genoemd. Dit kanaal is nauwelijks zichtbaar in ( coronale sectie 6 vanwege de zeer kleine diameter). Om het cerebrale aquaduct beter te kunnen zien, gaat u naar de Cross-sectionele atlas van hersenstam en selecteer Alle structuren bekijk vervolgens de sectie met het label &ldquo 2 &ndash Midbrain &rdquo (tweede sectie vanaf de bovenkant van de lijst met miniaturen). Zie je de kleine ruimte langs de dorsale middellijn van de sectie? Dat is het cerebrale aquaduct en het is een belangrijk oriëntatiepunt dat je altijd zal helpen bij het identificeren van dwarsdoorsneden door de middenhersenen, zoals afgeleid uit de grafiek van figuur A24 (Neurowetenschappen, 5e ed.). Ga vanaf hier verder door de hersenstam in caudale richting en let op de geleidelijke uitzetting van het cerebrale aquaduct als je de pons binnengaat.

Door sectie & ldquo 6 & ndash Pons & rdquo, is het cerebrale aquaduct volledig geopend in de vierde ventrikel (klik op de vierde ventrikel om deze ruimte te markeren). Dit meest caudale ventrikel in het volwassen brein ligt tussen het dorsale oppervlak van de pons en de grote stengels van witte stof (de cerebellaire steeltjes &ldquopeduncle&rdquo betekent stengel) die het cerebellum verbinden met de hersenstam.

Keer nu terug naar de voorhersenen en bekijk het sagittale middenvlak (ga naar Sectionele anatomie > Fotografische atlas > ventrikels). Als je de vier belangrijkste componenten van het ventriculaire systeem opnieuw bekijkt, waardeer dan hun structurele continuïteit, hun fysieke relatie met de omliggende hersengebieden en denk opnieuw aan hun embryologische oorsprong.

  1. Onderzoek platen door de menselijke voorhersenen
    • Leerdoel: herkennen van de belangrijkste kenmerken van de voorhersenen (en hersenstam) die met het blote oog zichtbaar zijn, met inbegrip van de belangrijkste structuren van grijze stof en witte stof in de hersenhelften.
    • exemplaren: hele hersenplaten gesneden in het coronale, axiale/horizontale of parasagittale vlak Sylvius4 Online
    • Activiteiten:
      • Begin met een reeks voorhersenplaten die in het coronale vlak zijn gesneden, identificeer in het weefsel alle grijze en witte stofstructuren die worden geïdentificeerd in Figuren 5.8,5.9, 5.10, 5.11, en 5.12.
      • Let vooral op: Uitdaging 5.1met als doel het identificeren van de interne capsule en de diepe grijze materiestructuren eromheen.
      • Herhalen Uitdaging 5.1met behulp van voorhersenen platen gesneden in het axiale/horizontale of parasagittale vlak, verwijzend naar de Sectional Anatomy Photographic Atlas of MR Atlas in Sylvius4 Online (een extra bron is de MRI-atlas op headneckbrainspine.com).

Coronale secties door de hersenen

De vijf coronale secties door de hersenen getoond in (Figuren 5.8, 5.9, 5.10, 5.11, en 5.12), zijn afkomstig van Sylvius4en moet lijken op de hersenen die beschikbaar zijn voor onderzoek in het laboratorium. Onthoud dat gebieden met weinig of geen myeline er donker uitzien en als grijze stof worden beschouwd, en gebieden die gemyeliniseerde axonen bevatten, lijken licht en worden witte stof genoemd.

Sagittale doorsnede door het hoofd en de nek van de mens

De sectie in Afbeelding 5.13 wordt lateraal van de middellijn gesneden op de locatie die is aangegeven op de inzet van coronale en horizontale secties. Na enige tijd te hebben besteed aan het bestuderen van doorsneden van de hersenen in afzondering, is het de moeite waard om te onthouden hoe de hersenen en het ruggenmerg verband houden met de omringende structuren van de schedel en de wervelkolom, zoals in deze sectie wordt getoond aan de hand van een kadaverspecimen.

Niet-invasieve beeldvorming van het menselijke centrale zenuwstelsel

Figuren 5.14, 5.15, en 5.16 bevatten T1-gewogen, magnetische resonantie beeldvorming (MRI) beelden van het hoofd vanaf de MR Atlas in Sylvius4. Sets scans in de coronale, sagittale en horizontale vlakken worden getoond, met inzetstukken om u te herinneren aan hun oriëntatie. Gebruik deze afbeeldingen samen met andere in de MR Atlas in Sylvius4 werken door de Sylvius Zelfstudie Oefening onderstaand:

Daag 5.1 uit en interne capsule en diepe grijze stof

Een van de moeilijkste uitdagingen in de anatomie van het menselijk brein is het verkrijgen van waardering voor de 3D rangschikking van diepe grijze en witte stof in de voorhersenen. Maar wees aangemoedigd! Er is een principiële manier om deze uitdaging te vereenvoudigen. U moet eerst de positionele relaties tussen de belangrijkste componenten van de basale ganglia (caudate nucleus, putamen, nucleus accumbens, globus pallidus), thalamus, en de interne capsule. Dan zou je moeten herkennen hoe de laterale ventrikel past. Als je dat eenmaal hebt gedaan, kun je elke sectie door de voorhersenen in elk vlak van sectie interpreteren, of het nu een standaard anatomisch vlak of een schuin vlak is.

Hier is de sleutel tot het inlijsten van je 3D begrip: de diepe grijze-stofstructuren die hierboven zijn geïdentificeerd, bevinden zich altijd aan de ene kant van de interne capsule of de andere. Specifiek.

de nucleus caudatus en de thalamus zijn mediaal van de interne capsule

de putamen en globus pallidus zijn lateraal van de interne capsule.

Deze relaties weerspiegelen het verloop van de ontgroeiende axonen die de interne capsule vormden tijdens de ontwikkeling van de foetus terwijl ze door de anlage van diepe grijze materie in de embryonale hersenen navigeerden. Let bij het zorgvuldig inspecteren van secties door de voorhersenen (op de volgende pagina's en in het laboratorium) op het uiterlijk van het interne kapsel en de diepgrijze stof. Er zijn verschillende aanvullende details om te observeren en te onthouden:

  1. de caudaat en putamen doorlopend worden rond de rostrale rand van het interne kapsel en net inferieur aan het voorste lidmaat van de interne capsulesmelten deze diepe grijze materiestructuren samen om een ​​ventrale, anterieure component te vormen, de nucleus accumbens
  2. de globus pallidus is een relatief kleine structuur nabij het midden van de basale ganglia
  3. de globus pallidus bevindt zich tussen de interne capsule en de putamen
  4. de thalamus neemt een meer posterieur volume hersenruimte in dan het grootste deel van de basale ganglia
  5. de caudale kern heeft een lange &ldquostaart&rdquo die het verloop van de laterale ventrikel in de temporale kwab volgt (zie opnieuw Afbeelding 5.3en 5.4).
  6. de voorste ledemaat van de interne capsule scheidt de kop van de caudate van putamen en globus pallidus, terwijl de achterste ledemaat van de interne capsule voornamelijk thalamus scheidt van globus pallidus

Na inzicht te hebben gekregen in deze punten in de reeks coronale secties in Figuren 5.8, 5.9, 5.10, 5.11, en 5.12, open Sylvius4 Online en voer de in Basale ganglia beeldset van de Fotografische atlas in de Sectionele anatomie groep bekijk dan de meest rostrale coronale sectie en bekijk dezelfde secties (en een paar die hier niet zijn weergegeven). Snijd vervolgens dit digitale brein opnieuw in het axiale vlak en vervolgens in het parasagittale vlak. De interne capsule is misschien moeilijker te waarderen in deze andere vlakken van sectie, maar hier is een tip: zoek de interne capsule op in de Visuele woordenlijst en je zult het gelabeld zien in het axiale vlak. In dit vlak zult u de voorste en achterste ledematen gemakkelijk waarderen. Het voorste lidmaat van het interne kapsel scheidt voornamelijk de voorste caudatus van putamen en globus pallidus, en het achterste lidmaat van het interne kapsel scheidt voornamelijk de thalamus van globus pallidus.

Dus nu je klaar bent om de interne anatomie van de voorhersenen te interpreteren, leg een reeks coronale of axiale secties op een schaal en identificeer elk van de structuren en relaties genummerd (1) tot (6) hierboven.

Sylvius Zelfstudie Oefening&mdashVerschillende gezichtspunten (klik hier om Sylvius te starten)

Nu u de aanzichten van de interne anatomie van de voorhersenen (en delen van de hersenstam) hebt doorgenomen in coronale secties, probeer alle dezelfde structuren te identificeren die zijn gelabeld in Figuren 5.8, 5.9, 5.10, 5.11, en 5.12 en in de andere vlakken van sectie die verkrijgbaar zijn in Sylvius4, namelijk de horizontaal (axiaal) en parasagittaal vliegtuigen.

In principe is dit precies hetzelfde type zelfstudie-oefening dat je misschien hebt gedaan tijdens het bestuderen van de ventrikels, maar de uitdaging is om in te spelen op een verscheidenheid aan structuren die misschien niet zo duidelijk zijn als je door de ventrikels gaat. voorhersenen. dus open Sylvius4 en ga naar Sectionele anatomie, Fotografische atlasen klik vervolgens op een van de filtersets, afhankelijk van de structuren die u wilt markeren, zoals: ventrikels, Limbisch systeem, of Basale ganglia, of misschien wilt u gewoon het exemplaar bekijken Niet gelabeld. Bekijk nu de meest dorsale horizontale (axiale) sectie (&ldquoHorizontal 1&rdquo zou moeten verschijnen als uw muis over de juiste miniatuurafbeelding in het navigatievenster blijft hangen). Begin deze hersenen door te snijden van dorsaal naar ventraal (klik op de pijl naar rechts in het navigatievenster) en let op het verschijnen van gekleurde structuren van belang (afhankelijk van, nogmaals, op welke filterset je hebt geselecteerd). Nadat u een paar keer op en neer door het monster bent gegaan, snijdt u de voorhersenen opnieuw in het parasagittale vlak (klik op een parasagittale miniatuurafbeelding of pak de mediale-laterale schuifregelaar in het navigatievak om een ​​parasagittale afbeelding te selecteren). Zoek naar dezelfde structuren als je door de hersenen gaat van mediaal naar lateraal en weer terug.

Probeer hetzelfde proces te herhalen tijdens het passeren van de T1-gewogen afbeelding in de MR Atlas (ga naar Sectionele anatomie > MR Atlas > Alle structuren) en vind elk van de genummerde structuren van Figuren 5.8, 5.9, 5.10, 5.11, en 5.12. Een extra hulpmiddel is de MRI-atlas op headneckbrainspine.com.

Tip&mdashIn de MR Atlas, kunt u meerdere afbeeldingsvensters openen als u op de miniatuur klikt en deze vasthoudt totdat een klein tekstvak verschijnt met de tekst &ldquoOpen afbeelding in nieuw venster&rdquo terwijl u de muisknop ingedrukt houdt, beweeg de muis over deze tekst om deze optie en een nieuw afbeeldingsvenster te selecteren wordt geopend wanneer u de muisknop loslaat.

Tip&mdashOok in de MR Atlas, kunt u naar een structuur zoeken in het structuurvenster aan de rechterkant, blader gewoon door de lijst, selecteer de gewenste structuur en die structuur wordt gemarkeerd in elke miniatuurafbeelding die die structuur bevat (zoek naar de kleine gele blokken die de geselecteerde structuur).

Raadpleeg de ongelabelde, gedrukte versies van de afbeeldingen uit de Sylvius4 MR Atlas hierboven om uw herkenning van een aantal van de belangrijkste structuren die de interne organisatie van de voorhersenen bepalen, te versterken.

Challenge 5.2&mdashamygdala & hippocampus

Leg voor je op een dienblad een reeks coronale of axiale secties door een hersenhelft. Nu je gericht bent op de basale ganglia, thalamus en interne capsule, ben je klaar voor een eenvoudigere uitdaging. Richt je aandacht op de mediale delen van de temporale kwab en identificeer de amygdala en de hippocampus. Terwijl u uitzoekt waar deze structuren zijn en hoe ze eruit zien, moet u de volgende reeks vragen beantwoorden:

  • Welke is meer voorste, de amygdala of de hippocampus?
  • Overlappen de amygdala of de hippocampus elkaar?
  • Is de amygdala cortex, basale ganglia of iets anders?
  • Waarom wordt de amygdala de amygdala genoemd? (Latijn voor &ldquoalmond&rdquo)
  • Wat is de relatie tussen de hippocampus en de laterale ventrikel?
  • Waarom wordt de hippocampus de hippocampus genoemd? (Latijn&mdashvan het Grieks&mdashvoor &ldquosea horse&rdquo of &ldquosea monster&rdquo)
  • Hoe communiceren de amygdala en de hippocampus met structuren in de hypothalamus en de nabijgelegen ventrale-mediale voorhersenen?

Uitdaging 5.3 & mdashmodellering van diepe grijze materie

Nu je enige ervaring hebt met de sectionele anatomie van de voorhersenen en een groeiende waardering hebt voor de relaties van diepe grijze stofstructuren in de hersenruimte, ben je klaar om je handen vuil te maken. Geen enkele reeks neuroanatomische studie is compleet totdat leerlingen worden uitgedaagd om hun eigen brein te bouwen of te modelleren. Koop een set gekleurde Play-Doh&trade vijf kleuren zou het beste zijn, met een wit. Je doel is om een ​​eenvoudig, maar nauwkeurig model te construeren van de ruimtelijke relaties in de hersenen die je hebt ontdekt in Uitdaging 5.1. Vooral, construeer een klei (deeg) model van de belangrijkste componenten van de basale ganglia, thalamus en interne capsule, zoals beschreven in Uitdaging 5.1, met speciale aandacht voor de vijf genummerde detailpunten.

