Informatie

Kan elk eiwit worden gefosforyleerd?

Kan elk eiwit worden gefosforyleerd?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ik werk met een Arabidopsis-mutant waarbij een F-box-eiwit is uitgeschakeld. Er is aangetoond dat doelwitten van F-box-eiwitten eerst moeten worden gefosforyleerd (Skowrya et al., 1997). Ik heb gehoord van fosforyleringssites, maar ik kan niet achterhalen of elk eiwit ze heeft. Kan elk eiwit worden gefosforyleerd?

  • Skowyra, D., Craig, KL, Tyers, M., Elledge, S.J. & Harper, J.W. (1997) F-Box-eiwitten zijn receptoren die gefosforyleerde substraten rekruteren voor het SCF-ubiquitine-ligasecomplex. Cel. 91 (2), 209-219.

Fosforylering kan alleen plaatsvinden op specifieke aminozuren, wat u fosforyleringsplaatsen hebt genoemd. Deze aminozuren zijn Ser, Tyr, Asp, Thr en His. In theorie kan elk van deze aminozuren gefosforyleerd zijn, maar in werkelijkheid kan het om een ​​aantal redenen niet voorkomen. Sommige hiervan zijn vanwege de verandering in de algehele lading van het eiwit die de 3D-conformatie kan beïnvloeden, of de aminozuren zijn niet toegankelijk voor specifieke kinasen, enz. Als u vraagt ​​om een ​​Western-blot uit te voeren, dan is de antilichaamspecificatie blad moet aangeven of er een gefosforyleerde vorm bestaat en er moet een verwijzing zijn naar de literatuur waarin deze wijziging wordt beschreven.


Een belangrijk ding ontbreekt in de andere antwoorden: fosforylering zal niet alleen plaatsvinden bij geselecteerde aminozuren, maar het zal helemaal niet gebeuren.

Dus niet alle Ser/Thr/Tyr van een eiwit kunnen worden gefosforyleerd omdat ze structureel ontoegankelijk kunnen zijn voor eiwitkinase en omdat ze in een specifiek motief moeten zijn om te worden gefosforyleerd.

De Human Protein Reference Database somt bijvoorbeeld de fosforyleringsmotieven op voor veel Tyr- en Ser/Thr-kinasen.


Fosforylering vereist blootgestelde serine-, threonine-, tyrosine- of histidineresiduen (in eukaryoten). Dit komt omdat de overdracht van fosfaatgroepen naar eiwitten wordt gemedieerd door een klasse eiwitten die kinasen worden genoemd. Kinasen kunnen een brede of specifieke activiteit hebben.

Deze recensie zou de meeste antwoorden op uw vragen moeten bevatten:

http://www.cell.com/abstract/S0092-8674(06)01274-8


Ik vind Nico's reactie het beste +1. Ik vond wel een interessante recensie over fosfoarginine en fosfolysine - de lijst met mogelijke fosforyleringsplaatsen groeit. Het is niet alleen de ruimtelijke context van het aminozuur dat al dan niet gefosforyleerd moet worden, zoals Nico schrijft en Leonardo impliceert, maar ook de temporele. Worden het doeleiwit en het eiwitkinase samen tot expressie gebracht? Als je naar specifieke weefsels kijkt (wortel, bloem, blad) en de kinase in kwestie wordt alleen geproduceerd in zaailingen, dan zal die potentiële fosforylering misschien niet echt optreden.


Voor een van de meest uitgebreide databases van post-translationele modificatie van eiwitten (inclusief fosforylering, methylering, acetylering, ubiquitinatie, enz.), ga je naar PhosphoSite. Je kunt links vinden naar sequenties, ziekten, motieven, publicaties, antilichamen, massaspec-experimenten, structuren, noem maar op.


EIWITFOSFORYLATIE: EEN WERELDWIJDE REGELAAR VAN CELLULAIRE ACTIVITEIT

Al in de 19e eeuw was bekend dat fosfaten aan eiwitten konden worden gebonden. De meeste voorbeelden van deze 'fosfoproteïnen'8217 werden gevonden in melk (caseïnes) en eigeel (phosvitin) en werden eenvoudigweg beschouwd als een biologische methode om fosfor als voedingsstof te leveren. Daarom werd het bestaan ​​van fosfoproteïnen bijna een eeuw na hun ontdekking beschouwd als een gevolg van metabolische reacties, en niets meer dan dat.

In de jaren 1950 begon dit allemaal te veranderen toen fosfoproteïnen opkwamen als belangrijke regulatoren van het cellulaire leven. Een initiërende factor van deze opkomst vond plaats in 1954, toen een enzymactiviteit werd waargenomen die een fosfaat overbracht op een ander eiwit [2] - een biologische reactie die fosforylering wordt genoemd. Het verantwoordelijke eiwit was een leverenzym dat de fosforylering van caseïne katalyseerde en bekend werd als een eiwitkinase (zie figuur 1), het eerste in zijn soort dat werd ontdekt. Een jaar later werd de rol van fosforylering interessanter, aangezien Fischer en Krebs [3] en Wosilait en Sutherland4 aantoonden dat een enzym dat betrokken is bij het glycogeenmetabolisme wordt gereguleerd door de toevoeging of verwijdering van een fosfaat, wat suggereert dat omkeerbare fosforylering het enzym zou kunnen controleren. werkzaamheid. Dit idee bleek later waar te zijn en is nu doorgesijpeld in vrijwel elk aspect van de celbiologie.


Figuur 1. Eiwitkinasen en eiwitfosfatasen.

Tegenwoordig wordt aangenomen dat een derde van de eiwitten die aanwezig zijn in een typische zoogdiercel covalent gebonden zijn aan fosfaat (d.w.z. ze worden op een of ander moment gefosforyleerd). De studie van celbiologie is nu bezaaid met voorbeelden van regulering door fosforylering: het verhogen of verlagen van de biologische activiteit van een enzym, het helpen verplaatsen van eiwitten tussen subcellulaire compartimenten, waardoor interacties tussen eiwitten kunnen plaatsvinden, en het labelen van eiwitten voor afbraak. De variëteit is immens en nu is erkend dat veel ziekten bij de mens verband houden met de abnormale fosforylering van cellulaire eiwitten.

Deze ontwikkelingen hebben de studie van fosforylering in de schijnwerpers van medisch onderzoek gebracht, een feit dat in 1992 werd erkend toen Fischer en Krebs de Nobelprijs voor de geneeskunde ontvingen voor hun baanbrekende inspanningen. Voor de geïnteresseerden zijn de lezingen van Fischer en Krebs bij het ontvangen van de Nobelprijs een uitstekend overzicht van de begindagen van dit vakgebied [5].

Hoe kan fosforylering de enzymactiviteit regelen?

Fosforylering verwijst naar de toevoeging van een fosfaat aan een van de aminozuurzijketens van een eiwit. Onthoud dat eiwitten zijn samengesteld uit aminozuren die aan elkaar zijn gebonden en dat elk aminozuur een bepaalde zijketen bevat, die het onderscheidt van andere aminozuren. Fosfaten zijn negatief geladen (waarbij elke fosfaatgroep twee negatieve ladingen draagt), zodat hun toevoeging aan een eiwit de kenmerken van het eiwit zal veranderen. Deze verandering is vaak een conformationele verandering, waardoor het eiwit verandert hoe het is gestructureerd (zie figuur 2).


Figuur 2. Conformatieveranderingen veroorzaakt door fosforylering.

Deze reactie is omkeerbaar door een proces genaamd defosforylering. Het eiwit schakelt terug naar zijn oorspronkelijke conformatie wanneer de fosfor wordt verwijderd (zie figuur 2). Als deze twee conformaties het eiwit verschillende activiteiten geven (d.w.z. enzymatisch actief zijn in de ene conformatie maar niet in de andere), zal fosforylering van het eiwit werken als een moleculaire schakelaar, waardoor de activiteit wordt in- of uitgeschakeld.

De overdracht van fosfaten op eiwitten wordt gekatalyseerd door een verscheidenheid aan enzymen in de cel. Hoewel de variëteit groot is, delen al deze enzymen bepaalde kenmerken en vallen ze in één klasse van eiwitten, proteïnekinasen genaamd [6]. Hun overeenkomsten komen voort uit het vermogen van de groep om een ​​fosfaat van het chemische energiedragende molecuul te halen ATP en plaats het op een aminozuurzijketen van een eiwit (zie figuur 3). De hydroxylgroepen (-OH) van serine-, threonine-, tyrosine- of histidine-aminozuurzijketens zijn het meest voorkomende doelwit. Een tweede klasse enzymen is verantwoordelijk voor de omgekeerde reactie, waarbij fosfaten uit een eiwit worden verwijderd. Deze worden genoemd eiwitfosfatasen.


Figuur 3. Toevoeging van een fosfaat aan een aminozuur.

Het gebruik van de fosforylering/defosforylering van een eiwit als controlemechanisme heeft vele voordelen:

  • Het is snel, het duurt slechts een paar seconden.
  • Er hoeven geen nieuwe eiwitten te worden gemaakt of afgebroken.
  • Het is gemakkelijk omkeerbaar.

Het uitgebreide gebruik van dit controlemechanisme blijkt uit het grote aantal bekende kinasen en fosfatasen [6]. Zelfs in een eenvoudig organisme als gist is ongeveer 3 procent van de eiwitten kinasen of fosfatasen. Sommige van deze enzymen zijn extreem specifiek en kunnen slechts enkele doeleiwitten fosforyleren of defosforyleren, terwijl andere in staat zijn breed op veel eiwitten in te werken. De voorbeelden van bekende doelwitten van fosforylering omvatten de meeste eiwitcomponenten van de cel, waaronder enzymen, structurele eiwitten, celreceptoren, ionkanalen en signaalmoleculen. Als een eiwit wordt gecontroleerd door zijn fosforyleringstoestand, zal zijn activiteit op elk moment direct afhankelijk zijn van de activiteit van de kinasen en fosfatasen die erop inwerken. Het is vrij gebruikelijk dat een fosfaatgroep continu wordt toegevoegd aan of verwijderd uit een eiwit, een cyclus waardoor een eiwit snel van de ene toestand naar de andere kan overschakelen.

Externe signalen kunnen proteïnekinasen en fosfatasen activeren

De ontvangst van een signaal op het oppervlak van een cel resulteert vaak in de activering van kinasen en fosfatasen [6]. Eenmaal geactiveerd, zullen cellulaire fosforyleringspatronen beginnen te veranderen, waarbij verschillende eiwitten worden gefosforyleerd of gedefosforyleerd. Het uiteindelijke resultaat zal verschillende veranderingen in cellulair gedrag zijn.

Veel van de eiwitten die bij ontvangst van een signaal worden gefosforyleerd, zijn ook eiwitkinasen. Deze organisatie van kinasen produceert a fosforylatie cascade [6] (zie figuur 4), waarbij één eiwitkinase wordt geactiveerd door fosforylering bij ontvangst van een signaal, dit kinase fosforyleert vervolgens het volgende kinase in de cascade, enzovoort totdat het signaal door de cel wordt verzonden. In een dergelijk systeem kan de kinasecascade beginnen met de receptor zelf (die vaak een kinase is) of een vrij zwevend cytoplasmatisch kinase. Bij ontvangst van een signaal blijven deze fosforyleringscascades functioneren totdat eiwitfosfatasen worden geactiveerd en hun transmissie stoppen.


Figuur 4. Fosforyleringscascades

In dierlijke cellen worden deze cascades gemedieerd door twee soorten kinasen: serine/threoninekinasen [6] (die de aminozuurzijketens van serine en threonine fosforyleren) en tyrosinekinasen [6] (die de zijketens van tyrosine-aminozuren fosforyleren).