Hoe te beginnen? Begin met het maken van de interne capsule: maak een witte (voor witte stof natuurlijk) klomp klei plat tot een langwerpige waaiervorm. In de hersenen dringt het brede uiteinde van de waaier (de corona radiata genoemd) door in de subcorticale witte stof en het smalle uiteinde dringt door in het diencephalon en de hersenstam, waar het de hersenstam vormt en uiteindelijk de medullaire piramide, de basale ganglia en thalamus zich in het midden van de ventilator bevinden. Voeg vervolgens een gekleurde klomp klei toe voor de globus pallidus (maar aan welke kant van de interne capsule, lateraal of mediaal?). Omsluit vervolgens uw &lsquofaux&rsquo globus pallidus met het putamen en vorm in ieder geval de rostrale en dorsale delen van de caudate nucleus. Als je klaar bent om ambitieuzer te zijn, probeer dan een completere caudate nucleus te maken met zijn tijdelijke staart. Voeg ten slotte een eivormige knobbel toe voor de thalamus (herinner je je zijn positie ten opzichte van de interne capsule?). Hoe ziet het eruit & hellip zoiets als Afbeelding 5.3? Maak je geen zorgen als je eerste poging(en) minder dan opbouwend zijn. Het belangrijkste van deze oefening is de visualisatie van ruimtelijke relaties die voortkomen uit het worstelen met zowel substantie (boetseerklei) als abstractie (ingebeelde hersenruimte).

Een extra tip voor deze modelleeroefening: Sylvius4 bevat illustraties en een interactief virtueel model van een standaard hersenstammodel dat vaak wordt gebruikt in neuroanatomische laboratoria (waaronder de onze). Dit model omvat het diencephalon, basale ganglion en interne capsule, verwijzen naar dit model en werken samen met de functie "Atlas extra's" (beschikbaar via de map in het navigatievenster in de linkerbovenhoek) voor aanvullende weergaven van de relatie tussen deze structuren.

Nu je een kleimodel voor je hebt van de diepgrijze materie van het menselijk brein, probeer je model daadwerkelijk in een van de drie standaard neuroanatomische vlakken te snijden (het coronale vlak is een goed startvlak voor deconstructie). Dit moet gemakkelijk kunnen worden gedaan met een standaard dissectiemes of een dunne draad. Ervan uitgaande dat de klei (deeg) de juiste consistentie heeft en het snijden heeft overleefd, herkent u dan de ruimtelijke relaties tussen uw gemodelleerde grijze-stofstructuren die u in het menselijk brein ontdekte? Probeer verschillende doorsnedevlakken door uw model te vergelijken met doorsneden van het digitale brein in Sylvius4. U kunt zelfs proberen uw secties opnieuw te bevestigen met een beetje zacht kneden en vervolgens opnieuw te snijden in een orthogonaal vlak (probeer vervolgens axiaal). Met wat volharding en geduld zal het doorwerken van deze oefening een meer overtuigend begrip van 3D relaties binnen het diepste substraat van de menselijke voorhersenen.


Discussie

In de huidige studie, met behulp van de medaka-mutant met ernstig verkorte trilharen, MZdhc2, hebben we aangetoond dat kortere trilhaartjes minder Hh-activering bij vissen mediëren. Dit resultaat suggereert dat ze Hh-signalering op een lengteafhankelijke manier mediëren. We ontdekten ook dat de Ptch1-receptor exclusief gelokaliseerd is op de cilium in vissen. Deze zijn grotendeels consistent met de waarneming van muizen ciliaire mutanten.Verder heeft de huidige studie onderzocht waarom de expressie van laagdrempelige doelwitgenen wordt uitgebreid in mutante neurale buizen en hoe het Hh-signaal wordt versterkt in mutante viscellen.

Een mogelijke rol voor trilhaartjes bij de vorming van Hh-gradiënten

olig2-positieve wildtype cellen in mutante neurale buizen waren meer dorsaal gepositioneerd dan de dorsale grens van olig2 expressie in wildtype neurale buizen (Figuur 5D). Dit resultaat suggereert, hoewel indirect, dat het gradiëntprofiel van Hh-ligand dorsaal verschuift in mutante neurale buizen.

Dorsale expansie van Shh-ligand werd direct waargenomen met gladgestreken muismutanten [23] en dit kan worden geïnterpreteerd als een gevolg van de verminderde hoeveelheid Ptch1-receptor, een stroomafwaarts doelwit van Hh-signalering. Er is inderdaad voorgesteld dat de Shh-gradiënt wordt gereguleerd door een Shh-geïnduceerd negatieve feedbackmechanisme waarbij ligandbinding aan Ptch1 bij de cilia Hh-ligand zelf in de intercellulaire ruimte sequestreert [18]. Het is dus denkbaar dat in ciliaire mutante neurale buizen de verminderde hoeveelheid Ptch1 op cilia een dorsaal verschoven Hh-gradiënt veroorzaakte, en daardoor het expressiedomein van ventrale laagdrempelige doelwitgenen wordt uitgebreid, hoewel verdere bevestiging door directe beeldvorming vereist is. Consequent, de neurale buis in Dnchc2 mutanten vertoont ook de uitbreiding van genexpressie met een lage drempel [14,15]. Dus bij gewervelde dieren kan de lengte van de trilhaartjes een van de factoren zijn die de Hh-gradiënt in de neurale buis beïnvloeden. Natuurlijk kunnen we nog steeds niet uitsluiten dat wildtype cellen, wanneer ze in een mutante achtergrond worden geplaatst, gevoeliger worden dan die in een controleachtergrond.

Teleost-specifieke vergroting van de Hh-route gemedieerd door gefuseerd

In de huidige studie stellen we voor dat Fu een sleutel is om rekening te houden met het verschil in activeringsniveau tussen zoogdieren en vissen in ciliaire mutanten. Fused is een cruciale mediator van Hh-signalering in Drosophila en zebravissen, maar niet bij zoogdieren [7]. Dat hebben we eerst bevestigd: fu was vereist voor Hh-signalering in medaka-achtige zebravissen, en ontdekte vervolgens dat de expressie van fu in neurale buis is beperkt tot het ventrale deel en geïnduceerd door Hh-signalering bij vissen. Daaropvolgende analyses toonden aan dat Fu een positieve feedbacklus vormt stroomafwaarts van Smo (Figuur 7). Fu activeert de Hh-route die vervolgens leidt tot de opregulatie van Fu. De positieve feedback gecentreerd door Fu zou het Hh-signaal in ciliaire mutante cellen kunnen versterken met een lagere invoer van Smo-gemedieerde signalering. Dit zou dus kunnen verklaren waarom het fenotype van ciliaire mutanten van vissen milder is dan dat van tegenhangers van zoogdieren. Natuurlijk is Fu niet slechts een onderdeel dat de ciliaire afhankelijkheid in de twee gewervelde modellen onderscheidt. Inderdaad, bij zebravissen is bekend dat lage niveaus van Hh-activering gemedieerd door Gli1 op een Hh-onafhankelijke manier voorkomen en het mechanisme ervan blijft ongrijpbaar [5].

Wat is de biologische en evolutionaire betekenis van het positieve feedbackmechanisme bij Hh-signalering. Een hint kon worden gevonden in de snelheid en wijze van neurulatie bij vissen. Volgens het recente rapport van Xiong et al. [24], specificatie van neurale celtypes bij zebravissen begint eerder en verloopt sneller onder de luidruchtige omstandigheden van celbewegingen bij de vorming van de neurale kiel. Terwijl bij andere gewervelde dieren, zoals kuikens en muizen, neurulatie geleidelijk en gestaag verloopt in een geëpithelialiseerd celblad, volgens een gevestigde Shh-gradiënt. Een snelle en versterkte reactie op Shh in doelcellen zou dus nodig zijn bij neurulatie van vissen. Xiong et al. toonde ook aan dat gespecificeerde neurale voorlopers sorteren om scherp begrensde domeinen te vormen uit gemengde voorloperpopulaties. Dit is echter blijkbaar in tegenspraak met ons transplantatieresultaat dat ectopische expressie van een specifieke marker in wildtype donoren laat zien (Figuur 5D), wat suggereert dat meerdere strategieën, waaronder sorteren en positieafhankelijke bepaling, worden gebruikt om een ​​robuust patroon te bereiken. Onlangs werd de aanwezigheid van cilium-gemedieerde signalering gerapporteerd in het reukepitheel van Drosophila [24], wat de evolutionair oude oorsprong van dit mechanisme suggereert. Zo zal verdere analyse van Hh-signalering in diverse soorten en weefsels meer inzicht verschaffen in de evolutie van deze cruciale signaleringsroute.


Verstoorde ER-membraaneiwitcomplex-gemedieerde topogenese veroorzaakt aangeboren neurale lijstdefecten

1 Pediatric Genomics Discovery Program, Afdeling Kindergeneeskunde en Genetica, Yale University School of Medicine, New Haven, Connecticut, VS.

2 Afdeling Biomedische Wetenschappen, School of Medicine, University of California, Riverside, Californië, VS.

Correspondentieadres aan: Mustafa K. Khokha, Yale University School of Medicine, Section of Critical Care Medicine, PO Box 208064, 333 Cedar Street, New Haven, Connecticut 06520-8064, VS. Telefoon: 203.785.4651 E-mail: [email protected]

Vind artikelen van Marquez, J. in: JCI | PubMed | Google Scholar | />

1 Pediatric Genomics Discovery Program, Afdeling Kindergeneeskunde en Genetica, Yale University School of Medicine, New Haven, Connecticut, VS.

2 Afdeling Biomedische Wetenschappen, School of Medicine, University of California, Riverside, Californië, VS.

Correspondentieadres aan: Mustafa K. Khokha, Yale University School of Medicine, Section of Critical Care Medicine, PO Box 208064, 333 Cedar Street, New Haven, Connecticut 06520-8064, VS. Telefoon: 203.785.4651 E-mail: [email protected]

Vind artikelen van Criscione, J. in: JCI | PubMed | Google geleerde

1 Pediatric Genomics Discovery Program, Afdeling Kindergeneeskunde en Genetica, Yale University School of Medicine, New Haven, Connecticut, VS.

2 Afdeling Biomedische Wetenschappen, School of Medicine, University of California, Riverside, Californië, VS.

Correspondentieadres aan: Mustafa K. Khokha, Yale University School of Medicine, Section of Critical Care Medicine, PO Box 208064, 333 Cedar Street, New Haven, Connecticut 06520-8064, VS. Telefoon: 203.785.4651 E-mail: [email protected]

Vind artikelen van Charney, R. in: JCI | PubMed | Google geleerde

1 Pediatric Genomics Discovery Program, Afdeling Kindergeneeskunde en Genetica, Yale University School of Medicine, New Haven, Connecticut, VS.

2 Afdeling Biomedische Wetenschappen, School of Medicine, University of California, Riverside, Californië, VS.

Correspondentieadres aan: Mustafa K. Khokha, Yale University School of Medicine, Section of Critical Care Medicine, PO Box 208064, 333 Cedar Street, New Haven, Connecticut 06520-8064, VS. Telefoon: 203.785.4651 E-mail: [email protected]

1 Pediatric Genomics Discovery Program, Afdeling Kindergeneeskunde en Genetica, Yale University School of Medicine, New Haven, Connecticut, VS.

2 Afdeling Biomedische Wetenschappen, School of Medicine, University of California, Riverside, Californië, VS.

Correspondentieadres aan: Mustafa K. Khokha, Yale University School of Medicine, Section of Critical Care Medicine, PO Box 208064, 333 Cedar Street, New Haven, Connecticut 06520-8064, VS. Telefoon: 203.785.4651 E-mail: [email protected]

1 Pediatric Genomics Discovery Program, Afdeling Kindergeneeskunde en Genetica, Yale University School of Medicine, New Haven, Connecticut, VS.

2 Afdeling Biomedische Wetenschappen, School of Medicine, University of California, Riverside, Californië, VS.

Correspondentieadres aan: Mustafa K. Khokha, Yale University School of Medicine, Section of Critical Care Medicine, PO Box 208064, 333 Cedar Street, New Haven, Connecticut 06520-8064, VS. Telefoon: 203.785.4651 E-mail: [email protected]

1 Pediatric Genomics Discovery Program, Afdeling Kindergeneeskunde en Genetica, Yale University School of Medicine, New Haven, Connecticut, VS.

2 Afdeling Biomedische Wetenschappen, School of Medicine, University of California, Riverside, Californië, VS.

Correspondentieadres aan: Mustafa K. Khokha, Yale University School of Medicine, Section of Critical Care Medicine, PO Box 208064, 333 Cedar Street, New Haven, Connecticut 06520-8064, VS. Telefoon: 203.785.4651 E-mail: [email protected]

Vind artikelen van García-Castro, M. in: JCI | PubMed | Google geleerde

1 Pediatric Genomics Discovery Program, Afdeling Kindergeneeskunde en Genetica, Yale University School of Medicine, New Haven, Connecticut, VS.

2 Afdeling Biomedische Wetenschappen, School of Medicine, University of California, Riverside, Californië, VS.

Correspondentieadres aan: Mustafa K. Khokha, Yale University School of Medicine, Section of Critical Care Medicine, PO Box 208064, 333 Cedar Street, New Haven, Connecticut 06520-8064, VS. Telefoon: 203.785.4651 E-mail: [email protected]

Multipass-membraaneiwitten hebben een groot aantal functies, waaronder transductie van cel-celsignalen, ionentransport en fotoreceptie. Het inbrengen van deze eiwitten in het membraan hangt af van het endoplasmatisch reticulum (ER) membraaneiwitcomplex (EMC). Onlangs zijn geboorteafwijkingen waargenomen bij patiënten met varianten in het gen dat codeert voor een lid van dit complex, EMC1. Patiëntfenotypes omvatten congenitale hartziekte, craniofaciale misvormingen en neurologische ontwikkelingsziekte. Een moleculair verband tussen EMC1 en deze geboorteafwijkingen ontbreekt echter. Gebruik makend van Xenopusidentificeerden we defecten in neurale lijstcellen (NCC's) op emc1 uitputting. We gebruikten toen onbevooroordeelde proteomics en ontdekten een cruciale rol voor emc1 in WNT-signalering. In overeenstemming hiermee werden uitlezingen van WNT-signalering en Frizzled (Fzd) -niveaus verminderd in emc1-uitgeputte embryo's, terwijl NCC-defecten konden worden gered met β-catenine. Interessant genoeg werden andere transmembraaneiwitten verkeerd gelokaliseerd op emc1 uitputting, wat inzicht geeft in aanvullende patiëntfenotypes. Om onze bevindingen terug te vertalen naar mensen, ontdekten we dat EMC1 noodzakelijk was voor de ontwikkeling van menselijke NCC in vitro. Ten slotte hebben we patiëntvarianten getest in onze Xenopus model en vond de meerderheid functieverlies allelen. Onze bevindingen definiëren moleculaire mechanismen waarbij EMC1-disfunctie ziektefenotypes veroorzaakt door disfunctionele multipass-membraaneiwittopogenese.

Multipass-membraaneiwitten kruisen meerdere keren lipidedubbellagen met specifieke topologieën die essentieel zijn voor hun functie. De multipass-membraaneiwitten die een lumenale N-terminus bevatten, hebben het endoplasmatisch reticulum (ER) membraaneiwitcomplex (EMC) nodig om de energetische barrière te overwinnen die nodig is voor initiële topogenese en vliezige insertie. Meerdere a-helix-polypeptideketens stabiliseren de transmembraangebieden binnen het membraan. Deze α-helixketens en de eiwitdomeinen die zich intra- of extracellulair bevinden, stellen deze eiwitten in staat om gespecialiseerde signaaltransductie tussen cellen en hun omgeving uit te voeren.

De EMC is geconserveerd van gist tot gewervelde dieren en fungeert als een moleculaire chaperonne voor eiwitvouwing en membraaninsertie (1 – 3). In ongewervelde systemen is dit complex essentieel voor de juiste synthese, vouwing en lokalisatie van verschillende transmembraaneiwitten, waaronder acetylcholinereceptoren en rodopsine (4, 5). Bij mensen zijn de 10 subeenheden van de EMC (EMC 1-10) samen voldoende om multipass-transmembraaneiwitten direct in hun vliezige context in te voegen, een bevinding die is vastgesteld in zowel cellulaire als celvrije systemen (3, 6).

Interessant is dat genetici in studies van patiënten met verschillende aangeboren afwijkingen meerdere allelen van EMC1 (ER membraaneiwitcomplex subeenheid 1). Aanvankelijk werd een variant geïdentificeerd bij een patiënt met retinitis pigmentosa (7). Vervolgens zijn aanvullende mutaties geïdentificeerd in cohorten van jonge patiënten met gecombineerde neurologische, visuele en craniofaciale afwijkingen (8, 9). In trio exome sequencing studies van aangeboren hartafwijkingen (CHD), mutaties in EMC1 werden geassocieerd met cardiale pathologieën, voornamelijk aorta-uitstroomafwijkingen (10, 11). Van de vele varianten die zijn geïdentificeerd (aanvullend materiaal uit tabel 1 dat online beschikbaar is bij dit artikel https://doi.org/10.1172/JCI129308DS1), zijn de helft missense-mutaties waarbij de impact op de eiwitfunctie wordt voorspeld maar geen experimenteel bewijs van pathogeniteit heeft. Hiertoe is een gewerveld model voor EMC1-disfunctie cruciaal voor het vertalen van onze kennis van de EMC-functie naar een begrip van een ziektemechanisme dat kan leiden tot dergelijke gevarieerde fenotypes.

In onze high-throughput Xenopus tropicalis model, emc1 uitputting leidde tot meerdere fenotypes die betrekking hebben op de neurale lijstcel (NCC) lijn en andere fenotypes die onafhankelijk lijken van NCC's. NCC's zijn een multipotente populatie van cellen die uniek zijn voor gewervelde dieren en die vroeg in de ontwikkeling ontstaan. Deze cellen delamineren van de neurale plaatrand en migreren in stereotiepe patronen naar verschillende bestemmingen binnen het zich ontwikkelende embryo. NCC's differentiëren vervolgens in een groot aantal celtypen, waaronder chondrocyten, adipocyten, neuronen, glia en melanocyten, afhankelijk van hun micro-omgeving (12, 13). Decennia van onderzoek hebben een ingewikkeld genregulerend netwerk aan het licht gebracht dat de inductie, het onderhoud, de migratie en de daaropvolgende differentiatie van NCC's definieert (13-18). Botmorfogenetische eiwitten, fibroblastgroeifactoren en WNT's hebben een aangetoonde rol in meerdere stappen van NCC-functie door de expressie van neurale plaatgrensspecificaties (Msx1/2, Pax3/7, Dlx3/5) en neurale topspecificaties (Snail1/2) te reguleren. , Sox8/9/10, FoxD3, AP-2, Twist) die resulteren in de juiste migratie en differentiatie van deze unieke celpopulatie (19 – 24).

Hier demonstreren we dat uitputting van emc1 leidt tot NCC-disfunctie via de WNT-route. In overeenstemming met de fenotypes en defecten van de patiënt in de neurale lijst, Xenopus embryo's uitgeput emc1 craniofaciale afwijkingen en veranderingen in het uitstroomkanaal van het hart hebben. Onze gegevens zijn consistent met een model waarin: emc1 uitputting vermindert WNT-signalering, mogelijk via de Fzd-receptor die essentieel is voor NCC-ontwikkeling. We ontdekten ook een neurologische zwakte die te wijten kan zijn aan bijdragen van NCC's aan het perifere zenuwstelsel en/of verkeerd vouwen van de acetylcholinereceptor die essentieel is voor neurotransmissie. Ten slotte hebben we onze Xenopus model om aan te tonen dat de geïdentificeerde patiëntvarianten inderdaad pathogeen zijn om in de meeste gevallen te functioneren. Onze resultaten belichten de cellulaire en moleculaire basis voor fenotypes van menselijke ziekten als gevolg van EMC-disfunctie.

Craniocardiale fenotypes met emc1-uitputting. Van de structurele anomalieën bij patiënten met emc1 allelen, hart- en craniofaciale afwijkingen behoren tot de meest prominente (8, 10, 11). We probeerden te testen op fenokopie in Xenopus via emc1 uitputting. Xenopus is een ideaal model voor dit onderzoek omdat gendoseringen getitreerd kunnen worden om de gevolgen van winst en verlies van functie te testen. In het geval van hartontwikkeling, Xenopus heeft een septated atrium en cardiale trabeculaties, waardoor menselijke modellering dichterbij komt in vergelijking met andere aquatische modellen, en het is veel hogere doorvoer en minder duur dan zoogdiermodellen.

Om te beginnen hebben we getest of uitputting van emc1 het gebruik van morfolino-oligonucleotiden (MO's) veroorzaakte hartdysmorfologie die verband zou kunnen houden met de fenotypes die worden gezien bij CHD-patiënten met emc1 mutaties. Opmerkelijk was dat morphant-embryo's smallere cardiale uitstroomkanalen hadden in vergelijking met controles (Figuur 1A). Met behulp van optische coherentietomografie, een beeldvormingsmodaliteit vergelijkbaar met echografie, maar met behulp van licht in plaats van geluid (25, 26), konden we gemakkelijk een verandering in de diameter van het uitstroomkanaal detecteren van 120 m (N = 19, SD = 12 m) in controle-embryo's tot 90 m (N = 21, SD = 16 m) in emc1 morphanten.

Fenotypische beoordeling van EMC1 functieverlies in Xenopus onthult craniofaciale en cardiale dysmorfologie. 1-celstadium embryo's werden geïnjecteerd met ofwel standaard controle MO of emc1 MO en fenotypisch beoordeeld in stadium 45. (EEN) Representatieve afbeeldingen en metingen van 3 replica's van fase 45 controle MO (N = 19) en emc1 MO (N = 21) morfologie van de uitstroom van embryo's afgebeeld met OCT-beeldvorming (gele stippellijn geeft de gemeten diameter aan). Schaalbalk: 100 m. (B) Representatieve afbeeldingen en percentages van 3 replica's van fase 45 controle MO (N = 62) en emc1 MO (N = 55) embryo craniofaciaal kraakbeen gekleurd met Alcian-blauw. Schaalbalk: 250 m. (C) Immunoblot van gepoolde (N = 20) EMC1-eiwit onder controle en emc1 knock-out/knockdown-embryo's. (NS) Immunoblot van gepoolde (N = 20) EMC1-eiwit in emc1 knockdown en EMC1 gered emc1 knock-down embryo's. ****P < 0,0001, ***P < 0,0005 door (EEN) Student t testen of (B) Fisher's exact-test. Balken geven gemiddelde en SD aan.

Vervolgens hebben we de craniofaciale morfologie onderzocht. Met behulp van Alcian-blauw, dat de kraakbeenelementen van de kop van het kikkervisje kleurt, ontdekten we een opvallend tekort in het craniofaciale skelet. Elk element van het craniofaciale kraakbeen - mandibulaire, hyoid- en branchiale kraakbeenelementen - leek in 87% gelijkelijk verloren te gaan (N = 55, SD = 9%) van morphante embryo's vergeleken met slechts 7% (N = 62, SD = 2%) van de controles (Figuur 1B). Bovendien merkten we dat morphanten een abnormale pigmentcelmorfologie hadden (aanvullende figuur 1). We bevestigden deze opvallende fenotypische afwijkingen via fenokopie met een op CRISPR gebaseerde knock-out van emc1 (Aanvullende figuur 2A). We hebben de werkzaamheid van MO- en CRISPR-gebaseerde benaderingen beoordeeld door middel van immunoblotting voor eiwitniveaus in morphant en crispant embryo's in vergelijking met controles. Beide methoden verlaagden de EMC1-eiwitniveaus in vergelijking met controles (Figuur 1C). We hebben ook de specificiteit van het anti-Emc1-antilichaam getest door wildtype humane co-injectie te geven EMC1 mRNA samen met de MO en het aantonen van een toename van het signaal via immunoblot (Figuur 2D). De werkzaamheid van CRISPR werd ook bevestigd door het beoordelen van de indels die in individuele F0-mutanten waren geïntroduceerd door middel van Sanger-sequencing en het volgen van indels door decompositie (TIDE) -analyse (referentie 27 en aanvullende figuur 2B). Gezien fenotypes in het uitstroomkanaal van het hart, craniofaciale kraakbeen en pigmentcellen, beschouwden we NCC's als een mogelijke verenigende verklaring voor de afwijkingen in elk van deze weefsels op basis van hun bekende bijdragen (28-30).

emc1 uitputting resulteert in afwijkingen in de genexpressie van de neurale lijst vroeg in de ontwikkeling. Embryo's werden geïnjecteerd in 1 cel in het 2-celstadium met emc1 MO gevolgd door ondervraging van neurale lijstmarkers via WISH. (EEN) WENS voor markers van NCC-cellijn onthulde dat expressie van eerdere markers (pax3, slak2, en sox9) was aanwezig in de verwachte ontwikkelingsstadia (stadia 16 en 20 getoond) maar vertoonde een abnormale verdeling de latere marker sox10 was bijna helemaal verloren (N = 45 per marker per fase gedaan in 3 replica's geïnjecteerde helften van embryo's aangegeven met sterretjes). Schaalbalk: 500 m. (B) Schematische voorstelling van de experimentele opstelling, waarbij injectie van MO in 1 cel van een 2-cellig embryo het mogelijk maakte dat 1 kant van het embryo zich ontwikkelde onder de effecten van de MO-injectie, de andere helft diende als een interne controle voor ontwikkelingsfenotypes. (C) Markers vertoonden een abnormale distributie in latere stadia (stadium 24 getoond), wat wijst op een verkeerd patroon van het embryonale rostrum (N = 45 per marker per fase gedaan in 3 herhalingen). Schaalbalk: 500 m.

emc1 is essentieel voor NCC's. Na neurulatie delamineren NCC's van de neurale plaatrand en ondergaan ze een uitgebreid migratiepatroon als reactie op omgevingssignalen. Nadat ze op hun juiste locaties zijn aangekomen, kunnen ze differentiëren tot een buitengewone reeks celtypen, inclusief de cellen die zijn aangetast in onze cellen Xenopus emc1 uitputtingsmodel. Om NCC's op verschillende tijdstippen in ontwikkeling te beoordelen, hebben we hele mount in situ hybridisatie (WISH) gebruikt om een ​​reeks NCC-markers te evalueren die de vorming van neurale plaatranden, NCC-specificatie en NCC-migratie definiëren. Voor deze experimenten hebben we gebruik gemaakt van een voordeel van Xenopus waarbij injectie van 1 cel in het 2-cellige stadium kan leiden tot targeting van ofwel de linker- of rechterkant van het embryo, waardoor de niet-aangetaste kant wordt verschaft als een interne controle die gemakkelijk kan worden vastgesteld door fluorescerende tracers samen te injecteren. Op deze manier raakten we uitgeput emc1 en onderzocht vroege markers van de neurale plaatrand en NCC's die aanwezig leken te zijn in de verwachte ontwikkelingsstadia (Figuur 2). Hoewel NCC-markers aanwezig waren, waren er duidelijke afwijkingen, waaronder een verminderd signaal. Indrukwekkend, in de fasen 16 en 20, sox10 werd drastisch verminderd (Figuur 2A). In latere stadia, sox10 leek te herstellen, hoewel er duidelijke verschillen bleven tussen emc1-uitgeput en controle kanten. Om te evalueren of het vroege verlies van NCC-markers te wijten zou kunnen zijn aan een toename van celdood, hebben we TUNEL gebruikt (aanvullende figuur 4). Controle MO en vergelijken emc1 MO-embryo's geïnjecteerd in 1 cel in het 2-celstadium, we hebben geen significant verschil in positieve TUNEL gedetecteerd buiten de algemene variabiliteit die wordt waargenomen bij celdood in embryo's. We detecteerden TUNEL in de dorsale middellijn zoals eerder beschreven (31), en een positieve controle, nup85, leidde tot een duidelijke toename van het TUNEL-signaal. Ons vorige werk suggereerde dat de nucleoporine gecodeerd door nup85 is belangrijk voor het voortbestaan ​​van een subset van celtypen (32). Uit deze studies concluderen we dat NCC-specificatie, onderhoud, migratie en differentiatie zijn veranderd in emc1-uitgeputte embryo's.