Fosforylering als reactie op een signaal produceert een tweede resultaat, afgezien van de activering van kinasen en fosfatasen, die de productie van bindingsplaatsen voor eiwitten omvat om te interageren [6]. Dit proces verschilt van de activering van een eiwit door fosforylering (waarbij de toevoeging van een fosfaat verschillen in enzymactiviteit veroorzaakt), omdat het niet noodzakelijk de inherente activiteit van het gefosforyleerde molecuul verandert. In plaats daarvan creëert het een gefosforyleerd aminozuur op het molecuul waaraan een ander eiwit kan binden (zie figuur 4). Bij ontvangst van een signaal zullen sommige membraangebonden receptoren gefosforyleerd worden door tyrosine. Vrij zwevende eiwitten binden zich vervolgens aan deze fosfotyrosineplaatsen en zijn dus geconcentreerd in de buurt van de receptor. Deze concentratie leidt vaak tot de activering van extra eiwitten door moleculen samen te brengen die normaal niet dicht bij elkaar zouden zijn.

Door het gebruik van fosforyleringscycli en cascades kan de cel een diverse reeks processen reguleren, waaronder cellulaire beweging, reproductie en metabolisme. Het is de eenvoud, omkeerbaarheid en flexibiliteit van fosforylering die verklaart waarom het is aangenomen als het meest algemene controlemechanisme van de cel.

Toevoeging Lezen En Geraadpleegde Teksten

1. Pawson T. 1994. Inleiding: Eiwitkinasen. FASEB J. 8:1112-1113.

2. Hardie DG, uitg. 1999. Eiwitfosforylering: een praktische benadering. Oxford/New York: Oxford University Press. 431p.

3. Hardie DG, Hanks S, eds. 1995. Het Protein Kinase Factsbook. Londen/San Diego: Academische pers. Vol. 1-2.

1. Merken F, ed. 1996. Eiwitfosforylering. Weinheim: VCH.

2. Burnett G, Kennedy-EP. 1954. J. Biol. Chem. 211: 969-980.

3. Fischer EH, Krebs EG. 1955. J. Biol. Chem. 216: 121-132.

4. Sutherland EW, Wosilait WD. 1955. Natuur 175: 169-170.

6. Sefton BM, Hunter T. 1998. Eiwitfosforylering. San Diego: academische pers.

(Art by Jane Wang - let op: hoge resolutie-versies van afbeeldingsbestanden zijn hier beschikbaar)


Serine/threonine-eiwitfosfatasen

Invoering

Omkeerbare eiwitfosforylering is een oud, universeel en cruciaal middel om cellulaire homeostase en de cellulaire respons op externe signalen dynamisch en gecoördineerd te reguleren. De biochemische basis voor het regulerend vermogen van eiwit(de)fosforylering is de toevoeging of verwijdering van een negatief geladen fosfaat aan een eiwit, dat lokaal en globaal de structuur van het gemodificeerde eiwit kan veranderen, en daarmee de biologische activiteit van dat eiwit aantast. eiwit. De fosforyleringsbalans is cruciaal en wordt bepaald door de activiteiten van eiwitkinasen en eiwitfosfatasen, die respectievelijk eiwitfosforylering en -defosforylering katalyseren en op zichzelf als signaaltransducers fungeren (Fig. 1). Ontregeling van dit evenwicht leidt onvermijdelijk tot ziekte en daarom hebben zowel eiwitkinasen als eiwitfosfatasen een aanzienlijk therapeutisch potentieel bij kanker, diabetes, hart- en vaatziekten, immuunziekten, neurodegeneratieve ziekten en vele andere menselijke pathologieën. Proteomics-onderzoeken hebben aangetoond dat in normale cellen eiwit(de)fosforylering optreedt in 86,4% van de gevallen op serine, in 11,8% van de gevallen op threonine en in slechts 1,8% van de gevallen op tyrosineresiduen ( Olsen et al., 2006 ). Dit weerspiegelt ook de historische classificatie van eiwitfosfatasen in eiwitserine/threoninefosfatasen (PSTP's of PSP's) en eiwittyrosinefosfatasen (PTP's). Deze twee hoofdklassen van fosfatase werden elk verder onderverdeeld in verschillende superfamilies. Voor de PSP's zijn dit de fosfoproteïnefosfatasen (PPP), de metaalafhankelijke eiwitfosfatasen (PPM) en de op Asp gebaseerde FCP (TFIIF-associërende component van RNA-polymerase II C-terminaal domein) en SCP (kleine C-terminale domein) fosfatasen (Shi, 2009) (Fig. 1).

Figuur 1 . Eiwitfosforylering en Ser/Thr-eiwitfosfatasen. Omkeerbare eiwitfosforylering vindt plaats op een serine-, threonine- of tyrosineresidu en vereist de activiteit van eiwitkinasen en eiwitfosfatasen, die respectievelijk eiwitfosforylering en defosforylering katalyseren. In een normale cel vindt het grootste deel van de eiwitfosforylering (98,2%) plaats op serine- en threonineresiduen, terwijl slechts 1,8% van de fosforyleringen op tyrosineresiduen plaatsvindt. Aangenomen wordt dat het volledig gesequeneerde menselijke genoom 38 Ser/Thr-eiwitfosfatasen (PSP's) bevat, die zijn onderverdeeld in drie superfamilies, aangeduid als PPP, PPM en SCP/FCP.


Nociceptine Opioïde

2.2 Identificatie van het prepronociceptine-gen dat cAMP-afhankelijk associeert met gefosforyleerd CREB

Om nieuwe genen te identificeren die worden gereguleerd door CREB gefosforyleerd op Ser133 in Sertoli-cellen, hebben we chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) van Sertoli B-cellen uitgevoerd. Nadat cellen gedurende 10 minuten waren gestimuleerd met db-cAMP, werden extracten bereid en verwerkt voor ChIP met hetzelfde antilichaam tegen gefosforyleerd CREB. We hebben verschillende genen gescreend met PCR, waarvan de proximale promotorregio's associëren met gefosforyleerd CREB, en het prepronociceptine-gen van muis onderzocht (Zaveri, Waleh, & Toll, 2006). De proximale promotor van het muizen-prepronociceptine-gen heeft één functionele CRE-plaats op een andere locatie dan de menselijke promotor (Zaveri, Green, Polgar, Huynh, & Toll, 2002 Zaveri et al., 2006). Het DNA-fragment van de vermoedelijke transcriptiestartplaats naar het ATG-translatiestartcodon (252 bp) werd alleen gedetecteerd in cellen die waren behandeld met db-cAMP, maar niet in onbehandelde cellen. Er kon niets worden gedetecteerd uit immunoprecipitaten met een niet-verwant antilichaam. Nucleotidesequencing van het gedetecteerde DNA-fragment bevestigde de aanwezigheid van een consensus CRE-sequentie (CGTCA) op 30 bp stroomopwaarts van het ATG-translatiestartcodon in de proximale promoter van het muizen-prepronociceptine-gen, zoals gerapporteerd (Zaveri et al., 2006). Deze resultaten gaven aan dat gefosforyleerd CREB associeert met het proximale promotorgebied van het prepronociceptine-gen in Sertoli B-cellen (Fig. 1). Dit gen codeert voor een voorlopereiwit van prepronociceptine, waaruit het rijpe nociceptinepeptide bestaande uit 17 aminozuurresiduen wordt geproduceerd. Nociceptin, ook bekend als orphanine FQ, is een neuropeptide dat behoort tot de familie van opioïde peptiden en deelt de identieke aminozuursequentie met muizen en andere soorten.


Fosforylering: de hoofdschakelaar van de cel

Het is geen toeval dat één cellulair proces keer op keer wordt genoemd in discussies over celsignaleringsroutes bij kanker. Sinds de ontdekking ervan wordt fosforylering erkend als een wereldwijde regulator van cellulaire activiteit, en abnormale fosforylering is betrokken bij een groot aantal menselijke ziekten.

In dit rapport gaan we wat dieper in op wat eiwitfosforylatie precies doet, waarom het zo'n vitaal, alomtegenwoordig proces is en hoe het ons begrip van ziekten zoals kanker blijft vergroten.

Een kleine wijziging met een grote rol

Zodra een gen tot expressie is gebracht en is vertaald in een functioneel cellulair eiwit, kan de cel het lot van het eiwit beheersen door middel van posttranslationele modificaties (PTM's). Fosforylering is de belangrijkste en meest onderzochte vorm van PTM.

Fosforylering van een eiwit omvat de enzymatisch gemedieerde toevoeging van een fosfaatgroep (PO4) aan zijn aminozuurzijketens. Gefosforyleerde eiwitten werden al in het begin van de twintigste eeuw waargenomen, maar pas in de jaren vijftig werd door de baanbrekende en uiteindelijk Nobelprijswinnende ontdekkingen van Edmond H. Fischer en Edwin G. Krebs vastgesteld dat fosforylering een omkeerbaar, enzymatisch gemedieerd proces was. in staat om de functie van een eiwit te wijzigen.

Tegenwoordig wordt aangenomen dat maar liefst een derde van alle eiwitten in de cel op een of ander moment wordt gefosforyleerd, en de helft van deze eiwitten herbergt waarschijnlijk meer dan 1 fosforyleringsplaats, waarbij verschillende plaatsen vaak heel verschillende cellulaire reacties uitlokken.

Fosforylering en de omgekeerde reactie, defosforylering, vinden plaats dankzij de werking van 2 sleutelenzymen. Eiwitkinasen fosforyleren eiwitten door een fosfaatgroep over te brengen van adenosinetrifosfaat (ATP) naar hun doeleiwit. Dit proces wordt gecompenseerd door de werking van eiwitfosfatasen, die vervolgens de fosfaatgroep kunnen verwijderen. De hoeveelheid fosfaat die aan een eiwit is gekoppeld, wordt daarom precies bepaald door de relatieve activiteiten van het bijbehorende kinase en fosfatase. Men denkt dat maar liefst 2% tot 5% van het menselijk genoom codeert voor proteïnekinasen en fosfatasen.

De meest voorkomende aminozuren die gefosforyleerd moeten worden op eukaryote eiwitten (eiwitten die in alle organismen behalve bacteriën worden aangetroffen) zijn serine, threonine en tyrosine.

Functies van fosforylering zijn gevarieerd

Op het niveau van een enkel eiwit kan de binding van een negatief geladen fosfaatgroep leiden tot veranderingen in de structuur van een eiwit, waardoor de manier waarop het functioneert verandert. Als het beoogde eiwit een enzym is, kunnen fosforylering en defosforylering de enzymatische activiteit ervan beïnvloeden, in wezen als een schakelaar, waardoor het op een gereguleerde manier wordt in- en uitgeschakeld.

Een ander resultaat van structurele veranderingen aan het gefosforyleerde eiwit is de vergemakkelijking van binding aan een partnereiwit. Op deze manier kan fosforylering eiwit-eiwit interacties reguleren. De fosforylering van een eiwit kan het ook richten op afbraak en verwijdering uit de cel door het ubiquitine-proteasoomsysteem.

Eiwitfosforylering speelt ook een vitale rol bij intracellulaire signaaltransductie. Veel van de eiwitten die een signaalroute vormen, zijn kinasen, van de tyrosinekinasereceptoren aan het celoppervlak tot stroomafwaartse effectoreiwitten, waarvan vele serine/threoninekinasen zijn.

In een notendop, ligandbinding aan het celoppervlak brengt een fosforyleringscascade tot stand, waarbij de fosforylering en activering van één eiwit de fosforylering van een ander stimuleert, vervolgens een signaal versterkt en het door de cel stuurt. Het signaal blijft zich voortplanten totdat het wordt uitgeschakeld door de werking van een fosfatase.

Naast eiwitten kunnen ook andere soorten moleculen worden gefosforyleerd. Met name de fosforylering van fosfoinositide-lipiden, zoals fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat (PIP2), op verschillende posities op hun inositolring, speelt ook een sleutelrol bij signaaltransductie.

De rol van fosforylering bij kanker definiëren

Fosforylering speelt een vitale rol bij het reguleren van veel intracellulaire processen zoals groei, proliferatie en celdeling. Dus eventuele verstoringen in het fosforyleringsproces zullen waarschijnlijk veel van de kenmerken van kanker veroorzaken, zoals ongecontroleerde celgroei en proliferatie. Mutaties in kinasen en fosfatasen zijn inderdaad vaak betrokken bij een aantal verschillende kankers, en veel van de genen die coderen voor deze eiwitten zijn oncogenen of tumorsuppressors.

Overexpressie of mutaties die leiden tot constitutieve activering van fosforyleringsmachines zullen onvermijdelijk het delicate evenwicht in de cel verstoren, waardoor de ongepaste activering of deactivering van de cellulaire processen die het controleert, wordt veroorzaakt.

De sleutelfunctie van proteïnekinasen bij signaaltransductie heeft ze tot een aantrekkelijk doelwit voor kankertherapieën gemaakt.

Het proces in de ontwikkeling van geneesmiddelen benutten

De sleutelfunctie van proteïnekinasen bij signaaltransductie heeft ze tot een uiterst aantrekkelijk doelwit gemaakt voor therapeutische interventie bij kanker. Eiwitkinasen vertegenwoordigen maar liefst 30% van alle eiwittargets die door farmaceutische bedrijven worden onderzocht. Met name het richten op tyrosinekinasen is een populaire benadering en de afgelopen decennia zijn er baanbrekende vorderingen gemaakt met de introductie van deze klasse van middelen.

Ze omvatten geneesmiddelen zoals trastuzumab (Herceptin, Genentech), een monoklonaal antilichaam dat is ontworpen om de functie van de HER2-receptortyrosinekinase te blokkeren, wat een revolutie teweegbracht in de behandeling van borstkanker, en erlotinib (Tarceva, Genentech), een receptortyrosinekinaseremmer, die richt zich op de epidermale groeifactorreceptor (EGFR) en is door de FDA goedgekeurd voor de behandeling van patiënten met niet-kleincellige longkanker.

Meer recent zijn de serine/threoninekinasen ook naar voren gekomen als sterke kandidaten en ongeveer een derde van alle kinaseremmers die momenteel in ontwikkeling zijn, richt zich op serine/threoninekinasen. De meest geavanceerde van deze klasse geneesmiddelen zijn diegene die zich richten op het zoogdierdoelwit van rapamycine (mTOR): everolimus (Afinitor, Novartis) en temsirolimus (Torisel, Pfizer), beide goedgekeurd voor de behandeling van niercelcarcinoom.

Een aantal remmers gericht op AKT zijn ook in de pijplijn, waaronder perifosine (Keryx Biopharmaceuticals, Inc), en er is een aanzienlijke hoeveelheid interesse in geneesmiddelen die gericht zijn op MEK, een kritisch kinase op de kruising van verschillende biologische routes die celproliferatie reguleren, overleving , migratie en differentiatie, waaronder AZD6244 (selumetinib, AstraZeneca).

Serine/threonine-kinasen die betrokken zijn bij de regulatie van de celcyclus worden ook zwaar onderzocht, zoals de aurora-kinasen en de cycline-afhankelijke kinasen. Onder hen zijn AZD1152 (AstraZeneca) en HMR-1275 (alvocidib sanofi -aventis), die zich in verschillende stadia van klinische ontwikkeling bevinden.

Potentieel als biomarker onderzoeken

Gezien de cruciale rol van fosforylering in de cellulaire omgeving en het feit dat de overgrote meerderheid van de fosforyleringsplaatsen niet gekarakteriseerd blijft, doen onderzoekers er een constante inspanning aan om de rol van fosforylering beter te begrijpen en nieuwe, zeer gevoelige en geavanceerde fosforyleringsidentificatie te ontwikkelen. technieken.

De gouden standaardmethode voor het meten van eiwitfosforyleringsniveaus is een in vitro kinase-assay, waarbij radioactief ATP wordt gebruikt. Wanneer een fosforyleringsgebeurtenis plaatsvindt, zal het radioactieve anorganische fosfaat (32P) in ATP worden overgebracht naar het gefosforyleerde eiwit, dus na de radioactiviteit kunnen onderzoekers vaststellen wanneer eiwitten worden gefosforyleerd. De ontwikkeling van specifieke antilichamen tegen gefosforyleerde vormen van eiwitten leidde tot het gebruik van immunoassays om fosforyleringspatronen van individuele eiwitten te onderzoeken.

Meer recentelijk zijn onderzoekers begonnen gebruik te maken van steeds geavanceerdere massaspectrometrie en nucleaire magnetische resonantie beeldvormingsmethoden om te proberen globale patronen van fosforylering in de cel te ontcijferen als reactie op bepaalde stimuli of therapeutische middelen. Het potentieel voor het gebruik van de fosforyleringsstatus van belangrijke signaaleiwitten als diagnostische biomarker, voorspeller van respons of prognostische indicator is een gebied van intens belang, zoals blijkt uit een aantal presentaties op de bijeenkomst van de American Society of Clinical Oncology (ASCO) dit jaar.

Studies onderzoeken het nut van gefosforyleerde vormen van epidermale groeifactorreceptor en HER2 als zowel biomarkers van respons op tyrosinekinaseremmers als als prognostische indicatoren. Uit 1 onderzoek bleek bijvoorbeeld dat een hoog niveau van expressie van gefosforyleerd HER2 bij patiënten met HER2-positieve borstkanker geassocieerd is met een lagere ziektevrije overleving van 5 jaar.

Bovendien beginnen onderzoekers bindingsdomeinen in signaaleiwitten te exploiteren die specifiek andere gefosforyleerde eiwitten herkennen en eraan binden. Met behulp van het Src homologie 2 (SH2) -bindende domein, dat bindt aan gefosforyleerde tyrosines, hebben onderzoekers de globale toestand van tyrosinefosforylering in verschillende menselijke kankercellijnen kunnen analyseren om te zien hoe het verschilt van normale cellen.

Jane de Lartigue, PhD, is een freelance medisch schrijver en redacteur gevestigd in het Verenigd Koninkrijk.


Exogeen en endogeen eiwitmetabolisme | Biologie

Met de term endogeen eiwitmetabolisme wordt bedoeld de desintegratie van die eiwitten die al bestaan ​​als componenten van levende cellen (weefseleiwitten). De term exogeen eiwitmetabolisme impliceert de afbraak van voedseleiwitten die niet voorkomen als delen van het celprotoplasma.

De klassieke kijk op eiwitmetabolisme, oorspronkelijk voorgesteld door Folin, wordt nu uitgedaagd. Folin's visie was dat de metabole patronen van exogeen (dieet) en endogeen (lichaams) eiwitmetabolisme verschillen, d.w.z. de eindproducten van endogeen eiwitmetabolisme zijn urinezuur, creatine en neutrale zwavel, terwijl ureum het eindproduct is van exogeen eiwitmetabolisme.

Uit isotopenexperimenten blijkt echter dat de lichaamseiwitten in een constante staat van omzetting zijn en dat de lichaamseiwitten voortdurend worden afgebroken en vervangen door nieuwe eiwitten die worden gesynthetiseerd uit voedingsaminozuren. De vervanging van eiwitten is snel in plasma, lever, nieren en darmkanaal en langzaam in hemoglobine, spieren en huid.

Dynamische staat van aminostikstof en eiwitten van het lichaam:

Door het werk van Schoenheimer en anderen is vastgesteld dat de aminostikstof van aminozuren (behalve lysine) wordt gedistribueerd naar andere aminozuren van verschillende weefsels en omkeerbaar wordt onttrokken aan die aminozuren naar de aminozuren die aminostikstof bevatten door de proces van deaminering en reaminering.

Eiwitopslag (labiele proteïne):

Stikstof die werd uitgescheiden gedurende de eerste paar dagen nadat de eiwithongering groter was, wordt dan min of meer constant. Het ongeorganiseerde eiwit dat aanwezig is in lever, thymus, prostaat, zaadblaasjes, spijsverteringskanaal, pancreas, milt en nieren, enz., wordt aangewend om aan de behoefte van het lichaam te voldoen en deze eiwitten worden labiele pro­teins genoemd. Deze worden gebruikt voor de synthese van andere eiwitten en kunnen indien nodig worden geoxideerd om energie te winnen.

Eindproducten van eiwitmetabolisme:

De stikstof die vrijkomt bij het katabolisme van aminozuren (eiwitten) wordt door het lichaam uitgescheiden in verschillende vormen, die variëren bij verschillende diersoorten. De aanzienlijke hoeveelheid stikstof die wordt uitgescheiden via de urine van mensen, zoogdieren en amfibieën, enz., is ureum. De vogels en reptielen scheiden stikstof voornamelijk uit als urinezuur. De man scheidt ook stikstof van purinebasen uit als urinezuur. De uitscheiding van creatine vindt uitsluitend plaats door de afbraak van weefseleiwitten. Neutrale zwaveluitscheiding duidt niet op de aard van eiwitafbraak via de voeding of weefsels.

Vanwege de dynamische toestand van aminostikstof van aminozuur en het differentiële patroon van het metabolisme van labiele eiwitten, geeft de uitscheiding van verschillende stikstofhoudende metabolische eindproducten niet altijd een echt metabool beeld van het eiwitmetabolisme. Maar er kan enige aanwijzing worden verkregen als de gestandaardiseerde experimenten zouden zijn gedaan, bijvoorbeeld een verhoogde creatine-uitscheiding, kan wijzen op een verhoogd weefseleiwit, d.w.z. met name spiereiwitkatabolisme dat gaande is. Een verhoogde uitscheiding van urinezuur kan het gevolg zijn van een verhoogd purinekatabolisme. Verhoogde uitscheiding van ureum kan wijzen op eiwitkatabolisme via de voeding.

Korte levensgeschiedenis van de eindproducten van exogeen eiwitmetabolisme:

Uit het experiment van Folin, hoewel betwist, blijkt dat de eindproducten van het exogene eiwitmetabolisme ureum, ammoniak, anorganisch sulfaat en 50% van het totale uitgescheiden urinezuur zijn.

De korte levensgeschiedenis van deze producten wordt hieronder vermeld:

(a) Door deaminering van aminozuren (voornamelijk uit exogene bronnen),

(b) Van zouten zoals ammoniumcarbonaat, lactaat, enz., ingenomen via de voeding of als medicijn, en

(c) Van het aminozuur arginine.

Het wordt afgebroken tot ureum en ornithine. Het eindproduct van het metabolisme van deze lichamen is ureum.

20-40 mgm (gemiddeld 30 mgm) ureum aanwezig per 100 ml bloed. Bijna gelijk verdeeld in plasma en bloedlichaampjes.

Functies bediend door ureumvorming:

De vorming van ureum helpt de reactie van het bloed constant te houden. Want daarin blijven één zuur (koolzuur) en twee moleculen ammoniak geneutraliseerd.

Een volwassene die een normaal gemengd dieet volgt, scheidt ureum uit via de urine, gemiddeld 30 g per dag (2% als het totale urinevolume 1500 ml is). 80% van de urinaire stikstof wordt uitgescheiden in de vorm van ureum.