emc1-uitputting beïnvloedt WNT-signalering. Vooral de EMC en EMC1 zijn essentieel voor talrijke multipass-transmembraaneiwitten, daarom is het onzeker welke doeleiwitten de ontwikkeling van de neurale lijst beïnvloeden. Om een ​​potentieel doelwit te identificeren, hebben we een onbevooroordeelde benadering gekozen om het wereldwijde landschap van eiwitten in emc1 morphante embryo's vergeleken met controles. We hebben labelvrije kwantitatieve massaspectrometrie (LFQMS) van eiwitlysaten uit stadium 24 uitgevoerd emc1 morphanten en controles, en detecteerden veel veranderingen in eiwitniveaus die overeenkwamen met belangrijke ontwikkelingsprocessen. Met behulp van routeanalyse werden WNT-, integrine- en cadherine-signalering verminderd in emc1 morphant embryo's vergeleken met controles (Figuur 3, A en B en aanvullende tabel 2). In het bijzonder werden we getroffen door de afname van β-catenine in deze dataset omdat β-catenine dient als de intracellulaire boodschapper voor canonieke WNT-signalering (33, 34). Aangezien de WNT-route een belangrijke rol speelt bij de activering en instandhouding van factoren die nodig zijn voor de ontwikkeling van NCC (35-37), hebben we geprobeerd deze route te onderzoeken in embryo's die verarmd zijn aan emc1. Om dit te bereiken, hebben we eerst de WNT-respons beoordeeld in de Xtr.Tg(WntREs:dEGFP) Vlemx transgene lijn, die 7 kopieën heeft van een TCF/LEF1-DNA-bindingssequentie die GFP-expressie aanstuurt (38, 39). De neurale buis heeft in vroege stadia een sterke WNT-activiteit en wordt gemakkelijk gescoord voor GFP-expressie in onze 1 of 2 celgeïnjecteerde embryo's (40). In de helft van de neurale buis uitgeput van emc1, was er een duidelijke afname van het WNT-responsieve GFP-signaal (Figuur 3C). Vervolgens hebben we β-catenine-niveaus en nucleaire / cytoplasmatische lokalisatie van β-catenine getest. In de WNT-route zijn zowel β-catenine-niveaus als de nucleaire translocatie van β-catenine essentieel voor signaaltransductie. Om β-catenine in cellen te visualiseren, hebben we exogeen een GFP-gelabeld β-catenine ratiometrisch geleverd met een NLS-mCherry en de relatieve hoeveelheid GFP versus mCherry-signaal en de relatieve nucleaire lokalisatie van β-catenine en NLS-mCherry vergeleken. We zagen een milde verlaging van de nucleaire/cytoplasmatische verhouding van β-catenine, maar we ontdekten een dramatische verlaging van het totale GFP-signaal in vergelijking met mCherry, wat suggereert dat de β-catenine-niveaus in het algemeen lager waren in emc1-verarmde embryo's, een resultaat dat consistent is met onze proteomics-gegevens (Figuur 3D). Uit deze gegevens concluderen we dat WNT-signalering in emc1-uitgeputte embryo's op basis van een reportergen-assay en een verlaging van de β-cateninespiegels waargenomen door onze onbevooroordeelde proteomics. Emc1 reguleert echter multipass-membraaneiwitten, dus we vermoedden dat de reductie in β-catenine indirect was. Hoewel een aantal multipass-membraaneiwitten belangrijk zijn voor de migratie van de neurale lijst (41 – 43), speelt een rol voor zowel NCC-migratie en WNT-signalering maakt de Frizzled (Fzd) -receptor een sterke kandidaat (44 – 46). Hoewel Fzd-eiwitten niet in onze proteomics-gegevensset verschenen, konden we Fzd2 identificeren als we de stringentie zouden verminderen, waardoor eiwitten konden worden geïdentificeerd op basis van slechts een enkel uniek peptide in plaats van 2 of meer unieke peptiden (Figuur 3A, zwarte stip). Dit kan te wijten zijn aan de relatief lage abundantie van de Fzd-eiwitten en overeenkomsten in peptidesequenties over de Fzds. We zagen een consistente vermindering van Fzd2 in onze proteomics-dataset, hoewel dit geen statistische significantie bereikte. Op basis van deze gegevens hebben we echter geprobeerd om Fzd-eiwitten zorgvuldiger te onderzoeken.

Proteomische analyse van emc1 knockdown onthult aangetaste ontwikkelingspaden, waaronder WNT-signalering. Eencellige embryo's werden geïnjecteerd met ofwel standaard controle MO of emc1 MO en LFQMS werden uitgevoerd op embryo's van stadium 24. (EEN) Plot van gemiddelde eiwitniveaus van 3 biologische replica's van 20 samengevoegd emc1 morphanten vergeleken met controle morphanten zoals bepaald via LFQMS (statistisch significant verhoogde eiwitten worden in groen weergegeven, statistisch significant verminderde eiwitten worden in rood weergegeven, Fzd2 wordt weergegeven als een zwarte stip omdat het alleen werd geïdentificeerd door één unieke peptidesequentie in tegenstelling tot de andere eiwitten in de grafiek). (B) Plot van genontologietermen voor statistisch significant verminderde eiwitten met menselijke homologen vertoont verrijking voor een subset van signaalroutes. (C) Representatief beeld en kwantificering van WNT-signalering gevisualiseerd in een transgene Xenopus WNT-reporterlijn als vergelijking tussen gemiddelde fluorescentie van emc1 MO-geïnjecteerde versus niet-geïnjecteerde zijden van de neurale buis (witte stippellijn toont de omtrek van de neurale buis en de scheiding tussen geïnjecteerde en niet-geïnjecteerde zijden). P, achterste A, voorste R, rechts L, links. Schaalbalk: 100 m. (NS) Representatief beeld en kwantificering van β-catenine subcellulaire lokalisatie gevisualiseerd in Xenopus neurale buizen als een vergelijking tussen emc1 MO-geïnjecteerde versus controle MO-geïnjecteerde embryo's genormaliseerd naar NLS-mCherry-lokalisatie. Statistisch significante eiwitveranderingen beoordeeld via ANOVA (EEN) met rode en groene punten die aangeven: P < 0,05. Schaalbalk: 10 m. ****P < 0,0001, *P < 0.05 door Student's paired t toets (C) en studenten t toets (NS). Balken geven gemiddelde en SD aan.

EMC1-uitputting beïnvloedt multipass-transmembraaneiwitten, waaronder Fzd. Bij WNT-signalering is de Fzd-receptor een multipass-transmembraaneiwit met een lumenaal N-uiteinde dat essentieel is voor het omzetten van signalen van het WNT-ligand naar het β-catenine-vernietigingscomplex dat leidt tot de stabilisatie van β-catenine. β-Catenine gaat vervolgens de kern binnen om WNT-responsieve genen te activeren (33, 34). Omdat onze onbevooroordeelde proteomics een effect op WNT-signalering suggereerden in de context van: emc1 uitputting, probeerden we de relatie tussen EMC1 en de Fzd-receptor te bepalen. wij zijn uitgeput EMC1 in hTERT retinale gepigmenteerde epitheliale (RPE) cellen met behulp van siRNA en de lokalisatie van FZD2 en FZD7 door immunofluorescentie bepaald. Vergeleken met controle-siRNA-getransfecteerde RPE-cellen, EMC1 met siRNA getransfecteerde cellen hadden een gewijzigde puntvormige lokalisatie van FZD2 en FZD7 die deed denken aan eerder waargenomen verkeerd gevouwen eiwitten in de context van EMC-verstoring (ref. 6 en figuur 4A). Dat hadden we ook verwacht emc1 uitputting zou moeten leiden tot misvouwing en mislokalisatie van extra multipass-transmembraaneiwitten. We merkten bijvoorbeeld op dat meerdere patiënten met emc1 allelen hadden visuele defecten, waaronder retinitis pigmentosa. Een oorzaak van retinitis pigmentosa zijn varianten in het rodopsine-gen, een multipass transmembraan G-eiwit-gekoppelde receptor die uitzonderlijk gevoelig is voor licht. In EMC1-verarmde cellen, rhodopsine-expressie verscheen als puncta in plaats van diffuus gelokaliseerd (Figuur 4A). Daarnaast hebben we ook de lokalisatie van de nicotine-acetylcholinereceptor (nAChR) getest, waarvan eerder is aangetoond dat deze wordt beïnvloed in ongewervelde modellen van EMC-uitputting (5). De disfunctie van deze receptor kan ook een dwingende reden zijn voor de neurologische zwakte die wordt waargenomen bij patiënten met: EMC1 varianten. In RPE-cellen zonder EMC1, nAChR bleek ook verkeerd gelokaliseerd te zijn (Figuur 4A).

Neerhalen van EMC1 in menselijke RPE-cellen en Xenopus beïnvloedt meerdere transmembraaneiwitten en embryomotiliteit en activeert ER-stress. (EEN) Immunofluorescentie-antilichaamlabeling van EMC1 onthulde een afname van de expressie ervan na EMC1 siRNA-behandeling in vergelijking met controle-siRNA-behandelingen. Multipass-membraaneiwitten (RHODOPSIN, nAChR, FZD2, FZD7) waren abnormaal gelokaliseerd (N = 10 velden met hoog vermogen per marker per conditie gedaan in 3 herhalingen). Schaalbalk: 20 m. (B) Monstersporen en meting van controlemorfant (N = 30) en emc1 morphant (N = 30) beweging van kikkervisjes gedurende 10 seconden na stimulatie (verschillende kleuren onderscheiden verschillende kikkervisjes) gedurende 3 herhalingen. (C) Etikettering van nAChR in de proximale staart van emc1-verarmd stadium 45 kikkervisjes vertoonden schaarse en minder intense expressie in vergelijking met controle-tegenhangers. Schaalbalk: 50 m. (NS) Splicing-assay voor: xbp1 in gepoold (N = 30 per voorwaarde) stadium 24 Xenopus embryo's vertoonden verhoogde splicing met emc1 MO-uitputting vergeleken met controle-embryo's herhaald in 4 biologische replica's. Behandeling met tunicamycine fungeerde als positieve controle. (E) Immunoblotting voor Fzd7 toonde vergelijkbare niveaus van Fzd7 in gepoolde (N = 30 per fase per conditie) emc1 morphanten vergeleken met controle morphanten in stadium 14, maar een duidelijke afname in niveaus in stadium 24. ***P < 0,0005 door studenten t toets. Balken geven gemiddelde en SD aan.

In de loop van onze experimenten merkten we zelfs op dat: Xenopus embryo's uitgeput emc1 bewoog niet zo krachtig als controle-kikkervisjes. Om dit te kwantificeren, hebben we de afstand gemeten die een kikkervisje bewoog na stimulatie met een dunne plastic pipetpunt. emc1 morphants bewogen aanzienlijk kortere afstanden dan hun op het podium afgestemde broers en zussen in de controlegroep (Figuur 4B). Om te testen of dit te wijten kan zijn aan abnormale lokalisatie van de nAChR in Xenopus, voerden we immunofluorescentie uit voor nAChR in kikkervisjesstaarten, waarbij we de locaties onderzochten waar spiercontractie-impulsen werden gegenereerd (Figuur 4C). In controle-embryo's was het nAChR-signaal een scherpe boog over de somitische spier, terwijl in emc1-uitgeputte embryo's, leek het nAChR-signaal zwakker en meer aaneengesloten. Uit deze resultaten concluderen we dat de nAChR-expressie was verminderd, wat bijdroeg aan de vermindering van neurologische spieractiviteit bij kikkervisjes die uitgeput waren van emc1.

Onze resultaten in mens en Xenopus cellen geven aan dat multipass-membraaneiwitten verkeerd waren gelokaliseerd en in hoeveelheid waren verminderd vanwege emc1 uitputting. Onder omstandigheden van ER-stress als gevolg van overmatige verkeerd gevouwen eiwitten, kan de ongevouwen eiwitrespons (UPR) leiden tot hun afbraak. In deze context wordt Ire1 (inositol-vereist enzym1) geactiveerd, en zijn ribonucleasefunctie leidt tot de atypische RNA-splitsing van xbp1. Dit lasproduct van xbp1 activeert ER-geassocieerde degradatie (ERAD) genen. Het testen van de alternatieve isovorm van xbp1 is een effectieve en eenvoudige manier om de activering van de UPR te testen die tot eiwitafbraak kan leiden. We voerden RT-PCR uit die een gebied flankeerde dat was uitgesneden in de atypische isovorm en vergeleken? emc1 morphants om embryo's te controleren (Figuur 4D). In morphant-embryo's ontdekten we een extra kortere PCR-band, vergelijkbaar met controle-embryo's die werden behandeld met tunicamycine die de UPR induceerde. Door deze PCR-producten uit te voeren op een capillaire gel, die een resolutie van één basenpaar heeft, konden we bevestigen dat het gesplitste product inderdaad was verhoogd in emc1 morphanten en met tunicamycine behandelde embryo's vergeleken met controles en de voorspelde verandering van 26 basenparen in PCR-productlengte (aanvullend figuur 3). Uit deze gegevens concluderen we dat: emc1-uitgeputte embryo's hadden een toename van de UPR die zou kunnen leiden tot de afbraak van multipass-transmembraaneiwitten via ERAD.