(a) Van deaminering van aminozuren, zowel exogeen als endogeen. Hoewel deaminering voornamelijk in de lever plaatsvindt, wijzen recente waarnemingen erop dat ammoniak ook in de nieren wordt gevormd. In de lever gevormde ammoniak wordt omgezet in verschillende stoffen. Nieren kunnen aminozuren normaal deamineren. De hoeveelheid neemt toe tijdens acidose en daalt bij alkalose, en

(b) Bepaalde ammoniumzouten die in voedsel of als medicijn worden ingenomen, bijvoorbeeld ammoniumchloride.

Lot en functies van ammoniak:

(a) Vorm ammoniumzouten. Het doel is om de bloedreactie constant te houden,

(b) Ammoniak kan worden gebruikt voor de synthese van aminozuren, urinezuur, nucleoproteïnen en andere stikstofverbindingen.

Bij een gemengd dieet bij een volwassen man is de totale dagelijkse productie ongeveer 0,7 g. Ammoniakstikstof vormt ongeveer 2-4% van de totale stikstof in de urine.

Relatie met bloedreactie:

Bij acidose worden meer ammoniumzouten gevormd. Omgekeerde veranderingen zullen plaatsvinden bij alkalose.

Betekenis van variaties:

Hoewel ammoniak een eindproduct is van het exogene eiwitmetabolisme, wordt de hoeveelheid ervan in de urine bepaald door de relatieve hoeveelheid zuren en basen in het lichaam. Bij acidose stijgt het, bij alkalose daalt het. Ammoniakcoëfficiënt is een betrouwbare gids voor de toestand van acidose of alkalose van het lichaam.

Ze worden in hoge mate geproduceerd uit voedingseiwitten in het lichaam. Bijgevolg kunnen ze worden beschouwd als de eindproducten van het exogene eiwitmetabolisme. (De etherische sulfaten hebben een totaal andere levensgeschiedenis en zijn besproken onder 'Sulphur Metabolism'8217).

Het is een index van zowel het endogene als het exogene eiwitmetabolisme.

Korte levensgeschiedenis van de eindproducten van endogeen eiwitmetabolisme:

Uit dieetexperimenten bij honden is gebleken dat creatinine en neutrale zwavel absoluut onveranderd blijven. Ze zijn dus uitsluitend van endogene oorsprong. In dit verband moet de verbinding creatine, hoewel niet getoond in dit experiment, maar wanneer aanwezig in urine, worden beschouwd als afgeleid van endogeen eiwitmetabolisme, omdat het de voorloper van creatinine is.

Deze verbindingen zijn dus geheel endogeen. De helft van urinezuur is van endogene oorsprong en de andere helft is van exogene oorsprong. De levensgeschiedenis van neutrale zwavel is besproken onder Zwavelmetabolisme en van urinezuur onder Urinezuurmetabolisme.

Hieronder volgt een korte samenvatting van de levensgeschiedenis van creatine en creatinine:

Methylguanidoazijnzuur.

Totale hoeveelheid in het lichaam:

90-120 g bij volwassenen, 98% daarvan is aanwezig in de dwarsgestreepte spieren als creatinefosfaat. Skeletspieren bevatten ongeveer 0,5% creatine. Het wordt ook aangetroffen in het hart (ongeveer de helft van de hoeveelheid in skeletspieren, d.w.z. 0,25%), testikels, hersenen en baarmoeder, vooral tijdens de zwangerschap.

Het is ongeveer 10 mg per 100 ml in het bloed aanwezig en blijft meestal in de rode bloedcellen. Omdat het in de rode cellen aanwezig is, wordt het niet gefilterd. Daarom is het meestal niet aanwezig in de urine.

Oorsprong en vorming van creatine:

(a) Creatinesynthese vereist drie aminozuren, namelijk arginine, glycine en me­thionine (als S-adenosylmethionine),

(b) De verbinding guanidoazijnzuur is een tussenstap in de synthese van creatine,

(c) De methylgroep van creatine is afgeleid van methionine,

(d) De fasen in de creatinesynthese lijken als volgt te zijn: twee organen, d.w.z. nieren en lever, zijn ook betrokken bij de volledige synthese van creatine.

In de nieren reageren glycine en arginine waarbij de amidinegroep (-CNHNH) van arginine wordt overgebracht naar glycine met de vorming van guanidoazijnzuur (glycocyamine) door het enzym transamidinase. Transamidinase-enzym is alleen aanwezig in de nieren en de pancreas. Maar deze enzymatische reactie vindt meestal plaats in de nieren.

Methylering van guanidoazijnzuur vindt plaats in de lever, omdat de lever het enzym guanidoazijnzuurmethyltransferase bevat. Guanidoazijnzuur wordt omgezet in creatine met behulp van aminozuur, methionine (actieve vorm) in aanwezigheid van het enzym guani­doacetic methyltransferase en glutathion (GSH).

Wanneer de methylgroep van methionine wordt overgebracht naar guanidoazijnzuur om creatine (methylguanidoazijnzuur) te vormen, wordt de methionine omgezet in S-adenosylhomocysteïne. Ac­tivatie van methionine vindt plaats door ATP wanneer methionine wordt omgezet in S-adenosylmethionine. Recent is aangetoond dat bij zoogdieren zowel transamiderings- als methyleringsreacties, betrokken bij de synthese van creatine, plaatsvinden in de pancreas.

Effecten van creatinevoeding:

Als creatine in kleine hoeveelheden wordt ingenomen (tot 1 gram per dag), wordt er niets in de urine teruggevonden, maar in matige hoeveelheden (tot 5 gram per dag) wordt een beetje uitgescheiden als creatine en de rest wordt opgeslagen. Maar als grote hoeveelheden (20 g) creatine worden ingenomen, wordt het grootste deel (15 g) als zodanig uitgescheiden, een ander deel (4,5 g) wordt vastgehouden en een klein deel (0,5 g) wordt als creatinine in de urine uitgescheiden. Dit laat zien dat creatine geen afvalproduct is. Het is nuttig en er is een opslag voor in het lichaam.

Zolang dit reservoir niet gevuld is, zal er geen creatine in de urine verschijnen. Creatinesynthese is afhankelijk van niertransamidinase-activiteit. Tot voor kort werd gedacht dat de nieren de enige plaats waren van het transamidinerende enzym. Recente studies hebben echter aangetoond dat de alvleesklier een unieke rol kan spelen bij de synthese van creatine in het lichaam van zoogdieren.

Interrelatie met creatinine:

Deze twee verbindingen zijn nauw met elkaar verbonden. Ze zijn gemakkelijk onderling omzetbaar terwijl ze in oplossing zijn. Creatinine is een anhydride van creatine met één molecuul water minder. Zuur medium bevordert de vorming van creatinine, terwijl alkalisch medium de vorming van creatine bevordert. Maar in vivo kan creatinine niet worden omgezet in creatine, hoewel het omgekeerde de regel is.

l. Creatine wordt omgezet in creatinefosfaat (fosfageen), dat een essentiële rol speelt in de chemische veranderingen die ten grondslag liggen aan spiercontractie. Creatine, wanneer het in matige hoeveelheden via de mond wordt gegeven, verdwijnt volledig in het lichaam en er verschijnt niets in de urine. Dit zou te wijten zijn aan de omzetting in creatinefosfaat en de daaropvolgende opslag in de spieren.

ii. Creatine heeft zeker een functie in andere weefsels dan spieren, maar de aard ervan is niet bekend.

ii. Creatine is de voorloper van creatinine.

Uitscheiding van creatine:

Creatine is over het algemeen niet aanwezig in de urine van normale volwassen mannen. Maar het kan abnormaal worden uitgescheiden.

De uitscheiding in de urine wordt bepaald door de volgende factoren:

Tot de puberteit is het constant aanwezig in de urine van beide geslachten. Er is gesuggereerd dat het te wijten is aan een verhoogde productie van creatine, op een onbekende manier geïnduceerd door de activiteit van de groei-impuls. Het kan ook te wijten zijn aan een lagere capaciteit van de onontwikkelde spieren voor de opslag van creatine. Een derde mogelijkheid is dat de kinderen minder vermogen hebben om creatine om te zetten in creatinine.

Na de puberteit wordt het bij gezonde vrouwen met tussenpozen gevonden die niet gerelateerd zijn aan de menstruatie.

Het is constant aanwezig tijdens de zwangerschap. Het stijgt tot maximaal 1,5 g per dag na de bevalling en is waarschijnlijk afkomstig van de involuerende baarmoeder. Het sekseverschil van creatine-uitscheiding kan niet goed worden verklaard. Dat verhoogde creatine-uitscheiding niet te wijten is aan de minder spierontwikkeling bij vrouwen, wordt bewezen door het feit dat het zelfs voorkomt bij vrouwen die fysiek sterk getraind zijn. Dat seks hier iets te maken heeft, wordt ondersteund door de constatering dat creatinurie veel voorkomt bij eunuchen. Het kan gemakkelijk worden opgewekt bij oude mensen (natuurlijk met verminderde geslachtsfuncties) door toediening van een kleine hoeveelheid creatine.

Eiwitrijke en koolhydraatarme diëten verhogen de uitscheiding van creatine. De eerste werkt door het weefselmetabolisme te stimuleren vanwege zijn hoge specifieke dynamische actie. De laatste werkt indirect door de afwezigheid van zijn sparende effecten op de afbraak van weefseleiwit.

v. Verhoogde weefselafbraak:

Bij elke aandoening die de afbraak van weefsels verhoogt, in het bijzonder van dwarsgestreepte spieren, zoals bij uithongering, langdurige diabetes mellitus, hyperthyreoïdie, koorts en andere slopende ziekten die het basaal metabolisme verhogen, wordt de creatine-uitscheiding verhoogd. Bij bepaalde spierziekten (myopathie) waarbij spieren degeneratie ondergaan, wordt een grote hoeveelheid creatine uitgescheiden.

In dergelijke omstandigheden verschijnt 90% of meer creatine in onveranderde vorm in de urine, zelfs wanneer het in kleine hoeveelheden via de mond wordt toegediend. Dit zou te wijten zijn aan een lagere opslagcapaciteit van de spier. Het is ook waarschijnlijk dat bij deze ziekte (d.w.z. myopathie) de omkeerbare enzymreactie, waardoor het gebroken creatinefosfaat opnieuw wordt gesynthetiseerd in de spier, afwezig is.

Het is het anhydride van creatine.

Het wordt meestal gevormd door de afbraak van creatinefosfaat in het lichaam. Dit proces wordt niet gekatalyseerd door enzymen en is onomkeerbaar. Creatine-gelabeld met isotoop 15 N geeft creatinine met hetzelfde isotoop 15 N.

Een grote hoeveelheid in de spier.

Effecten van creatininevoeding:

Bij orale toediening wordt bijna 80% onmiddellijk uitgescheiden in de urine. Daarom wordt het beschouwd als een afvalproduct. Het is een stof zonder drempel. Het wordt gefilterd door de glomeruli en wordt ook actief uitgescheiden door de tubulaire cellen in de urine. Hoeveelheid in bloed: Normaal gesproken is het ongeveer 0,7-2,0 mg per 100 ml aanwezig. Dit niveau is zeer constant en wordt als pathologisch beschouwd wanneer de waarde ervan met ongeveer 2 mg stijgt. Creatinine wordt ook aangetroffen in gal, zweet en in de afscheiding van maag en darm.

Ongeveer 1,2-2,0 g bij volwassen mannen en 0,8-1,5 g bij volwassen vrouwen wordt binnen 24 uur uitgescheiden. De uitgescheiden hoeveelheid is opmerkelijk constant voor een bepaald individu. Het is gerelateerd aan de spiermassa en is hoger bij gespierde personen. Dit staat in groot contrast met de uitscheiding van creatine, die geen verband houdt met spierontwikkeling. De uitscheiding neemt toe tijdens arbeid en inspanning maar wordt onmiddellijk gevolgd door een daling, zodat de dagelijkse output constant blijft.