Om deze mogelijkheid te verifiëren, veronderstelden we dat als Fzd-eiwitten stroomafwaarts van verhoogde UPR-activiteit en daaropvolgende ERAD zouden worden afgebroken, het blokkeren van proteasomale afbraak die deze eiwitklaring medieert, zou resulteren in een retentie van anders verloren Fzd-eiwit. We hebben dit getest door MG132 te gebruiken om proteasomale afbraak te blokkeren en tegelijkertijd de eiwitsynthese te blokkeren om eventuele veranderingen die optreden via veranderingen in synthesesnelheden uit te sluiten. Hoewel Fzd2-niveaus in controlecellen relatief onveranderd bleven gedurende dit tijdsverloopexperiment, namen Fzd2-niveaus toe tijdens proteasomale blokkade wanneer emc1 was uitgeput, wat verder suggereert dat de UPR en stroomafwaartse ERAD zouden kunnen functioneren om verkeerd gevouwen Fzd te wissen (aanvullende figuur 5). Bovendien, terugkerend naar ons neurale topfenotype en WNT-signalering in Xenopus embryo's, zou de UPR moeten leiden tot verlaagde niveaus van de Fzd-receptor. Inderdaad, door Western blot was Fzd7-eiwit verminderd in fase 24 morphanten in vergelijking met controles (Figuur 4E). In dit geval hebben we gekeken naar Fzd7-niveaus omdat de rol van Fzd7 goed is gekarakteriseerd bij de ontwikkeling van NCC's (35).

Stroomafwaartse activering van WNT kan NCC-afwijkingen redden. Als de disfunctie die in de NCC's werd waargenomen voortkwam uit een vermindering van WNT-signalering, veronderstelden we dat het activeren van WNT-signalering stroomafwaarts van transmembraaneffectoren het verlies van de NCC-marker zou moeten redden sox10 in emc1 morphante embryo's. We hebben dit getest door injectie van mRNA dat codeert voor β-catenine waaraan een nucleair lokalisatiesignaal was toegevoegd (47). Overmatige activering van WNT-signalering veroorzaakt de vorming van een tweede as (waardoor 2-koppige embryo's worden gecreëerd). Daarom hebben we de dosis mRNA getitreerd om dit effect te minimaliseren terwijl we probeerden de emc1 uitputtings fenotype. In 40% (N = 45, SD = 9%) van embryo's gecoïnjecteerd met emc1 MO en NLS-β-catenine mRNA, hebben we gedetecteerd sox10 expressie vergeleken met 7% (N = 45, SD = 7%) van degenen die zijn geïnjecteerd met emc1 MO alleen (Figuur 5). Als alternatieve strategie hebben we ook de CHIR 99021 GSK3β-remmer gebruikt, die afbraak van β-catenine voorkomt en de WNT-route stroomafwaarts van de Fzd-receptor activeert. In emc1 morphant embryo's geïncubeerd van stadium 12 tot 14 in media die CHIR 99021 bevatten, ontdekten we een robuuste expressie van sox10 op 33% (N = 30, SD = 6%) van embryo's in tegenstelling tot 11% (N = 45, SD = 3%) van emc1 morphant embryo's geïncubeerd van stadium 12 tot 14 in DMSO-bevattende media als controle (Figuur 5).

Neurale crest marker-expressie gered in emc1 morphanten door β-catenine te moduleren. Uitdrukking van sox10 in controle MO-geïnjecteerde embryo's die waren grootgebracht in media die DMSO bevatten, vertoonden stereotiepe expressie van deze marker in stadium 20 verlies van sox10 expressie in stadium 20 embryo's werd waargenomen na injectie met emc1 MO. sox10 expressie werd gedeeltelijk gered door injectie van NLS-gefuseerd β-catenine-mRNA of de kleinmoleculaire GSK3β-remmer CHIR 99021. Voor elke aandoening werden drie replica's van 15 embryo's geanalyseerd. Schaalbalk: 500 m.

Door mensen afgeleide NCC's hebben EMC1 nodig voor een goede ontwikkeling. Onze resultaten geven aan dat uitputting van emc1 leidt tot disfunctie van de EMC en het verkeerd vouwen van multipass-transmembraaneiwitten, waardoor de UPR en eiwitafbraak worden geactiveerd. In het geval van de neurale lijst leidt verminderde WNT-signalering tot de ontregeling van NCC's in Xenopus. Om onze bevindingen verder te relateren aan Xenopus om menselijke pathologieën te observeren, probeerden we onze bevindingen te vertalen naar een menselijk celmodel.

Van menselijke embryonale stamcellen afgeleide (hESC-afgeleide) NCC's zijn onlangs naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel voor het modelleren van NCC-specificatie en -functie (48). Dit menselijke NCC-model biedt gesynchroniseerde NCC-ontwikkeling, waardoor we de menselijke NCC-biologie kunnen beoordelen en onze inzichten in ziektemechanismen in een menselijk systeem direct kunnen testen. Bovendien recapituleert dit model getrouw de NCC-ontwikkeling zoals waargenomen in meerdere organismen, inclusief de hiërarchische expressie van genen tijdens de vorming van de neurale lijst, evenals de vereiste van WNT / β-catenine-signalering bij NCC-inductie (49 - 53). We gebruikten een aangepaste versie van het standaardprotocol (48), dat een tijdelijke WNT-activering biedt (2 dagen CHIR 99021-behandeling) in de beginfase van 5 dagen kweken (Figuur 6A en ref. 54). Als eerste stap hebben we de expressie van EMC1 in dit model gekarakteriseerd via qPCR. We ontdekten dat EMC1-expressie aanwezig bleef tijdens WNT-activering en werd gehandhaafd in hNCC's (aanvullende figuur 6). Om de moleculaire gebeurtenissen te beoordelen die door EMC1 worden gereguleerd tijdens de vorming van menselijke neurale kammen, gebruikten we siRNA-gemedieerde knockdown van EMC1 en volgde meerdere markers geassocieerd met de progressie van hESC naar hNCC.

Effecten van EMC1 uitputting in van menselijke embryonale stamcellen afgeleide NCC's. (EEN) Schematische voorstelling van het inductieprotocol dat werd gebruikt om hNCC's te genereren waarin hESC's gedurende 2 dagen werden blootgesteld aan CHIR 99021 in serumvrij medium voordat dit middel werd stopgezet en de kweek gedurende 3 extra dagen werd voortgezet. (B) Immunofluorescentie-antilichaamkleuring voor NCC-markers PAX7 en SOX10 op dag 5 in EMC1 siRNA-behandelde cellen in vergelijking met controle-siRNA-behandelde cellen uitgevoerd in 2 afzonderlijke biologische replica's. Schaalbalk: 100 m. (C) qPCR-analyse op dag 2 en dag 5 toonde een afname in transcripten van EMC1 uitgevoerd in 2 afzonderlijke biologische replica's. (NS) qPCR-analyse op dag 5 uitgevoerd in 2 afzonderlijke biologische replica's toonde verminderde niveaus van verschillende NCC-markertranscripten (PAX7, SNAI2, SOX9, FOXD3, SOX10), hoewel andere markers onaangetast leken te zijn (PAX3). (E) Gekwantificeerd percentage cellen dat elk PAX7- en SOX10-eiwit tot expressie brengt, uitgevoerd in 2 afzonderlijke biologische replica's.

Eerst hebben we de knockdown-efficiëntie van EMC1 siRNA via immunofluorescentie en qPCR na de eerste 2 dagen en vervolgens aan het einde van de 5-daagse cultuur (Figuur 6C en Aanvullende Figuur 7, A en B). We bevestigden verder het verlies van FZD7 in deze cellen door immunofluorescentie (aanvullende figuur 7, A en B). Vervolgens hebben we de expressie van PAX7 en SOX10 beoordeeld met behulp van immunofluorescentie aan het einde van het hNCC-differentiatieprotocol (Figuur 6, B en E). Zowel PAX7 als SOX10 leken merkbaar verminderd in de EMC1 siRNA-monsters vergeleken met controle-siRNA. Een groot deel van de cellen bracht nog steeds PAX7 tot expressie, hoewel op een schijnbaar veel lager niveau. In plaats daarvan bleek SOX10 in zeer weinig cellen tot expressie te worden gebracht (Figuur 6, B en E). Om onze analyse uit te breiden tot een bredere verzameling NCC-markers, hebben we RT-qPCR uitgevoerd voor PAX3, PAX7, SNAI2, SOX9, FOXD3, en SOX10 op dag 5 monsters behandeld met controle of EMC1 siRNA's (Figuur 6D). De mRNA-expressie van PAX3 leek onaangetast, en dat van PAX7 bleek slechts in geringe mate te worden verminderd door behandeling met EMC1-siRNA. Een sterker effect werd gezien voor de mRNA-expressie van de NCC-markers SNAI2, SOX9, FOXD3, en SOX10 in EMC1 siRNA-monsters. Deze resultaten geven aan dat EMC1 een cruciale rol speelt bij de ontwikkeling van de neurale lijst, van de expressie van vroege markers, verwerving van volwassen markers, onderhoud en daaropvolgende differentiatie van eindweefsel.

Testen van pathogeniteit van patiëntvarianten. Met een plausibel pathogenesemechanisme dat consistent leek tussen: Xenopus en menselijke NCC-modellen, hoopten we de pathogeniteit van patiëntvarianten aan te pakken. Veel van de geïdentificeerde allelen voor EMC1 zijn missense met in silico voorspeld verlies van functie, en ons gewervelde diermodel biedt een platform om deze voorspellingen te testen. Eerder werk heeft een reeks allelen geïdentificeerd voor: EMC1 (Aanvullende tabel 1). Bij patiënten met CHD, voornamelijk bestaande uit afwijkingen van het cardiale uitstroomkanaal, waren alle varianten heterozygoot en missense. In het geval van skeletafwijkingen met neurologische ontwikkelingsstoornissen en/of gezichtsstoornissen droegen patiënten echter allemaal homozygote varianten, behalve in het geval waarin het allel voor EMC1 was weer een missense mutatie. Daarom testen op functieverlies van EMC1 allelen boden het potentieel om genotype-fenotype-correlaties te onthullen die van onschatbare waarde kunnen zijn voor de klinische interpretatie van variantbelasting bij patiënten. We wilden dus bepalen of pathogeniciteit kon worden getest in onze Xenopus model.

Om dit te bereiken, hebben we de expressie van getest sox10 als een marker van effecten op NCC's en kikkervisjesmotiliteit als een marker van een bredere neurologische ontwikkelingsfunctie. Voor NCC-beoordeling hebben we uitgeput emc1 door de embryo's via MO-gemedieerde knockdown in het 1-celstadium, en vervolgens geïntroduceerd ofwel wildtype mRNA of EMC1-variant mRNA in 1 van de 2 cellen in het 2-celstadium. We verwachtten dat het wildtype mRNA en varianten zonder functioneel nadeel het fenotype op 1 helft van het embryo zouden redden. Om een ​​splitsingsplaatsmutatie c1212+1G>A na te bootsen, hebben we onmiddellijk na exon 11 een stopcodon geïntroduceerd omdat experimenteel bewijs heeft gesuggereerd dat de variant c.1212+1G>A resulteert in voortijdige eiwitafknotting (9). De resterende mutatie op de splitsingsplaats (c.96-2A>T) werd niet getest omdat we niet succesvol waren in het bepalen van de resulterende verandering in transcript via conventionele in vitro methoden. Als alternatief hebben we voor de beoordeling van de motiliteit de emc1 MO met wildtype of EMC1-variant mRNA in embryo's in 1-celstadium. Voor beide assays bleek alleen mRNA van de wildtype- en c.1411G>C-variant consistent te redden sox10 expressie, beweging van kikkervisjes (Figuur 7) en het nAChR-signaal binnen de neuromusculaire kruispunten van kikkervisjesstaarten (aanvullende figuur 8). Op basis van dit resultaat zouden we voorspellen dat het c.1411G>C-allel zijn functie behoudt of een relatief mild allel vertegenwoordigt in vergelijking met de andere. Interessant is dat het patiëntenfenotype met dit allel hierin niet opmerkelijk verschilde van andere patiënten EMC1 cohort, maar onze resultaten suggereren dat andere allelen het onderzoeken waard kunnen zijn om het ziektefenotype te verklaren. Ten slotte lijkt het erop dat er een genotype-fenotype-correlatie kan bestaan ​​​​waar samengestelde heterozygotie leidt tot afwijkingen van het skelet en neurologische ontwikkeling en heterozygotie leidt tot CHD, een hypothese die het waard is om te testen als extra allelen worden geïdentificeerd.

Xenopus model van emc1 functieverlies biedt een platform voor het testen van de pathogeniteit van patiëntenvarianten. Injectie van wildtype EMC1 mRNA en in mindere mate p.Gly471Arg (c.1411G>C) variant mRNA hersteld sox10 uitdrukking en beweging van het kikkervisje in emc1-uitgeputte embryo's, terwijl het mRNA van alle andere varianten dat niet deed. (EEN) Representatieve afbeeldingen en percentages embryo's met sox10 expressie na injectie met emc1 MO in het 1-celstadium gevolgd door injectie met wildtype (N = 31) of variant EMC1 mRNA (N = 31 voor Y23*, 29 voor T82M, 20 voor R105*, 31 voor A144T, 30 voor R404*, 29 voor G471R, 28 voor G868R, 25 voor P874Rfs en 31 voor R881C) in 1 cel van de 2-cellige fase meer dan 3 biologische replica's (geïnjecteerde helften van embryo's zijn aangegeven met asterisken). Schaalbalk: 500 m. (B) Schematisch diagram van EMC1-eiwit met domeinannotaties en locaties en effecten van patiëntvarianten. CHD, congenitale hartziekte GDD, globale ontwikkelingsachterstand VIS, visusstoornis PQQ2, pyrrolo-quinoline-chinon-redox-co-enzymdomein DUF, domein met onbekende functie. (C) Meting van de beweeglijkheid van kikkervisjes na co-injectie met emc1 MO en wildtype (N = 15) of variant EMC1 mRNA (N = 15 voor Y23*, 15 voor T82M, 9 voor R105*, 9 voor A144T, 9 voor R404*, 8 voor G471R, 10 voor G868R, 16 voor P874Rfs en 12 voor R881C) in het 1-celstadium over 3 biologische replica's . ANOVA P waarden werden berekend als een vergelijking van nep-injectie met alle andere groepen (EEN) en MO alleen voor alle andere groepen (C). ****P < 0,0001, ***P < 0,0005, **P < 0,005, *P < 0,05 door post hoc Tukey's test van meerdere vergelijkingen van nep-injectie met alle andere groepen (EEN) en MO alleen voor alle andere emc1 MO-geïnjecteerde groepen (C). Balken geven gemiddelde en SD aan.

Het belang van EMC1 op de menselijke gezondheid is vastgesteld door de meerdere allelen die zijn geïdentificeerd bij patiënten met de ziekte. Ook heeft de EMC een gevestigde rol bij de synthese, vouwing en insertie van multipass-membraaneiwitten in celmembranen. Een verband tussen deze bevindingen ontbrak echter. Gezien de veelheid aan multipass-transmembraaneiwitten die afhankelijk zijn van de EMC, zou men kunnen verwachten dat EMC-disfunctie zou leiden tot zeer vroege embryonale letaliteit in plaats van specifieke aangeboren misvormingen. Meerdere menselijke genetische studies hebben echter weefselspecifieke menselijke ziekten in verband gebracht met eiwitten die anders essentieel zijn voor basale celbiologische processen (7-11). Ribosomopathieën leiden bijvoorbeeld tot craniofaciale fenotypes via disfunctie van de neurale lijst (55, 56). Nucleoporinedeficiënties kunnen leiden tot CHD of steroïdresistent nefrotisch syndroom (32, 57, 58). EMC1 is een aanvulling op deze (verre van uitgebreide) lijst van eiwitten die fundamenteel zijn voor de functie van elke cel, maar wanneer disfunctioneel kan leiden tot weefselspecifieke ziekten zoals retinitis pigmentosa, craniofaciale misvormingen, CHD en neurologische zwakte.

In onze zoektocht naar een mechanisme om deze fenotypes te verklaren, hebben we de craniofaciale en cardiale fenotypes van patiënten met EMC1 varianten in onze Xenopus model. We merkten ook een melanocytfenotype op, dat allemaal kon worden verklaard door de diverse cellulaire bijdragen van NCC's. Gelukkig ontdekten we opmerkelijke parallellen tussen onze Xenopus neurale lijstresultaten en ons menselijke NCC-model afgeleid van embryonale stamcellen. In beide gevallen leken vroege markers van NCC-ontwikkeling veranderd, en het onderhoud van deze cellen was duidelijk abnormaal wanneer EMC1 was uitgeput. In beide gevallen constateerden we een opvallende vermindering van sox10 expressie, die van cruciaal belang is voor de ontwikkeling van de neurale lijst (59, 60). Op basis van deze resultaten stellen we voor dat de craniofaciale en CHD-defecten die worden gezien bij patiënten met EMC1 varianten is te wijten aan fundamentele defecten in de ontwikkeling van de neurale lijst. Belangrijk is dat SOX10, naast het belang ervan bij de ontwikkeling van NCC, van cruciaal belang is voor latere proliferatie en differentiatie van Schwann-cellen en oligodendrocyten van het zenuwstelsel, die dienen voor het myeliniseren van neuronale axonen (59, 60). Bovendien hebben genetische studies bij mensen SOX10-functieverlies in verband gebracht met myelinopathieën die verschillende manifestaties hebben, mogelijk als gevolg van de specifieke locatie van mutaties in SOX10 ( 61 – 63 ). Een interessante mogelijkheid is dus een vergelijkbare bijdrage van SOX10-verlies bij patiënten met beschadiging EMC1 varianten, hoewel het onzeker is of dit via WNT-signalering of een ander mechanisme is. Hoewel van een dergelijke patiënt werd gemeld dat hij zenuwgeleidingsonderzoeken binnen de normale grenzen had (9), kan dit nog steeds een intrigerende weg zijn voor aanvullende onderzoeken.

Omdat meerdere multipass-membraaneiwitten nodig zijn voor NCC's, definiëren welke stroomopwaartse eiwitten ('s) NCC's beïnvloeden met EMC1 uitputting was verre van duidelijk. De strikte benadering van LFQMS is krachtig voor het identificeren van eiwitveranderingen, maar de vereiste dat eiwitten voldoende overvloedig aanwezig zijn om meerdere unieke peptidesequenties te vangen en eiwitidentiteit in deze methode toe te wijzen, maakt het moeilijk om veranderingen in eiwitten uit te sluiten die niet in de gegevens zijn weergegeven . Onze onbevooroordeelde benadering identificeerde de WNT-route en richtte onze studies op de Fzd-receptor als een sterke kandidaat, maar we kunnen bijdragen aan waargenomen fenotypen van andere multipass-membraaneiwitten niet uitsluiten (41, 42, 64-68). Interessant is dat WNT-signalering een rol speelt in meerdere embryologische functies, waaronder asvorming (69) en hoofdinductie (70), maar we zien deze fenotypes niet in emc1 morphanten. Dit kan te wijten zijn aan de timing. Fzd-eiwitniveaus zijn niet duidelijk verlaagd tot stadium 24, een tijdstip dat cruciaal is voor de ontwikkeling van de neurale lijst, maar te laat voor de vorming van de as of het hoofd. Of de duurzaamheid van Fzd-eiwit tot dit tijdstip te wijten is aan functionele maternale eiwitten of timing van de UPR, zal een interessante weg zijn voor toekomstig onderzoek. Hoewel we de bijdrage van andere Fzd-eiwitten niet kunnen uitsluiten, hebben we onze studies gericht op Fzd2 en Fzd7 vanwege de detectie van verlaagde Fzd2 over alle emc1 morphant LFQMS repliceert en de eerder geïdentificeerde rol in NCC-ontwikkeling (35). Maar bij het overwegen welke FZD-eiwitten het meest waarschijnlijk bijdragen aan ziektefenotypes stroomafwaarts van EMC1-functieverlies, zijn FZD2 en FZD7 waarschijnlijke kandidaten. Over de ontwikkelingsstadia geanalyseerd in onze emc1 verlies van functie Xenopus model, fzd2 en fzd7 zijn de meest uitgesproken fzds, wat kan wijzen op een bijzonder belang voor Fzd2 en Fzd7 in de kritische ontwikkelingssignalering die optreedt in deze ontwikkelingsstadia (71). Interessant is dat mutaties in FZD2 zijn geïmpliceerd als oorzaken van omodysplasie en Robinow-syndroom (72 – 74). De overlap in fenotypes van craniofaciale malformaties tussen patiënten met EMC1 en FZD2 varianten kunnen verder wijzen op het belang van FZD2-verlies stroomafwaarts van EMC-disfunctie, vooral met betrekking tot craniofaciale ontwikkeling.

Merk op dat onze LFQMS-pathway-analyse ook verrijkt was voor cadherine- en integrine-signalering. Deze routes kunnen afhankelijk zijn van WNT-signalering, maar hebben ook een gevestigde rol bij delaminatie en migratie van de neurale lijst (75). Daarom kan elk van deze 3 routes een rol hebben gespeeld bij de neurale lijstdefecten die worden gezien in onze Xenopus en menselijke NCC-modellen. Onze redding van sox10 expressie met β-catenine ondersteunt verder het belang van WNT-signalering in dit proces, maar cadherines en integrines zullen waarschijnlijk een belangrijke rol spelen in NCC-functie in de context van EMC1-disfunctie.

Hoewel onze onpartijdige aanpak zeer effectief was in het identificeren van een doelwit voor NCC's in emc1-uitgeputte embryo's, andere fenotypes zoals de visuele en zwakte fenotypes kunnen worden verklaard door duidelijke kandidaten. In het geval van retinitis pigmentosa was het multipass-transmembraaneiwit rhodopsine een duidelijke kandidaat, en onze resultaten gaven aan dat de lokalisatie van rodopsine werd beïnvloed in EMC1-verarmde RPE-cellen. We hebben een vergelijkbare bevinding gedaan voor nAChR, dat in combinatie met het neurale crest-fenotype de neurologische zwakte zou kunnen verklaren die wordt waargenomen bij patiënten en onze Xenopus model.

Samen zijn onze resultaten in Xenopus en menselijke embryonale stamcellen bieden plausibele mechanismen voor veel van de fenotypen die bij onze patiënten worden gezien. Dit heeft onmiddellijke gevolgen voor patiënten, omdat chemische WNT-activators sommige kunnen redden, maar het is onwaarschijnlijk dat ze al hun fenotypes zullen redden. Belangrijk is dat we ook een robuuste test hebben opgezet in Xenopus om uit te proberen EMC1 varianten voor pathogeniteit die kunnen helpen bij de toekomstige diagnostiek van patiëntallelen die niet duidelijk nadelig zijn voor de functie. In deze test leken alle, op één na, van de eerder beschreven varianten allelen met functieverlies te zijn wanneer ze in onze test werden getest Xenopus systeem. De uitzondering, het c.1411G>C-allel, bleek functioneel te zijn in onze redding van zowel de neurale lijst als de beweeglijkheid. Het klinische fenotype van de patiënt met het c.1411G>C-allel was consistent met dat van andere patiënten met EMC1 allelen, maar onze functionele testen zouden het behoud van functie voor deze variant suggereren. Hoewel het mogelijk is dat de effecten van deze variant subtieler zijn in de vroege ontwikkelingsstadia die in dit onderzoek zijn getest, werden bij deze patiënt andere zeldzame hemizygote en samengestelde heterozygote varianten geïdentificeerd. Sommige van deze varianten zijn mogelijk nog relevant voor de ziekte van patiënten en verdienen verder onderzoek. Bijvoorbeeld, de samengestelde heterozygote varianten die zijn geïdentificeerd in de URB1 gen beschreven bij deze patiënt zou de pathogene basis van de ziekte kunnen zijn. Deze resultaten benadrukken de noodzaak van functioneel testen van vermoedelijke ziekteveroorzakende varianten, en Xenopus biedt hiervoor een robuust en high-throughput platform. Interessant is dat als we het c1411G>C-allel buiten beschouwing laten, de wijze van overerving nauwer verband houdt met het fenotype van de ziekte. Patiënten heterozygoot voor EMC1 varianten hebben CHD, terwijl patiënten met homozygote varianten neuromusculaire en visuele stoornissen hebben.

Samenvattend geven onze resultaten aan dat verstoring van het EMC-complex ziekte bij de mens kan veroorzaken als gevolg van WNT-signaleringsdisfunctie in de neurale lijst. Dit resultaat wordt zowel ondersteund door onze high-throughput Xenopus model en ons menselijke NCC-model afgeleid van embryonale stamcellen. Bijkomende fenotypes van patiënten kunnen worden verklaard door de rol van de EMC op andere multipass-transmembraaneiwitten. We merken op dat onze proteomics-aanpak ook verrijkt is voor andere routes die ook kunnen leiden tot ziekten bij de mens, en aangezien er meer patiënten met EMC-varianten worden geïdentificeerd, kunnen deze routes een rijke weg bieden voor verder onderzoek.

Xenopus-houderij. XenopusTropicalis werden in eigen huis grootgebracht, gehuisvest en verzorgd. We induceerden ovulatie en verzamelden embryo's door in-vitrofertilisatie zoals eerder beschreven (76). Embryo's werden grootgebracht in 1/9MR + gentamicine. enscenering van Xenopus kikkervisjes werd uitgevoerd volgens Nieuwkoop en Faber (77).

Xenopus MO's, mRNA en CRISPR. Met behulp van standaardprotocollen injecteerden we MO (emc1: 5′-ATGCCTTTGCTCAATTTGTTTCTGG-3′, controle: 5′-CCCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3′, Gene Tools), fluorescerende tracers en/of mRNA in 1- of 2-cels Xenopus embryo's, en geteste genexpressie door middel van WISH. We injecteerden 10 ng MO in 1-cel-stadium embryo's en 5 ng MO in 1 cel van een 2-cel-stadium embryo. We injecteerden 100 pg mRNA voor β-catenine-GFP en NLS-mCherry lokalisatie en reddingsexperimenten. β-CateninGFP-mRNA werd gegenereerd uit Addgene-plasmide 16839 (47). NLS-ctnnb1-GFP werd gegenereerd uit Addgene-plasmide 16838 (47). NLS-mCherry mRNA werd gegenereerd uit Addgene-plasmide 49313 (78). EMC1 mRNA werd gegenereerd uit NM_015047.3 in een pCSDest-ruggengraat. mRNA's werden gegenereerd met behulp van de SP6 mMessage-machinekit (Thermo Fisher Scientific) volgens de instructies van de fabrikant. Varianten werden gegenereerd met behulp van de Q5 Site-Directed Mutagenese Kit (New England BioLabs) volgens de instructies van de fabrikant. Voor op CRISPR gebaseerde experimenten, CRISPR/Cas9-gemedieerde genoombewerking in Xenopus tropicalis embryo's werden gebruikt zoals eerder beschreven (79). Een CRISPR-sgRNA gericht op exon 2 van emc1 gebaseerd op genmodel XM_018090190.1 werd ontworpen om F0-knockout-embryo's te genereren (5'-GGAGCGCAGCAGGCGGCCCC-3'). Voor gerichte experimenten met functieverlies werd 400 pg sgRNA samen met 1,6 ng Cas9 (CP03, PNA Bio) in een volume van 2 nl geïnjecteerd in embryo's in 1-celstadium. We kochten Xtr.Tg(WntREs:dEGFP) Vlemx Xenopus van de Nationale Xenopus Bron ( 38 ).

WENS. WISH werd uitgevoerd zoals eerder beschreven (80). Kort, Xenopus embryo's werden gefixeerd in 4% paraformaldehyde en gedehydrateerd door wassingen in methanol. Embryo's werden vervolgens opnieuw gehydrateerd in PBS met 0,1% tween-20. Embryo's werden vervolgens gehybridiseerd met met digoxigenine gemerkte RNA-probes die complementair waren aan doelwitgenen. Embryo's werden vervolgens gewassen en geblokkeerd voorafgaand aan incubatie met anti-DIG-Fab-fragmenten (Roche) 's nachts bij 4 graden.BM-paars (MilliporeSigma) werd gebruikt om expressie te visualiseren voorafgaand aan post-fixatie in 4% paraformaldehyde met 0, 1% glutaaraldehyde.