Betekenis van variatie:

Creatinine vertegenwoordigt de afvalproducten van het creatinemetabolisme en ontstaat in het lichaam door de spontane afbraak van aanmaakfosfaat. Het heeft blijkbaar praktisch geen functie in het lichaam. Omdat de uitscheiding niet gerelateerd is aan voedseleiwit, duiden de variaties in de uitscheiding op enkele metabole stoornissen. Het optreden van creatinine in de urine staat bekend als creatinurie wanneer een kleine hoeveelheid creatine samen met creatinine wordt uitgescheiden.

De creatinewaarde neemt geleidelijk af naarmate de volwassenheid vordert. De uitscheiding ervan neemt toe bij koorts, honger, bij een koolhydraatvrij dieet en bij diabetes mellitus. Het kan toenemen als gevolg van overmatige weefselvernietiging waarbij creatine vrijkomt of doordat creatine niet goed wordt gefosforyleerd. De uitscheiding van creatinine is dus onafhankelijk van voedingseiwitten en moet worden beschouwd als een index van het endogene eiwitmetabolisme.


Inhoud

Er zijn vier JAK-eiwitten: JAK1, JAK2, JAK3 en TYK2. [1] JAKs bevat een FERM-domein (ongeveer 400 residu's), een SH2-gerelateerd domein (ongeveer 100 residu's), een kinasedomein (ongeveer 250 residu's) en een pseudokinasedomein (ongeveer 300 residu's). [2] Het kinasedomein is van vitaal belang voor JAK-activiteit, omdat het JAK's in staat stelt eiwitten te fosforyleren (fosfaatgroepen toe te voegen).

Er zijn zeven STAT-eiwitten: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B en STAT6. [1] STAT-eiwitten bevatten veel verschillende domeinen, elk met een andere functie, waarvan de meest geconserveerde regio het SH2-domein is. [2] Het SH2-domein bestaat uit 2 α-helices en een β-sheet en wordt ongeveer gevormd uit residuen 575-680. [2] [3] STAT's hebben ook transcriptionele activeringsdomeinen (TAD), die minder geconserveerd zijn en zich aan de C-terminus bevinden. [4] Bovendien bevatten STAT's ook: tyrosine-activering, aminoterminale, linker, coiled-coil en DNA-bindende domeinen. [4]

De binding van verschillende liganden, gewoonlijk cytokinen, zoals interferonen en interleukinen, aan celoppervlakreceptoren, zorgt ervoor dat de receptoren dimeriseren, waardoor de receptor-geassocieerde JAK's dicht bij elkaar komen. [6] De JAK's fosforyleren elkaar vervolgens op tyrosineresiduen die zich bevinden in regio's die activeringslussen worden genoemd, via een proces dat transfosforylering wordt genoemd en dat de activiteit van hun kinasedomeinen verhoogt. [6] De geactiveerde JAK's fosforyleren vervolgens tyrosineresiduen op de receptor, waardoor bindingsplaatsen ontstaan ​​voor eiwitten die SH2-domeinen bezitten. [6] STAT's binden vervolgens aan de gefosforyleerde tyrosines op de receptor met behulp van hun SH2-domeinen, en vervolgens worden ze tyrosine-gefosforyleerd door JAK's, waardoor de STAT's dissociëren van de receptor. [2] Ten minste STAT5 vereist glycosylering op threonine 92 voor sterke STAT5-tyrosinefosforylering. [7] Deze geactiveerde STAT's vormen hetero- of homodimeren, waarbij het SH2-domein van elke STAT het gefosforyleerde tyrosine van de tegenovergestelde STAT bindt, en het dimeer verplaatst zich vervolgens naar de celkern om transcriptie van doelgenen te induceren. [2] STAT's kunnen ook rechtstreeks door receptortyrosinekinasen worden gefosforyleerd, maar aangezien de meeste receptoren geen ingebouwde kinase-activiteit hebben, zijn JAK's gewoonlijk vereist voor signalering. [1]

Beweging van STAT's van het cytosol naar de kern

Om van het cytosol naar de kern te gaan, moeten STAT-dimeren door nucleaire poriecomplexen (NPC's) gaan, dit zijn eiwitcomplexen die aanwezig zijn langs de nucleaire envelop die de stroom van stoffen in en uit de kern regelen. Om STAT's in staat te stellen de kern binnen te gaan, wordt een aminozuursequentie op STAT's, het nucleaire lokalisatiesignaal (NLS) genoemd, gebonden door eiwitten die importins worden genoemd. [4] Zodra het STAT-dimeer (gebonden aan importins) de kern binnengaat, bindt een eiwit genaamd Ran (geassocieerd met GTP) zich aan de importins, waardoor ze vrijkomen uit het STAT-dimeer. [8] Het STAT-dimeer is dan vrij in de kern.

Specifieke STAT's lijken te binden aan specifieke importine-eiwitten. STAT3-eiwitten kunnen bijvoorbeeld de kern binnendringen door te binden aan importine α3 en importine α6. [9] Aan de andere kant binden STAT1 en STAT2 aan importine α5. [4] Studies tonen aan dat STAT2 een eiwit genaamd interferon regulerende factor 9 (IRF9) nodig heeft om de kern binnen te gaan. [8] Er is niet zoveel bekend over nucleaire toegang van andere STAT's, maar er is gesuggereerd dat een sequentie van aminozuren in het DNA-bindende domein van STAT4 ook nucleaire import mogelijk zou maken, STAT5 en STAT6 kunnen beide binden aan importine α3. [8] Bovendien kunnen STAT3, STAT5 en STAT6 de kern binnendringen, zelfs als ze niet gefosforyleerd zijn op tyrosineresten. [8]

De rol van post-translationele modificaties Bewerken

Nadat STAT's zijn gemaakt door eiwitbiosynthese, hebben ze niet-eiwitmoleculen eraan vastgemaakt, post-translationele modificaties genoemd. Een voorbeeld hiervan is tyrosinefosforylering (wat fundamenteel is voor JAK-STAT-signalering), maar STAT's ondergaan andere wijzigingen die het STAT-gedrag in JAK-STAT-signalering kunnen beïnvloeden. Deze modificaties omvatten: methylering, acetylering en serinefosforylering.

  • methylering. STAT3 kan worden gedimethyleerd (met twee methylgroepen) op een lysineresidu, op positie 140, en er wordt gesuggereerd dat dit de STAT3-activiteit zou kunnen verminderen. [10] Er is discussie over de vraag of STAT1 gemethyleerd is op een arginineresidu (op positie 31), en wat de functie van deze methylering zou kunnen zijn. [11]
  • Acetylering. Van STAT1, STAT2, STAT3, STAT5 en STAT6 is aangetoond dat ze geacetyleerd zijn. [12] STAT1 kan een acetylgroep hebben die is gehecht aan lysines op posities 410 en 413, en als resultaat kan STAT1 de transcriptie van apoptotische genen bevorderen - waardoor celdood wordt veroorzaakt. [12] STAT2-acetylering is belangrijk voor interacties met andere STAT's en voor de transcriptie van antivirale genen. [4]

Er is gesuggereerd dat acetylering van STAT3 belangrijk is voor zijn dimerisatie, DNA-binding en gen-transcriptievermogen, en IL-6 JAK-STAT-routes die STAT3 gebruiken, vereisen acetylering voor transcriptie van IL-6-responsgenen. [12] STAT5-acetylering op lysines op posities 694 en 701 is belangrijk voor effectieve STAT-dimerisatie bij prolactinesignalering. [13] Er wordt gesuggereerd dat het toevoegen van acetylgroepen aan STAT6 essentieel is voor gentranscriptie in sommige vormen van IL-4-signalering, maar niet alle aminozuren die op STAT6 worden geacetyleerd, zijn bekend. [12]

  • Serine fosforylering. De meeste van de zeven STAT's (behalve STAT2) ondergaan serinefosforylering. [2] Het is aangetoond dat serinefosforylering van STAT's gentranscriptie vermindert. [14] Het is ook nodig voor de transcriptie van sommige doelwitgenen van de cytokinen IL-6 en IFN-γ. [11] Er is voorgesteld dat fosforylering van serine STAT1-dimerisatie kan reguleren [11] en dat continue serinefosforylering op STAT3 de celdeling beïnvloedt. [15]

Werving van co-activators Bewerken

Net als veel andere transcriptiefactoren zijn STAT's in staat om co-activators zoals CBP en p300 te rekruteren, en deze co-activators verhogen de snelheid van transcriptie van doelgenen. [2] De co-activators kunnen dit door genen op DNA toegankelijker te maken voor STAT's en door eiwitten te rekruteren die nodig zijn voor transcriptie van genen. De interactie tussen STAT's en co-activators vindt plaats via de transactivatiedomeinen (TAD's) van STAT's. [2] De TAD's op STAT's kunnen ook interageren met histonacetyltransferasen (HAT's) [16] deze HAT's voegen acetylgroepen toe aan lysineresiduen op eiwitten die zijn geassocieerd met DNA, histonen genoemd. Door acetylgroepen toe te voegen, wordt de positieve lading op lysineresiduen verwijderd, en als gevolg daarvan zijn er zwakkere interacties tussen histonen en DNA, waardoor DNA toegankelijker wordt voor STAT's en een toename van de transcriptie van doelgenen mogelijk wordt.

Integratie met andere signaalroutes Bewerken

JAK-STAT-signalering kan worden gekoppeld aan andere celsignaleringsroutes, zoals de PI3K/AKT/mTOR-route. [17] Wanneer JAK's worden geactiveerd en tyrosineresiduen op receptoren fosforyleren, kunnen eiwitten met SH2-domeinen (zoals STAT's) aan de fosfotyrosines binden en kunnen de eiwitten hun functie uitoefenen. Net als STAT's heeft het PI3K-eiwit ook een SH2-domein en kan het daarom ook aan deze gefosforyleerde receptoren binden. [17] Als gevolg hiervan kan het activeren van de JAK-STAT-route ook PI3K/AKT/mTOR-signalering activeren.