Optische coherentietomografie beeldvorming/metingen van cardiale uitstroomkanaal. Fase 45 Xenopus embryo's werden geïmmobiliseerd en afgebeeld met behulp van een Thorlabs Telesto 1325 nm spectraal domein-OCT-systeem. De cardiale 2D-dwarsdoorsnedebeelden werden verkregen als onderdeel van een volumetrische scan, waarvan de maximale diameter van het proximale uitstroomkanaal werd geïdentificeerd en gemeten met behulp van de geïntegreerde Thorlabs-software.

Hele berg Alcian blauwe kraakbeenkleuring. Fase 45-embryo's werden 48 uur bij kamertemperatuur gefixeerd in 100% ethanol en vervolgens kort gewassen in zure alcohol (1,2% HCl in 70% ETOH). Een 0,25% Alcianblauw-oplossing in zure alcohol werd gebruikt om de embryo's gedurende 48 uur bij kamertemperatuur te kleuren. Monsters werden vervolgens meerdere keren gewassen in zure alcohol, gerehydrateerd tot H2O, en gedurende 2 uur gebleekt in 1,2% waterstofperoxide onder helder (2500 lux) licht. Ze werden vervolgens verschillende keren gewassen in 2% KOH en overnacht geschud in 10% glycerol in 2% KOH. Monsters werden verwerkt tot 20%, 40%, 60% en 80% glycerol in 2% KOH.

Motiliteitstest. Kikkervisjes van stadium 45 werden afzonderlijk in putjes van een standaard kweekschaal met 48 putjes geplaatst. Voorafgaand aan de beeldvorming werden individuele putjes uitgelijnd voor video-opname en mochten kikkervisjes gedurende ten minste 5 minuten een rusttoestand bereiken. Kikkervisjes werden vervolgens voorzichtig geprikt met behulp van een capillaire pipetpunt. Video van de beweging van het kikkervisje werd meer dan 30 seconden na deze stimulatie vastgelegd. Video's werden verkregen met behulp van een Accu-Scope Excelis-camera die op een Nikon SMZ 745T-stereomicroscoop was gemonteerd. Video's werden geanalyseerd met Kinovea 0.8.15 (//www.kinovea.org/). De analyse bestond uit het markeren van een middelpunt van de kop van het kikkervisje in elk frame van een video van 30 seconden en dit uitzetten op een cirkelvormige kaart. De gemiddelde beweging werd bepaald via het converteren van gemarkeerde volgpunten naar vectoren en het meten van de som van deze vectoren gedurende de geregistreerde tijd van 30 seconden.

Proteomica. Xenopus embryo's werden geïnjecteerd met 10 ng controle MO of emc1 MO en liet men zich ontwikkelen tot stadium 24. Embryo's werden gehomogeniseerd in RIPA-buffer (MilliporeSigma) met behulp van een stamper. Lysaten werden gecentrifugeerd om embryonaal afval te verwijderen. Chloroform-methanol/water eiwitprecipitatie werd uitgevoerd om een ​​gedroogde eiwitpellet te winnen. Resuspensie en LFQMS werden uitgevoerd zoals eerder beschreven (81). LC-MS/MS-gegevens werden verwerkt met Progenesis QI Proteomics-software (Nonlinear Dynamics, versie 2.0) eiwitidentificatie werd uitgevoerd met behulp van het Mascot-zoekalgoritme. De proteomicsgegevens van massaspectrometrie zijn via de PRIDE-partnerrepository ( 82 ) bij het ProteomeXchange Consortium gedeponeerd met de gegevensset-ID PXD012770 en 10.6019/PXD012770.

Gen ontologie. Ontologie-analyse werd uitgevoerd met PANTHER (//www.pantherdb.org). De input was alle genen met menselijke orthologen waarvan het eiwitproduct statistisch significant was afgenomen in emc1 morphanten in vergelijking met controle-MO-geïnjecteerde embryo's. Ontologie-analyse werd beoordeeld op het niveau van padontologie.

siRNA-gemedieerde knockdown in RPE-cellen. hTERT RPE-1-cellen werden verkregen van ATCC. siRNA-gemedieerde knockdown werd uitgevoerd met behulp van Silencer Select siRNA gericht tegen EMC1 (Thermo Fisher Scientific, 4392420) of een controle-siRNA (Thermo Fisher Scientific, 4390843) getransfecteerd met RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) volgens de instructies van de fabrikant. Cellen werden gefixeerd voor beeldvorming, gelyseerd voor immunoblotting of 24 uur na transfectie blootgesteld aan remming op basis van kleine moleculen.

Splicing-assays voor de evaluatie van UPR. xbp1 splicing werd getest in embryo's van stadium 24 zoals eerder beschreven (83) met primers die zijn aangepast voor gebruik in Xenopus (5'-GACTGCTCGGGACAGGAAAA-3' en 5'-GCCCAACAAGAGATCAGACTCA-3'). Bovendien werden de methoden ook aangepast voor gebruik met fluorescent gelabelde 5'-primers voor fragmentanalyse zoals eerder beschreven (79).

TUNEL-kleuring. TUNEL-kleuring werd uitgevoerd zoals eerder beschreven (84) op embryo's die in het 2-celstadium in 1 van de 2 cellen waren geïnjecteerd.

Immunofluorescentie en microscopie voor Xenopus- en RPE-celkweek. Voor Xenopus en RPE-cellen werden monsters eerst kort gepermeabiliseerd met 0,1% tween-20 gevolgd door fixatie in 4% PFA. Monsters werden gemonteerd in Prolong Glass (Thermo Fisher Scientific). Immunogekleurde cellen of embryo's werden afgebeeld op ofwel een Zeiss Observer uitgerust met optische interferentie (Apotome) microscopie (Figuur 4C en Aanvullende Figuur 8) of een Zeiss LSM880 confocale microscoop (Figuur 3, C en D en Figuur 4A). Antilichamen worden vermeld in aanvullende tabel 3. Fluorescerende beelden werden verwerkt en geanalyseerd met Fiji (85). Geheel gemonteerde, craniofaciale kraakbeen-, WISH- en TUNEL-gekleurde embryo's werden afgebeeld met een Canon EOS 5d digitale camera gemonteerd op een Zeiss discovery V8-stereomicroscoop.

Foto analyse. Alle fluorescerende microfoto's werden verwerkt en geanalyseerd met Fiji (85). Kwantificering van fluorescentie voor de WNT-responsassay werd uitgevoerd door de gemiddelde fluorescentie van afzonderlijke 10.000 m2-regio's binnen elke helft van de neurale buis tussen geïnjecteerde en niet-geïnjecteerde zijden van het embryo te vergelijken. Kwantificering van de nucleaire tot cytoplasmatische verhouding van β-catenine-GFP werd beoordeeld door de grenzen van kernen handmatig af te bakenen en de signaalintensiteit per oppervlakte-eenheid te meten voor elke kern en cytoplasmatisch compartiment van 5 cellen per neurale buis. Deze meting werd genormaliseerd naar dezelfde meting die werd gedaan voor de lokalisatie van NLS-mCherry in dezelfde cellen. De fluorescentie-intensiteit van EMC1 en FZD7 in hNCC's werd bepaald door de totale signaalintensiteit te meten in velden met hoog vermogen van 45 m 2 en te delen door het aantal cellen in het veld zoals bepaald door verschillende kernen te tellen.

Immunoblot-analyse. Voor Xenopus en RPE-cellen, gepoolde embryo's of cellen werden gelyseerd in RIPA-buffer en immunoblots werden uitgevoerd met Bolt 4% -12% Bis-Tris plus-gels en loopbuffer (Thermo Fisher Scientific) met behulp van standaardmethoden (zie volledige onbewerkte blots in het aanvullende materiaal) .

Gebruik van remmers van kleine moleculen in Xenopus- en RPE-cellen. Om de GSK3β-functie te remmen tijdens de ontwikkeling in emc1 morphants, CHIR99021 (Tocris Bioscience) werd toegevoegd aan kweekmedia in een concentratie van 10 μM tussen stadia 10 en 20, op welk punt ze werden verzameld. Na transfectie van controle of EMC1 siRNA werden RPE-cellen onderworpen aan behandeling met cycloheximide (Cell Signaling) in de kweekmedia bij een concentratie van 25 mg/ml en/of MG132 (Sigma-Aldrich) behandeling in de kweekmedia bij een concentratie van 10 μM voorafgaand aan lysis. Om UPR-respons in embryo's te induceren, werden ze geïncubeerd in kweekmedia die tunicamycine (Sigma-Aldrich) bevatten in een concentratie van 2,5 mg/ml.

Neurale kam inductie. Menselijke embryonale stamcellen (WA01) werden verkregen van WiCell Research Institute, Inc. Voor neurale crest-inductie werden menselijke ESC/iPSC-kolonies behandeld met Accutase-celloslatingsoplossing (STEMCELL Technologies) en opnieuw gesuspendeerd in inductiemedium plus 3 μM CHIR 99021 en 10 μM ROCK remmer Y-27632 (Tocris Bioscience) uitgeplaat met een dichtheid van 20.000 cellen/cm2 op met Matrigel beklede oppervlakken. Inductiemedium bevatte DMEM/F12-medium aangevuld met 2% B27-supplement (Gibco), 1X Glutamax (Gibco) en 0,5% runderserumalbumine (wt/vol) (Sigma-Aldrich). CHIR 99021 en ROCK-remmer Y-27632 werden toegevoegd gedurende de eerste 2 dagen inductiemedia werden gebruikt zonder CHIR 99021 en ROCK-remmer gedurende de volgende 3 dagen.

siRNA-gemedieerde knockdown in menselijke ES/NC-cellen. siRNA-gemedieerde knockdown werd uitgevoerd met behulp van SMART Pool siRNA voor EMC1 (Dharmacon, catalogusnr. L-014146-01) met RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, catalogusnr. 13778075). Omgekeerde transfectie werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. In het kort werden hES-cellen uitgeplaat in NC-inductiemedia zoals hierboven beschreven in een plaat met 96 putjes die vooraf was uitgeplaat met siRNA / RNAiMAX-mengsel. Voor elk putje werd 1,2 picomol siRNA gebruikt voor EMC1 SMART Pool en non-targeting controle siRNA (Thermo Fisher Scientific, catalogusnr. AM4611). Media werden na elke 24 uur verwisseld en cellen werden geoogst op dag 2 en dag 5 voor RNA-extractie en immunofluorescentie.

Genexpressieanalyse voor menselijke ES/NC-cellen. Totale RNA's werden geëxtraheerd met behulp van TRIzol-reagens / DirectZol-kit (Zymoresearch). Totaal RNA (0, 5-1 g) werd omgekeerd getranscribeerd met behulp van PrimeScript reverse transcriptase-kit (Takara / Clontech Laboratories). Kwantitatieve polymerasekettingreactie (QPCR) werd uitgevoerd met behulp van de SYBR Premix ExTaqII SYBR Green premix (Takara/Clontech Laboratories) op Applied Biosystems QuantStudio 6 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Er werd een primerconcentratie van 300 nM gebruikt. Voor statistische analyse werden voor elk experiment 2 biologische replica's gemeten met behulp van de ΔΔCT-methode ten opzichte van de met siRNA getransfecteerde celstatus en genormaliseerd naar RPL13 referentie gen. Primers worden vermeld in aanvullende tabel 3.

Immunofluorescentie voor hES/hNC-cellen en beeldverwerking en celtellingsanalyse voor hES- en hNC-cellen. Immunofluorescentie voor PAX7 en SOX10 werd uitgevoerd op cellen gekweekt in een plaat met 96 putjes zoals eerder beschreven (41). Beelden werden genomen met een Nikon Eclipse Ti omgekeerde microscoop onder dezelfde belichtingsinstellingen en geanalyseerd met Nikon Elements-software (Nikon). Beelden werden verwerkt in Adobe Photoshop en gelijktijdig aangepast. Nikon Elements-software (met algemene analyse) (Nikon) werd gebruikt voor celtellingen en celintensiteitsanalyse. Voor analyse van het aantal cellen, onder algemene analyse, werd de detectiemethode voor heldere vlekken gebruikt, met een geclusterde objectparameter, met variabele objectgroottes (cel) afhankelijk van het monster, handmatig bepaald voor elk monster om elke cel in het beeld onder elk kanaal te detecteren. Elk experiment werd uitgevoerd in 2 biologische replica's. Immunofluorescentie voor EMC1 en FZD7 werd uitgevoerd op cellen gekweekt in objectglaasjes met 4 of 8 putjes (Thermo Fisher Scientific) en gemonteerd in Prolong Glass (Thermo Fisher Scientific). Beelden werden verkregen met behulp van een Zeiss LSM880 confocale microscoop. Fluorescerende beelden werden verwerkt en geanalyseerd met Fiji (85). Elk experiment werd uitgevoerd in 3 biologische replica's. Antilichamen worden vermeld in aanvullende tabel 3.

Statistieken. De statistische significantie van afwijkingen werd getest met behulp van Fisher's exact-tests voor vergelijking van percentages kikkervisjes die een bepaald fenotype vertonen, 2-tailed Student's t tests (gepaard of ongepaard) voor vergelijking van gemeten hoeveelheden, of 1-way ANOVA met post hoc Tukey's test voor meerdere vergelijkingen in GraphPad Prism 8.2.1. Correctie voor meerdere vergelijkingen werd bereikt door voor multipliciteit gecorrigeerde te berekenen P waarden als onderdeel van de post-hoc Tukey-test. P waarden kleiner dan 0,05 werden als significant beschouwd.

Studie goedkeuring. Al onze experimenten met Xenopus tropicalis werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Yale University in New Haven, Connecticut.

JM, JC en MKK bedachten en ontwierpen experimenten, presenteerden en analyseerden gegevens van elk van de experimenten. JM, JC en EKM presteerden allemaal Xenopus experimenten. RMC, MSP en MIGC bedachten, ontwierpen, voerden en analyseerden experimenten in menselijke embryonale stamcellen. JM en WYH voerden celkweekexperimenten uit in RPE-cellen. JM en JC analyseerden gegevens met MKK. Het manuscript is geschreven door JM en MKK. Alle auteurs hebben het manuscript kritisch beoordeeld.