JAK-STAT-signalering kan ook worden geïntegreerd met de MAPK/ERK-route. Ten eerste heeft een eiwit dat belangrijk is voor MAPK/ERK-signalering, Grb2 genaamd, een SH2-domein en daarom kan het binden aan receptoren die door JAK's zijn gefosforyleerd (op een vergelijkbare manier als PI3K). [17] Grb2 functioneert dan om de MAPK/ERK-route te laten vorderen. Ten tweede kan een eiwit dat wordt geactiveerd door de MAPK/ERK-route, MAPK (mitogeen-geactiveerd eiwitkinase) genaamd, STAT's fosforyleren, wat de gentranscriptie door STAT's kan verhogen. [17] Hoewel MAPK de door STAT's geïnduceerde transcriptie kan verhogen, geeft één onderzoek aan dat fosforylering van STAT3 door MAPK de STAT3-activiteit kan verminderen. [18]

Een voorbeeld van JAK-STAT-signalering die integreert met andere routes is Interleukine-2 (IL-2)-receptorsignalering in T-cellen. IL-2-receptoren hebben γ (gamma)-ketens, die zijn geassocieerd met JAK3, dat vervolgens de belangrijkste tyrosines op de staart van de receptor fosforyleert. [19] Fosforylering rekruteert vervolgens een adapter-eiwit genaamd Shc, dat de MAPK/ERK-route activeert en dit vergemakkelijkt de genregulatie door STAT5. [19]

Alternatieve signaalroute

Er is ook een alternatief mechanisme voor JAK-STAT-signalering voorgesteld. In dit model kunnen SH2-domeinbevattende kinasen binden aan gefosforyleerde tyrosines op receptoren en direct STAT's fosforyleren, wat resulteert in STAT-dimerisatie. [6] Daarom kunnen STAT's, in tegenstelling tot het traditionele mechanisme, niet alleen door JAK's worden gefosforyleerd, maar ook door andere receptorgebonden kinasen. Dus als een van de kinasen (JAK of het alternatieve SH2-bevattende kinase) niet kan functioneren, kan er nog steeds signalering plaatsvinden door activiteit van het andere kinase. [6] Dit is experimenteel aangetoond. [20]

Aangezien veel JAK's geassocieerd zijn met cytokinereceptoren, speelt de JAK-STAT-signaleringsroute een belangrijke rol bij de signalering van cytokinereceptoren. Omdat cytokinen stoffen zijn die door immuuncellen worden geproduceerd en de activiteit van naburige cellen kunnen veranderen, worden de effecten van JAK-STAT-signalering vaak sterker waargenomen in cellen van het immuunsysteem. JAK3-activering als reactie op IL-2 is bijvoorbeeld van vitaal belang voor de ontwikkeling en functie van lymfocyten. [21] Een studie geeft ook aan dat JAK1 nodig is om de receptoren van de cytokines IFNγ, IL-2, IL-4 en IL-10 te signaleren. [22]

De JAK-STAT-route in cytokine-receptorsignalering kan STAT's activeren, die aan DNA kunnen binden en de transcriptie mogelijk maken van genen die betrokken zijn bij immuunceldeling, overleving, activering en rekrutering. STAT1 kan bijvoorbeeld de transcriptie mogelijk maken van genen die de celdeling remmen en ontstekingen stimuleren. [2] STAT4 kan ook NK-cellen (natural killer-cellen) activeren en STAT5 kan de vorming van witte bloedcellen stimuleren. [2] [23] Als reactie op cytokines, zoals IL-4, kan JAK-STAT-signalering ook STAT6 stimuleren, wat de proliferatie van B-cellen, de overleving van immuuncellen en de productie van een antilichaam genaamd IgE kan bevorderen. [2]

JAK-STAT-signalering speelt een belangrijke rol bij de ontwikkeling van dieren. De route kan de deling van bloedcellen bevorderen, evenals differentiatie (het proces waarbij een cel meer gespecialiseerd wordt). [24] Bij sommige vliegen met defecte JAK-genen kan te veel bloedceldeling optreden, met mogelijk leukemie tot gevolg. [25] JAK-STAT-signalering is ook in verband gebracht met overmatige deling van witte bloedcellen bij mensen en muizen. [24]

De signaalroute is ook cruciaal voor de oogontwikkeling bij de fruitvlieg (Drosophila melanogaster). Wanneer mutaties optreden in genen die coderen voor JAK's, kunnen sommige cellen in het oog zich mogelijk niet delen en is aangetoond dat andere cellen, zoals fotoreceptorcellen, zich niet correct ontwikkelen. [24]

De volledige verwijdering van een JAK en een STAT in Drosophila veroorzaakt de dood van Drosophila embryo's, terwijl mutaties in de genen die coderen voor JAK's en STAT's misvormingen in de lichaamspatronen van vliegen kunnen veroorzaken, met name defecten in de vorming van lichaamssegmenten. [24] Een theorie over hoe interferentie met JAK-STAT-signalering deze defecten kan veroorzaken, is dat STAT's direct aan DNA kunnen binden en de transcriptie van genen die betrokken zijn bij het vormen van lichaamssegmenten kunnen bevorderen, en daarom ervaren vliegen door JAK's of STAT's te muteren segmentatiedefecten . [26] STAT-bindingsplaatsen zijn geïdentificeerd op een van deze genen, genaamd even overgeslagen (vooravond), om deze theorie te ondersteunen. [27] Van alle segmentstrepen die worden aangetast door JAK- of STAT-mutaties, wordt de vijfde streep het meest aangetast, de exacte moleculaire redenen hierachter zijn nog onbekend. [24]

Gezien het belang van de JAK-STAT-signaleringsroute, met name bij cytokinesignalering, zijn er verschillende mechanismen die cellen bezitten om de hoeveelheid signalering die optreedt te reguleren. Drie belangrijke groepen eiwitten die cellen gebruiken om deze signaalroute te reguleren, zijn eiwitremmers van geactiveerde STAT (PIAS), [28] eiwittyrosinefosfatasen (PTP's) [29] en suppressors van cytokinesignalering (SOCS). [30]

Eiwitremmers van geactiveerde STAT's (PIAS)

PIAS is een eiwitfamilie met vier leden die bestaat uit: PIAS1, PIAS3, PIASx en PIASγ. [31] De eiwitten voegen een marker toe, genaamd SUMO (small ubiquitine-like modifier), aan andere eiwitten, zoals JAK's en STAT's, waardoor hun functie wordt gewijzigd. [31] Het is aangetoond dat de toevoeging van een SUMO-groep aan STAT1 door PIAS1 activering van genen door STAT1 voorkomt. [32] Andere onderzoeken hebben aangetoond dat het toevoegen van een SUMO-groep aan STAT's de fosforylering van tyrosines op STAT's kan blokkeren, waardoor hun dimerisatie wordt voorkomen en JAK-STAT-signalering wordt geremd. [33] Van PIASγ is ook aangetoond dat het de werking van STAT1 verhindert. [34] PIAS-eiwitten kunnen ook functioneren door te voorkomen dat STAT's aan DNA binden (en dus genactivering te voorkomen), en door eiwitten te rekruteren die histondeacetylasen (HDAC's) worden genoemd, die het niveau van genexpressie verlagen. [31]

Eiwittyrosinefosfatasen (PTP's)

Omdat het toevoegen van fosfaatgroepen aan tyrosines zo'n belangrijk onderdeel is van de werking van de JAK-STAT-signaleringsroute, kan het verwijderen van deze fosfaatgroepen de signalering remmen. PTP's zijn tyrosinefosfatasen en zijn dus in staat deze fosfaten te verwijderen en signalering te voorkomen. Drie belangrijke PTP's zijn SHP-1, SHP-2 en CD45. [35]

    . SHP-1 komt voornamelijk tot expressie in bloedcellen. [36] Het bevat twee SH2-domeinen en een katalytisch domein (het gebied van een eiwit dat de hoofdfunctie van het eiwit vervult) - het katalytische domein bevat de aminozuursequentie VHCSAGIGRTG (een sequentie die typisch is voor PTP's). [37] Zoals bij alle PTP's zijn een aantal aminozuurstructuren essentieel voor hun functie: geconserveerde cysteïne-, arginine- en glutamine-aminozuren en een lus gemaakt van tryptofaan, proline en aspartaat-aminozuren (WPD-lus). [37] Wanneer SHP-1 inactief is, interageren de SH2-domeinen met het katalytische domein, en dus kan de fosfatase niet functioneren. [37] Wanneer SHP-1 echter wordt geactiveerd, bewegen de SH2-domeinen weg van het katalytische domein, waardoor de katalytische plaats wordt blootgelegd en daardoor fosfatase-activiteit mogelijk wordt. [37] SHP-1 is dan in staat om fosfaatgroepen te binden en te verwijderen van de JAK's die zijn geassocieerd met receptoren, waardoor de transfosforylering die nodig is om de signaalroute te laten vorderen, wordt voorkomen.

Een voorbeeld hiervan is te zien in de JAK-STAT-signaleringsroute die wordt gemedieerd door de erytropoëtinereceptor (EpoR). Hier bindt SHP-1 direct aan een tyrosineresidu (op positie 429) op EpoR en verwijdert het fosfaatgroepen van de receptor-geassocieerde JAK2. [38] Het vermogen van SHP-1 om de JAK-STAT-route negatief te reguleren is ook waargenomen in experimenten met muizen zonder SHP-1. [39] Deze muizen vertonen kenmerken van auto-immuunziekten en vertonen hoge niveaus van celproliferatie, die typische kenmerken zijn van een abnormaal hoog niveau van JAK-STAT-signalering. [39] Bovendien is het toevoegen van methylgroepen aan het SHP-1-gen (dat de geproduceerde hoeveelheid SHP-1 vermindert) in verband gebracht met lymfoom (een type bloedkanker). [40]

SHP-1 kan echter ook JAK-STAT-signalering bevorderen. Een studie in 1997 wees uit dat SHP-1 mogelijk hogere hoeveelheden STAT-activering mogelijk maakt, in tegenstelling tot het verminderen van STAT-activiteit. [41] Een gedetailleerd moleculair begrip van hoe SHP-1 de signaalroute zowel kan activeren als remmen, is nog onbekend. [35]

    . SHP-2 heeft een zeer vergelijkbare structuur als SHP-1, maar in tegenstelling tot SHP-1 wordt SHP-2 in veel verschillende celtypen geproduceerd - niet alleen in bloedcellen. [42] Mensen hebben twee SHP-2-eiwitten, elk bestaande uit 593 en 597 aminozuren. [37] De SH2-domeinen van SHP-2 lijken een belangrijke rol te spelen bij het beheersen van de activiteit van SHP-2. Een van de SH2-domeinen bindt aan het katalytische domein van SHP-2, om het functioneren van SHP-2 te voorkomen. [35] Als een eiwit met een gefosforyleerd tyrosine bindt, verandert het SH2-domein van oriëntatie en wordt SHP-2 geactiveerd. [35] SHP-2 is dan in staat om fosfaatgroepen van JAK's, STAT's en de receptoren zelf te verwijderen - dus, net als SHP-1, kan het de fosforylering voorkomen die nodig is om de route voort te zetten, en daarom de JAK-STAT-signalering remmen. Net als SHP-1 is SHP-2 in staat deze fosfaatgroepen te verwijderen door de werking van de geconserveerde cysteïne-, arginine-, glutamine- en WPD-lus. [37]

Negatieve regulatie door SHP-2 is gemeld in een aantal experimenten - een voorbeeld was bij het verkennen van JAK1/STAT1-signalering, waarbij SHP-2 in staat is om fosfaatgroepen te verwijderen van eiwitten in de route, zoals STAT1. [43] Op een vergelijkbare manier is ook aangetoond dat SHP-2 de signalering met STAT3- en STAT5-eiwitten vermindert door fosfaatgroepen te verwijderen. [44] [45]

Net als SHP-1 wordt ook aangenomen dat SHP-2 in sommige gevallen JAK-STAT-signalering bevordert en signalering remt. Een onderzoek geeft bijvoorbeeld aan dat SHP-2 STAT5-activiteit kan bevorderen in plaats van verminderen. [46] Ook stellen andere onderzoeken voor dat SHP-2 de JAK2-activiteit kan verhogen en JAK2/STAT5-signalering kan bevorderen. [47] Het is nog steeds onbekend hoe SHP2 zowel JAK-STAT-signalering in de JAK2/STAT5-route kan remmen als bevorderen. Een theorie is dat SHP-2 de activering van JAK2 kan bevorderen, maar STAT5 kan remmen door fosfaatgroepen eruit te verwijderen. [35]

    . CD45 wordt voornamelijk geproduceerd in bloedcellen. [4] Bij mensen is aangetoond dat het kan inwerken op JAK1 en JAK3, [48] terwijl bij muizen CD45 in staat is om op alle JAK's in te werken. [49] Eén onderzoek geeft aan dat CD45 de hoeveelheid tijd dat JAK-STAT-signalering actief is, kan verminderen. [49] De exacte details van de werking van CD45 zijn nog onbekend. [35]

Onderdrukkers van cytokinesignalering (SOCS)

Er zijn acht eiwitleden van de SOCS-familie: cytokine-induceerbaar SH2-domeinbevattend eiwit (CISH), SOCS1, SOCS2, SOCS3, SOCS4, SOCS5, SOCS6 en SOCS7, elk eiwit heeft een SH2-domein en een 40-aminozuur regio genaamd de SOCS-box. [50] De SOCS-box kan een interactie aangaan met een aantal eiwitten om een ​​eiwitcomplex te vormen, en dit complex kan vervolgens de afbraak van JAK's en de receptoren zelf veroorzaken, waardoor de JAK-STAT-signalering wordt geremd. [4] Het eiwitcomplex doet dit door een marker genaamd ubiquitine toe te voegen aan eiwitten, in een proces dat ubiquitinatie wordt genoemd en dat aangeeft dat een eiwit moet worden afgebroken. [51] De eiwitten, zoals JAK's en de receptoren, worden vervolgens getransporteerd naar een compartiment in de cel dat het proteasoom wordt genoemd, dat de eiwitafbraak uitvoert. [51]

SOCS kan ook functioneren door te binden aan eiwitten die betrokken zijn bij JAK-STAT-signalering en door hun activiteit te blokkeren. Het SH2-domein van SOCS1 bindt bijvoorbeeld aan een tyrosine in de activeringslus van JAK's, wat voorkomt dat JAK's elkaar fosforyleren. [4] De SH2-domeinen van SOCS2, SOCS3 en CIS binden rechtstreeks aan de receptoren zelf. [51] Ook kunnen SOCS1 en SOCS3 JAK-STAT-signalering voorkomen door te binden aan JAK's, met behulp van segmenten die kinase-remmende regio's (KIR's) worden genoemd en door de binding van JAK's aan andere eiwitten te stoppen. [52] De exacte details van hoe andere SOCS-functies werken, zijn minder bekend. [4]

Regelgever Positieve of negatieve regulatie Functie
PTP's SHP-1 en SHP-2: Negatief, maar kan ook positief zijn. CD45, PTP1B, TC-PTP: Negatief Verwijdert fosfaatgroepen van receptoren, JAK's en STAT's
SOCS Negatief SOCS1 en SOCS3 blokkeren actieve sites van JAK met KIR-domeinen. SOCS2, SOCS3 en CIS kunnen receptoren binden. SOCS1 en SOCS3 kunnen JAK's en receptor signaleren voor afbraak.
PIAS Negatief Voeg SUMO-groep toe aan STAT's om STAT-activiteit te remmen. Rekruteer histondeacetylasen om de genexpressie te verlagen. Voorkom dat STAT's aan DNA binden.

Aangezien de JAK-STAT-route een belangrijke rol speelt in veel fundamentele processen, zoals apoptose en ontsteking, kunnen disfunctionele eiwitten in de route leiden tot een aantal ziekten. Veranderingen in JAK-STAT-signalering kunnen bijvoorbeeld leiden tot kanker en ziekten die het immuunsysteem aantasten, zoals ernstige gecombineerde immunodeficiëntiestoornis (SCID). [53]

Immuunsysteemgerelateerde ziekten

JAK3 kan worden gebruikt voor de signalering van IL-2, IL-4, IL-15 en IL-21 (evenals andere cytokines). Patiënten met mutaties in het JAK3-gen ervaren daarom vaak problemen die veel aspecten van het immuunsysteem aantasten. [54] [55] Niet-functionele JAK3 veroorzaakt bijvoorbeeld SCID, wat ertoe leidt dat patiënten geen NK-cellen, B-cellen of T-cellen hebben, en dit zou SCID-individuen vatbaar maken voor infectie. [55] Het is aangetoond dat mutaties van het STAT5-eiwit, dat kan signaleren met JAK3, leiden tot auto-immuunziekten. [56]

Er is gesuggereerd dat patiënten met mutaties in STAT1 en STAT2 vaak meer kans hebben op het ontwikkelen van infecties door bacteriën en virussen. [57] Ook zijn STAT4-mutaties in verband gebracht met reumatoïde artritis en zijn STAT6-mutaties gekoppeld aan astma. [58] [59]

Patiënten met een defecte JAK-STAT-signaalroute kunnen ook huidaandoeningen krijgen. Niet-functionele cytokinereceptoren en overexpressie van STAT3 zijn bijvoorbeeld beide in verband gebracht met psoriasis (een auto-immuunziekte die gepaard gaat met een rode, schilferige huid). [55] STAT3 speelt een belangrijke rol bij psoriasis, aangezien STAT3 de productie van IL-23-receptoren kan regelen, en IL-23 de ontwikkeling van Th17-cellen kan helpen, en Th17-cellen psoriasis kunnen induceren. [60] Omdat veel cytokinen werken via de STAT3-transcriptiefactor, speelt STAT3 ook een belangrijke rol bij het handhaven van de immuniteit van de huid. [55] Bovendien, omdat patiënten met JAK3-genmutaties geen functionele T-cellen, B-cellen of NK-cellen hebben, is de kans groter dat ze huidinfecties ontwikkelen.

Kanker Bewerken

Kanker omvat abnormale en oncontroleerbare celgroei in een deel van het lichaam. Daarom, aangezien JAK-STAT-signalering de transcriptie van genen die betrokken zijn bij celdeling mogelijk kan maken, is een mogelijk effect van overmatige JAK-STAT-signalering kankervorming. Hoge niveaus van STAT-activering zijn in het bijzonder in verband gebracht met kanker, grote hoeveelheden STAT3- en STAT5-activering zijn meestal gekoppeld aan gevaarlijkere tumoren. [61] Te veel STAT3-activiteit is bijvoorbeeld in verband gebracht met het vergroten van de kans dat melanoom (huidkanker) terugkeert na de behandeling en abnormaal hoge niveaus van STAT5-activiteit zijn in verband gebracht met een grotere kans op overlijden van de patiënt door prostaatkanker. [62] [61] Veranderde JAK-STAT-signalering kan ook betrokken zijn bij het ontwikkelen van borstkanker. JAK-STAT-signalering in borstklieren (in de borsten) kan celdeling bevorderen en celapoptose verminderen tijdens zwangerschap en puberteit, en daarom kan bij overmatige activering kanker ontstaan. [63] Hoge STAT3-activiteit speelt een belangrijke rol in dit proces, omdat het de transcriptie van genen zoals BCL2 en c-Myc, die betrokken zijn bij de celdeling. [63]

Mutaties in JAK2 kunnen leiden tot leukemie en lymfoom. [6] Specifiek wordt voorgesteld dat mutaties in exons 12, 13, 14 en 15 van het JAK2-gen een risicofactor zijn bij het ontwikkelen van lymfoom of leukemie. [6] Bovendien kunnen gemuteerde STAT3 en STAT5 de JAK-STAT-signalering in NK- en T-cellen verhogen, wat een zeer hoge proliferatie van deze cellen bevordert en de kans op het ontwikkelen van leukemie vergroot. [63] Ook kan een JAK-STAT-signaleringsroute die wordt gemedieerd door erytropoëtine (EPO), die gewoonlijk de ontwikkeling van rode bloedcellen mogelijk maakt, worden gewijzigd bij patiënten met leukemie. [64]

Behandelingen Bewerken

Aangezien overmatige JAK-STAT-signalering verantwoordelijk is voor sommige kankers en immuunstoornissen, zijn JAK-remmers voorgesteld als geneesmiddelen voor therapie. Om bijvoorbeeld sommige vormen van leukemie te behandelen, zou het richten op en remmen van JAK's de effecten van EPO-signalering kunnen elimineren en misschien de ontwikkeling van leukemie kunnen voorkomen. [64] Een voorbeeld van een JAK-remmer is Ruxolitinib, dat wordt gebruikt als een JAK2-remmer. [61] STAT-remmers worden ook ontwikkeld en veel van de remmers richten zich op STAT3. [63] Er is gemeld dat therapieën die gericht zijn op STAT3 de overleving van patiënten met kanker kunnen verbeteren. [63] Een ander medicijn, Tofacitinib genaamd, is gebruikt voor de behandeling van psoriasis en reumatoïde artritis en is onlangs goedgekeurd voor de behandeling van de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa. [53]


Beeldvorming en spectroscopische analyse van levende cellen

Xin Zhou, . Jin Zhang, in Methoden in Enzymologie, 2012

3.1.1 Inleiding

Eiwitkinasen zijn enzymen die de overdracht van het γ-fosfaat van ATP naar de eiwitsubstraten katalyseren, waardoor hun functies veranderen. Deze signaalenzymen spelen een cruciale en complexe rol bij het reguleren van cellulaire signaaltransductie omdat ze meerdere intracellulaire processen orkestreren, zoals glycogeensynthese, hormoonresponsen en ionentransport. Veel signaalcascades waarbij eiwitkinasen betrokken zijn, vereisen dynamische controle en ruimtelijke compartimentalisatie van kinase-activiteit, die continu moet worden gevolgd in verschillende compartimenten en signalerende microdomeinen in levende cellen. Traditionele methoden om de activiteit van eiwitkinasen te bestuderen, bieden echter alleen statische en beperkte momentopnamen van signaleringsgebeurtenissen en slagen er niet in de dynamische veranderingen van kinase-activiteit vast te leggen. Aan de andere kant bieden genetisch codeerbare FRET-gebaseerde biosensoren een veelzijdige en krachtige benadering om de spatiotemporele patronen van kinase-signalering op te helderen.


Fosforylering - ( 19 november 2006 )

Ervan uitgaande dat de grootte 57 KD is, zal fosforylering weinig of geen effect hebben op de positie van de band op een SDS PAGE-gel. SDS lineariseert het eiwit en maakt de elektroforese in wezen onafhankelijk van lading, en fosforylering verandert het molecuulgewicht van zo'n groot eiwit met slechts een zeer kleine hoeveelheid.

het hangt af van de mate van fosforylering ongeveer 12 mol Pi per mol eiwit maak een verschuiving van ongeveer 1 kDa er zijn artikelen waarin wetenschappers autofosforylatievormen van kinasen discrimineren met 1 tot 2 kDa in geschikte SDS-systemen veel eiwitten zijn meervoudig fosforyleerbaar, zelfs bij niet- gedocumenteerde fosforyleringsplaatsen

Als je een lange sds-page-gel gebruikt en antilichaam gebruikt tegen de gefosforyleerde en niet-gefosforyleerde vorm van het eiwit, zou je de twee vormen op de vlek moeten kunnen zien. Maar wanneer ik gefosforyleerde en niet-gefosforyleerde Rb op de western blot probeer te onderscheiden, krijg ik meer dan twee banden.

Als je een lange sds-page-gel gebruikt en antilichaam gebruikt tegen de gefosforyleerde en niet-gefosforyleerde vorm van het eiwit, zou je de twee vormen op de vlek moeten kunnen zien. Maar wanneer ik gefosforyleerde en niet-gefosforyleerde Rb op de western blot probeer te onderscheiden, krijg ik meer dan twee banden.

veel, zo niet de meeste eiwitten zijn meervoudig gefosforyleerd in SDS alleen S/T- en Y-fosforylaties zijn stabiel elke S/T of Y is een potentiële fosforyleringsplaats, ondanks of het gedocumenteerd is als een echte fosforylatieplaats of niet

dus meerdere banden kunnen verschillende toestanden/graden van fosforylering vertegenwoordigen

als je echt geïnteresseerd bent in de mate van fosforylering, probeer dan pI en fosforylering te correleren als je de oorspronkelijke pI kent

tegenwoordig probeer ik erachter te komen hoe mensen toewijzen aan een eiwit waaraan ik werk met een molecuulgewicht van 62 kDa en maximaal drie fosforylatieplaatsen, een vorm van 72 kDa om de gefosforyleerde vorm te zijn. Ik probeer te bewijzen dat het niet de gefosforyleerde vorm is, simpelweg omdat het niet kan zijn

'Dus jij kunt niet-gefosforyleerde en gefosforyleerde eiwitten (max. drie sites) niet onderscheiden op een eenvoudige 1D SDS-PAGE.