We danken de patiënten en hun families die de inspiratie vormden voor deze studie. We willen ook Michael Slocum en Sarah Kubek bedanken voor het houden van dieren. We zijn de National Xenopus Resource (RRID:SCR_013731) dankbaar voor het verstrekken van de Xtr.Tg(WntREs:dEGFP) Vlemx (NXR_1094) transgene lijn. Dit werk was mogelijk dankzij de bronnen en analyses die werden geleverd door de Discovery Proteomics Core van Yale. We zijn schatplichtig aan de Yale CCMI-kern voor bronnen voor fluorescentiemicroscopie. JM en WYH werden ondersteund door de Yale MSTP NIH T32GM07205 Training Grant, het Yale Predoctoral Program in Cellular and Molecular Biology T32GM007223 Training Grant en de Paul and Daisy Soros Fellowship for New Americans. RMC wordt ondersteund door NIH F32DE027862. MSP en MIGC werden ondersteund door NIH R01DE017914. EKM wordt ondersteund door een subsidie ​​van de Hartwell Foundation en is een Hartwell Fellow. Dit werk werd ondersteund door de NIH R01HD081379 aan MKK. MKK was een Mallinckrodt-geleerde.

Belangenverstrengeling: De auteurs hebben verklaard dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.


Vroege hersenstructuur

Primaire blaasjes

  • rostrale neurale buis vormt 3 primaire hersenblaasjes (week 4)
  • 3 primaire blaasjes: prosencephalon (voorhersenen), mesencephalon (middenhersenen), rhombencephalon (achterhersenen)

Secundaire blaasjes

Van de 3 primaire blaasjes die zich ontwikkelen tot 5 secundaire blaasjes (week 5)

  • prosencephalon- telencephalon (eindhersenen, vormt hersenhelften), diencephalon (tussenhersenen, vormt optische uitgroei)
  • mesencephalon
  • rhombencephalon- metencephalon (achter de hersenen), myelencephalon (medullabrain)


Embryonale ontwikkeling relateren aan het volwassen brein

Embryonale ontwikkeling kan helpen bij het begrijpen van de structuur van het volwassen brein, omdat het een raamwerk vormt waarop complexere structuren kunnen worden gebouwd. Ten eerste bepaalt de neurale buis de anterieure-posterieure dimensie van het zenuwstelsel, die de wordt genoemd neuraxis. Van het embryonale zenuwstelsel bij zoogdieren kan worden gezegd dat het een standaardinrichting heeft. Mensen (en andere primaten, tot op zekere hoogte) maken dit gecompliceerd door op te staan ​​en op twee benen te lopen. De anterieur-posterieure dimensie van de neuraxis overlapt de superieure-inferieure dimensie van het lichaam. Er is echter een grote curve tussen de hersenstam en de voorhersenen, die de wordt genoemd cephalische buiging. Hierdoor begint de neuraxis in een lagere positie - het uiteinde van het ruggenmerg - en eindigt in een anterieure positie, de voorkant van de grote hersenen. Als dit verwarrend is, stel je dan een dier met vier poten voor dat op twee poten staat. Zonder de buiging in de hersenstam, en aan de bovenkant van de nek, zou dat dier recht omhoog kijken in plaats van recht naar voren (figuur 14.1.3).

Figuur 14.1.3 – Menselijke neuraxis: Het zenuwstelsel van zoogdieren is gerangschikt met de neurale buis die langs een voorste naar achterste as loopt, van neus tot staart voor een viervoetig dier zoals een hond. Mensen hebben, als tweebenige dieren, een bocht in de neuraxis tussen de hersenstam en het diencephalon, samen met een bocht in de nek, zodat de ogen en het gezicht naar voren gericht zijn.

Samengevat helpen de primaire blaasjes om de basisgebieden van het zenuwstelsel vast te stellen: voorhersenen, middenhersenen en achterhersenen. Deze divisies zijn nuttig in bepaalde situaties, maar het zijn geen gelijkwaardige regio's. De middenhersenen zijn klein in vergelijking met de achterhersenen en vooral de voorhersenen. De secundaire blaasjes gaan verder met het vaststellen van de belangrijkste regio's van het volwassen zenuwstelsel die in deze tekst zullen worden gevolgd. Het telencephalon is de grote hersenen, het grootste deel van het menselijk brein. Het diencephalon wordt nog steeds aangeduid met deze Griekse naam, omdat er geen betere term voor is (dia- = "door"). Het diencephalon bevindt zich tussen de grote hersenen en de rest van het zenuwstelsel en kan worden omschreven als het gebied waardoor alle uitsteeksels tussen de grote hersenen en al het andere moeten gaan. De hersenstam omvat de middenhersenen, pons en medulla, die overeenkomen met het mesencephalon, metencephalon en myelencephalon. Het cerebellum, dat een groot deel van de hersenen is, wordt als een apart gebied beschouwd. Tabel 14.1 verbindt de verschillende ontwikkelingsstadia met de volwassen structuren van het CZS.

Een ander voordeel van het overwegen van embryonale ontwikkeling is dat bepaalde verbindingen meer voor de hand liggen vanwege de manier waarop deze volwassen structuren met elkaar in verband staan. Het netvlies, dat begon als onderdeel van het diencephalon, is voornamelijk verbonden met het diencephalon. De ogen zijn net inferieur aan het voorste deel van de grote hersenen, maar de oogzenuw strekt zich terug naar de thalamus uit als het optische kanaal, met vertakkingen in een gebied van de hypothalamus. Er is ook een verbinding van het optische kanaal met de middenhersenen, maar het mesencephalon grenst aan het diencephalon, dus dat is niet moeilijk voor te stellen. Het cerebellum is afkomstig uit het metencephalon en de grootste verbinding met witte stof is naar de pons, ook van het metencephalon. Er zijn verbindingen tussen het cerebellum en zowel de medulla als de middenhersenen, die aangrenzende structuren zijn in het secundaire vesikelstadium van ontwikkeling. In het volwassen brein lijkt het cerebellum dicht bij het cerebrum, maar er is geen direct verband tussen.

Een ander aspect van de volwassen CZS-structuren dat verband houdt met de embryonale ontwikkeling, zijn de ventrikels - open ruimtes in het CZS waar hersenvocht circuleert. Ze zijn het overblijfsel van het holle centrum van de neurale buis. De vier ventrikels en de bijbehorende buisvormige ruimten kunnen worden teruggekoppeld naar het holle centrum van de embryonale hersenen (zie tabel 14.1).

Stadia van embryonale ontwikkeling (tabel 14.1)
neurale buis Primair blaasjesstadium Secundair blaasjesstadium Volwassen structuren ventrikels
Anterieure neurale buis Prosencephalon telencephalon grote hersenen Laterale ventrikels
Anterieure neurale buis Prosencephalon diencephalon diencephalon derde ventrikel
Anterieure neurale buis Mesencephalon Mesencephalon middenhersenen Cerebrale aquaduct
Anterieure neurale buis Rhombencephalon Metencephalon Pons kleine hersenen vierde ventrikel
Anterieure neurale buis Rhombencephalon Myelencephalon Merg vierde ventrikel
Posterieure neurale buis

Er zijn drie klassen van deze aandoening: occulta, meningocele en myelomeningocele (Figuur 14.1.4). Het eerste type, spina bifida occulta, is het mildst omdat de wervelbotten het ruggenmerg niet volledig omringen, maar het ruggenmerg zelf wordt niet aangetast. Er mogen geen functionele verschillen worden opgemerkt, wat het woord occulta betekent, het is verborgen spina bifida. De andere twee typen hebben beide betrekking op de vorming van een cyste - een met vocht gevulde zak van de bindweefsels die het ruggenmerg bedekken, de hersenvliezen. "Meningocele" betekent dat de hersenvliezen door de wervelkolom steken, maar dat de zenuwen mogelijk niet betrokken zijn en dat er weinig symptomen zijn, hoewel er later in het leven complicaties kunnen optreden. "Myelomeningocele" betekent dat de hersenvliezen uitsteken en spinale zenuwen zijn betrokken, en daarom kunnen ernstige neurologische symptomen aanwezig zijn.

Vaak is een operatie nodig om de opening te sluiten of de cyste te verwijderen. Hoe eerder die operatie kan worden uitgevoerd, hoe groter de kans om verdere schade of infectie bij de opening te beheersen of te beperken. Voor veel kinderen met meningocele zal een operatie de pijn verlichten, hoewel ze enig functioneel verlies kunnen ervaren.Omdat de myelomeningocele-vorm van spina bifida meer schade aan het zenuwweefsel met zich meebrengt, kan neurologische schade aanhouden, maar de symptomen kunnen vaak worden aangepakt. Complicaties van het ruggenmerg kunnen zich later in het leven voordoen, maar de algehele levensverwachting wordt niet verminderd.

Afbeelding 14.1.4 – Spinale bifida: (a) Spina bifida is een aangeboren afwijking van het ruggenmerg die wordt veroorzaakt wanneer de neurale buis niet volledig sluit, maar de rest van de ontwikkeling gaat door. Het resultaat is de opkomst van hersenvliezen en neuraal weefsel door de wervelkolom. (b) Foetale myelomeningocele is duidelijk te zien op deze echo die na 21 weken is genomen.

Externe website

Bekijk deze video om meer te weten te komen over de witte stof in de grote hersenen die zich ontwikkelt tijdens de kindertijd en adolescentie. Dit is een samenstelling van MRI-beelden die zijn gemaakt van de hersenen van mensen van 5 tot 20 jaar, die laten zien hoe de grote hersenen veranderen. Naarmate de kleur verandert in blauw, verandert de verhouding tussen grijze stof en witte stof. Het bijschrift van de video beschrijft het als 'minder grijze stof', wat een andere manier is om 'meer witte stof' te zeggen. Als de hersenen zich pas op ongeveer 20-jarige leeftijd ontwikkelen, kunnen tieners dan verantwoordelijk worden gehouden voor slecht gedrag?

Hoofdstukoverzicht

De ontwikkeling van het zenuwstelsel begint vroeg in de embryonale ontwikkeling. Uit de buitenste laag van het embryo, het ectoderm, ontstaan ​​de huid en het zenuwstelsel. Een gespecialiseerd gebied van deze laag, het neuroectoderm, wordt een groef die zich naar binnen vouwt en de neurale buis wordt onder het dorsale oppervlak van het embryo. Het voorste uiteinde van de neurale buis ontwikkelt zich tot de hersenen en het achterste gebied wordt het ruggenmerg. Weefsels aan de randen van de neurale groef, wanneer deze afsluit, worden de neurale lijst genoemd en migreren door het embryo om PNS-structuren te veroorzaken, evenals enkele niet-zenuwachtige weefsels.

De hersenen ontwikkelen zich vanuit deze vroege buisstructuur en geven aanleiding tot specifieke regio's van de volwassen hersenen. Naarmate de neurale buis groeit en differentieert, wordt deze groter tot drie blaasjes die overeenkomen met de voorhersenen, middenhersenen en achterhersenen van de volwassen hersenen. Later in de ontwikkeling differentiëren twee van deze drie blaasjes zich verder, wat resulteert in vijf blaasjes. Die vijf blaasjes kunnen worden uitgelijnd met de vier belangrijkste regio's van het volwassen brein. De grote hersenen worden direct gevormd uit het telencephalon. Het diencephalon is het enige gebied dat zijn embryonale naam behoudt. Het mesencephalon, metencephalon en myelencephalon worden de hersenstam. Het cerebellum ontwikkelt zich ook vanuit het metencephalon en is een apart gebied van de volwassen hersenen.

Het ruggenmerg ontwikkelt zich uit de rest van de neurale buis en behoudt de buisstructuur, waarbij het zenuwweefsel verdikt en het holle centrum een ​​heel klein centraal kanaal door het snoer wordt. De rest van het holle centrum van de neurale buis komt overeen met open ruimtes in de hersenen, de ventrikels genaamd, waar cerebrospinale vloeistof wordt gevonden.

Interactieve linkvragen

Bekijk deze animatie om de ontwikkeling van de hersenen te onderzoeken, te beginnen met de neurale buis. Naarmate het voorste uiteinde van de neurale buis zich ontwikkelt, breidt het zich uit tot de primaire blaasjes die de voorhersenen, middenhersenen en achterhersenen vormen. Die structuren blijven zich ontwikkelen gedurende de rest van de embryonale ontwikkeling en tot in de adolescentie. Ze vormen de basis van de structuur van het volledig ontwikkelde volwassen brein. Hoe zou u het verschil in de relatieve grootte van de drie hersengebieden beschrijven bij het vergelijken van de vroege (25e embryonale dag) hersenen en de volwassen hersenen?

De drie regio's (voorhersenen, middenhersenen en achterhersenen) lijken ongeveer even groot te zijn wanneer ze voor het eerst worden vastgesteld, maar de middenhersenen bij volwassenen zijn veel kleiner dan de andere - wat erop wijst dat het niet zo veel in omvang toeneemt als de voorhersenen of achterhersenen.

Bekijk deze video om meer te weten te komen over de witte stof in de grote hersenen die zich ontwikkelt tijdens de kindertijd en adolescentie. Dit is een samenstelling van MRI-beelden die zijn gemaakt van de hersenen van mensen van 5 tot 20 jaar, die laten zien hoe de grote hersenen veranderen. Naarmate de kleur verandert in blauw, verandert de verhouding tussen grijze stof en witte stof. Het bijschrift van de video beschrijft het als 'minder grijze stof', wat een andere manier is om 'meer witte stof' te zeggen. Als de hersenen zich pas op ongeveer 20-jarige leeftijd ontwikkelen, kunnen tieners dan verantwoordelijk worden gehouden voor slecht gedrag?

Dit is echt een kwestie van mening, maar er zijn ethische kwesties waarmee rekening moet worden gehouden wanneer het gedrag van een tiener tot juridische problemen leidt.


Bekijk de video: Constructie van de doorsnede van een kubus en een vlak - deel 2 (December 2022).