Ja
door het specifieke antilichaam voor uw fosforyleringsplaatsen te gebruiken.

'Dus jij kunt niet-gefosforyleerde en gefosforyleerde eiwitten (max. drie sites) niet onderscheiden op een eenvoudige 1D SDS-PAGE.


Binding initieert een signaleringstraject

Nadat het ligand aan de celoppervlakreceptor bindt, zet de activering van de intracellulaire componenten van de receptor een reeks gebeurtenissen in gang die een signaalroute of een signaalcascade wordt genoemd. In een signaalroute interageren second messengers, enzymen en geactiveerde eiwitten met specifieke eiwitten, die op hun beurt worden geactiveerd in een kettingreactie die uiteindelijk leidt tot een verandering in de celomgeving (Figuur (PageIndex<1>)). De gebeurtenissen in de cascade gebeuren in een reeks, net zoals een stroom in een rivier. Interacties die vóór een bepaald punt plaatsvinden, worden gedefinieerd als stroomopwaartse gebeurtenissen en gebeurtenissen na dat punt worden stroomafwaartse gebeurtenissen genoemd.

Kunstverbinding Figuur (PageIndex<1>): De epidermale groeifactor (EGF) receptor (EGFR) is een receptortyrosinekinase die betrokken is bij de regulatie van celgroei, wondgenezing en weefselherstel. Wanneer EGF aan de EGFR bindt, zorgt een cascade van stroomafwaartse gebeurtenissen ervoor dat de cel groeit en deelt. Als EGFR op ongepaste tijdstippen wordt geactiveerd, kan ongecontroleerde celgroei (kanker) optreden.

Bij bepaalde kankers wordt de GTPase-activiteit van het RAS G-eiwit geremd. Dit betekent dat het RAS-eiwit GTP niet meer kan hydrolyseren tot GDP. Welk effect zou dit hebben op stroomafwaartse cellulaire gebeurtenissen?

Signaalroutes kunnen zeer snel zeer gecompliceerd worden omdat de meeste cellulaire eiwitten verschillende stroomafwaartse gebeurtenissen kunnen beïnvloeden, afhankelijk van de omstandigheden in de cel. Een enkele route kan vertakken naar verschillende eindpunten op basis van het samenspel tussen twee of meer signaalroutes, en dezelfde liganden worden vaak gebruikt om verschillende signalen in verschillende celtypen te initiëren. Deze variatie in respons is te wijten aan verschillen in eiwitexpressie in verschillende celtypen. Een ander complicerend element is signaalintegratie van de paden, waarbij signalen van twee of meer verschillende celoppervlakreceptoren samensmelten om dezelfde reactie in de cel te activeren. Dit proces kan ervoor zorgen dat aan meerdere externe vereisten wordt voldaan voordat een cel zich verbindt tot een specifiek antwoord.

De effecten van extracellulaire signalen kunnen ook worden versterkt door enzymatische cascades. Bij de start van het signaal bindt een enkele ligand aan een enkele receptor. Activering van een receptorgebonden enzym kan echter veel kopieën van een component van de signaalcascade activeren, waardoor het signaal wordt versterkt.


7 manieren om eiwitfosforylering te bestuderen

2%) door een kinase en verwijderd door een fosfatase (Figuur 1). [1] Fosforylering bij andere aminozuren is ook gemeld. [2] Fosforylering kan de structuur, functie en interacties van eiwitten wijzigen. Als zodanig speelt fosforylering een cruciale rol in vrijwel alle cellulaire processen bij homeostase en ziekte, inclusief signaaltransductie, celcyclus, differentiatie, proliferatie, metabolisme, motiliteit en dood. [3,4] Belangrijk is dat fosforylering op verschillende residuen verschillende uitkomsten kan veroorzaken. RAF1 is bijvoorbeeld een kinase dat centraal staat in de MAPK-route en wordt geactiveerd wanneer het wordt gefosforyleerd op serine- (S) of threonine (T)-residuen S259, S338, S340/341, T491 of S494. [5,6] Fosforylering op S289/296/301 resulteert echter in de remming van RAF1-kinase-activiteit. [7] Het begrijpen van de specifieke locaties en het niveau van fosforylering is van het grootste belang bij het begrijpen van celsignalering en fenotype. In deze blog worden zeven onderzoekstools voor het bestuderen van eiwitfosforylering besproken en vergeleken.

Figuur 1. Toevoeging en verwijdering van eiwitfosforylering via kinasen en fosfatasen.

Onderzoeksmethoden

Natriumdodecylsulfaat Polyacrylamide Gelelektroforese (SDS-PAGE)

Eiwitten in een monster – vaak cel- of weefsellysaten – worden eerst op grootte gescheiden met behulp van SDS-PAGE. Dit is mogelijk omdat de negatief geladen SDS in de buffer en gel een negatieve lading op alle aminozuren uniform aanbrengt, waardoor de eiwitten in een elektrisch veld kunnen worden gescheiden op basis van grootte in plaats van hun unieke aminozuurgehalte en lading (Figuur 2A ). [8] Eiwitten kunnen vervolgens worden gevisualiseerd met Coomassie-blauw of zilverkleuring. Met name SDS-PAGE met Coomassie-blauwe of zilverkleuring kan worden gebruikt om te detecteren sommige fosforyleringsgebeurtenissen die ervoor zorgen dat eiwitten langzamer migreren dan hun niet-gefosforyleerde tegenhangers. Een duidelijk nadeel van deze benadering is dat migratieverschuivingen als gevolg van andere factoren (bijv. glycosylering) niet kunnen worden geëlimineerd. Aangezien alle eiwitten met deze benadering worden gekleurd, wordt voornamelijk de analyse van gezuiverde eiwitten uitgevoerd. Het opnemen van de juiste controles is een belangrijke overweging (zie het vak “Experimentele controles”).

Figuur 2. Western blotting procedure om gefosforyleerde eiwitten te detecteren. A) Eiwitten worden gescheiden via SDS-PAGE waarbij baan 1 = eiwitladder, baan 2 = niet-gefosforyleerd eiwit en baan 3 = gefosforyleerd eiwit. B) Eiwitten worden via spanning naar een membraan overgebracht. C) Het membraan wordt geïncubeerd met een antilichaam dat specifiek is voor de gefosforyleerde plaats van belang en vervolgens met een HRP-geconjugeerd secundair antilichaam. D) Nadat een HRP-substraat is toegevoegd, wordt antilichaambinding (aan de band die het gefosforyleerde eiwit vertegenwoordigt) gedetecteerd via chemiluminescentie.
Experimentele controles

Het opnemen van de juiste controles is essentieel voor elk goed uitgevoerd experiment, en fosforyleringsonderzoeken zijn niet anders. Belangrijke controles om te overwegen zijn onder meer:

  • Expressieniveau van een huishoudgen (bijv. GAPDH, bèta-actine) om ervoor te zorgen dat dezelfde hoeveelheid eiwit wordt toegevoegd aan elk putje van een SDS-PAGE-gel (laadcontrole voor western blotting).
  • Expressieniveau van het totale eiwit (d.w.z. zowel gefosforyleerd als niet-gefosforyleerd eiwit). Dit zal helpen bepalen of eiwitfosforylering of expressie van het eiwit is opwaarts of neerwaarts gereguleerd.
  • Gefosforyleerd peptide of eiwit met fosforylering op een specifieke plaats (positieve controle). Peptiden kunnen chemisch worden gesynthetiseerd. Gefosforyleerde eiwitten kunnen worden verkregen 1) met in vitro fosforylering door een kinase met bekende activiteit te mengen met het eiwit van belang, of 2) door cellen te stimuleren met bekend effect op het eiwit van belang.
  • Niet-gefosforyleerd peptide of eiwit (negatieve controle). In vitro kinase-assays kunnen worden uitgevoerd zonder ATP of de gefosforyleerde eiwitten kunnen worden gedefosforyleerd met behulp van fosfatasen, zoals lambda-eiwitfosfatase. Voor celkweekexperimenten kan een ongefosforyleerde controle worden verkregen met cellen die 1) niet zijn gestimuleerd of 2) zijn behandeld met een specifieke kinaseremmer.
  • Niet-gelabelde cellen om poortparameters te bepalen (negatieve controle voor flowcytometrie)
  • Isotypecontrole om poortparameters te bepalen. Een isotypecontrole is een antilichaam met dezelfde fluorofoor, maar niet specifiek voor het eiwit van belang (negatieve controle voor flowcytometrie)

Houd er rekening mee dat de soorten controles kunnen variëren, afhankelijk van de onderzoekstool die wordt gebruikt. Aanvullende controles die hierboven niet zijn vermeld, kunnen nodig zijn.

Een meer traditionele benadering om gefosforyleerde eiwitten te detecteren met behulp van SDS-PAGE maakt gebruik van radioactief gemerkt ATP tijdens kinasereacties. Het gefosforyleerde eiwit wordt vervolgens gedetecteerd via zijn ingebouwde radio-gelabelde ATP met autoradiografie, fluorografie of fosforbeeldvorming. [8] In tegenstelling tot Coomassie- of zilverkleuring, maakt het gebruik van radioactief gemerkt ATP de specifieke detectie van ongezuiverde gefosforyleerde eiwitten mogelijk. Helaas is het radioactieve label mogelijk niet geschikt voor alle fosforyleringsgebeurtenissen en vormt het gezondheidsrisico's. Alternatieven voor het gebruik van radioactief gemerkt ATP om gefosforyleerde eiwitten te detecteren, zijn onder meer kleuring met methylgroen na hydrolyse van de fosfoesterbinding, het gebruik van een fluorescerende kleurstof die specifiek bindt aan fosforylgroepen (bijv. Pro-Q Diamond), of het gebruik van metaalchelatie om een ​​kleurstof aan de fosforyl groep.[9] Phos-Tag™ is bijvoorbeeld een dinucleair metaalcomplex dat bij neutrale pH sterk aan de fosforylgroep bindt. [10] Phos-Tag™ is geprefabriceerd tot een gel en remt significant de migratie van gefosforyleerde eiwitten, ongeacht de fosforyleringsplaats. Elke fosforylering zal dus resulteren in een langzamere migratie dan het niet-gefosforyleerde eiwit, en een eiwit met verschillende fosforyleringsgebeurtenissen kan resulteren in meerdere banden die gemakkelijk van elkaar te onderscheiden zijn. Gezuiverde eiwitten kunnen worden geanalyseerd met behulp van Coomassie- of zilverkleuring, terwijl niet-gezuiverde eiwitten kunnen worden geanalyseerd met western blotting (zie volgende sectie). Phos-TagTM kan worden gebruikt in combinatie met andere toepassingen (bijv. western blotting, massaspectrometrie) om gefosforyleerde eiwitten te detecteren.

Relatieve verschillen in bandintensiteiten over verschillende monsterbehandelingen met SDS-PAGE worden met het oog vergeleken, maar het densitometriesignaal kan worden geëxtraheerd om semi-kwantitatieve gegevens te verkrijgen. Kwantitatieve gegevens zijn mogelijk met SDS-PAGE-analyse met behulp van een standaardcurve, maar worden meestal niet uitgevoerd. [11]



Opmerkingen:

  1. Byrd

    Ja inderdaad. Het was ook bij mij. Laten we deze kwestie bespreken. Hier of op PM.

  2. Vudozil

    Ik vond alles leuk, alleen als ze meer geld zouden geven voor de lezing of een wedstrijd zouden houden, zou het geweldig zijn.

  3. Gokora

    Heb je snel zo'n onvergelijkbare zin uitgevonden?

  4. Ayaan

    Moet je begrijpen dat ze schreef?



Schrijf een bericht