Informatie

Wat is het referentie 16S-rRNA?

Wat is het referentie 16S-rRNA?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Onlangs ben ik op een feit gestuit, waar ik al jaren geen last meer van heb. Feit is dat alle universele 16S-primers worden geschreven als "[FR][0-9]+" (in regex-notatie), dat wil zeggen dat ze een positie hebben ten opzichte van een referentie. Ik heb veel artikelen gelezen waarin deze primers werden geïntroduceerd, en meestal zeggen de auteurs niets anders dan "E. coli 16S". Hoe dan ook, in één geval heb ik ontdekt dat het in feite de referentie K12 E. coli is. Maar het probleem is dat het 7 verschillende rRNA-operons heeft: rrnA, rrnB, rrnC, rrnD, rrnE, rrnF, rrnG. Heb je een referentie met een bepaald operon dat wordt gebruikt voor de 16S-positienotatie?

Bewerking

Figuur 2. Hypervariabele gebieden binnen het 16S-rRNA-gen in Pseudomonas. De uitgezette lijn weerspiegelt fluctuaties in variabiliteit tussen uitgelijnde 16S rRNA-gensequenties van 79 Pseudomonas-type stammen ... (Bodilis et al., 2012)


Zoals je terecht opmerkt, is het ontwerpen van een optimaal primerpaar voor 16S-rRNA-sequencing een lastige aangelegenheid, omdat zelfs de minder variabele regio's niet hetzelfde zijn tussen verschillende stammen en soorten. Sambo et al (2018) hebben zelfs bio-informatica-software ontwikkeld voor een optimaal ontwerp van primers voor 16S-rRNA-sequencing voor meerdere bacteriën.

We stellen hier een computationele methode voor voor het optimaliseren van de keuze van primersets, gebaseerd op multi-objectieve optimalisatie, die tegelijkertijd: 1) de efficiëntie en specificiteit van doelamplificatie maximaliseert; 2) maximaliseert het aantal verschillende bacteriële 16S-sequenties die overeenkomen met ten minste één primer; 3) minimaliseert de verschillen in het aantal primers dat overeenkomt met elke bacteriële 16S-sequentie. Ons algoritme kan worden toegepast op elke gewenste ampliconlengte zonder de rekenprestaties te beïnvloeden.

Er is diversiteit in de 16S-rRNA-genen binnen dezelfde soort, d.w.z. de verschillende kopieën zijn geen exacte duplicaten (Větrovský & Baldrian, 2013).

Větrovský & Baldrian (2013)

Interessant is dat de verschillende rRNA-operons in E coli hebben verschillende promotors en worden zelfs differentieel tot expressie gebracht tijdens stressomstandigheden (Kurylo et al., 2018).

Echter, Kitahara et al. (2012) ontdekten dat 16S-rRNA-genen geïsoleerd uit grondmonsters, in plaats van het origineel E coli gen, zou de groei ervan kunnen ondersteunen. Met andere woorden E coli is zeer robuust tegen mutaties in zijn 16S-rRNA.

Na tegenselectie werden -200 klonen van KT103-derivaten (die pRB103 droegen waarvan het 16S-rRNA-gen was vervangen door vreemde genen) verkregen, waaruit 33 niet-redundante 16S-rRNA-genen (A01-H03) werden geïdentificeerd. Door meervoudige uitlijning van E. coli 16S rRNA en onze metagenomisch opgehaalde 16S rRNA-sequenties, werd gevonden dat ten minste 628 (40,7%) van de 1.542 nucleotiden variabel waren, wat wijst op een duidelijke mutatierobuustheid van het 16S-rRNA. Opvallend is dat de functionele 16S-rRNA-sequenties (behalve A10 en F02, die voor 99,0% identiek waren aan E. coli 16S-rRNA) die in dit onderzoek werden verkregen, slechts 80,9-89,3% identiteit vertoonden met E. coli 16S-rRNA, wat ver onder de gerapporteerde waarde was. tot nu toe (Proteus vulgaris 16S rRNA, 94% identiteit met E. coli 16S rRNA)


Voor uw vraag

Maar het probleem is dat het 7 verschillende rRNA-operons heeft: rrnA, rrnB, rrnC, rrnD, rrnE, rrnF, rrnG. Heb je een referentie met een bepaald operon dat wordt gebruikt voor de 16S-positienotatie?

Ik denk niet dat een van hen als de referentie wordt beschouwd. Het complete E coli 16S-rRNA-sequentie gerapporteerd in NCBI lijkt een "consensus" van verschillende gerapporteerde sequenties te beschouwen:

[5], [7] bevatten bijgewerkte sequentiegegevens voor het oorspronkelijke werk van hetzelfde laboratorium [4]. Er waren te veel discrepanties tussen [4] en [5], [7] om elke revisie in onze sitetabel te vermelden. De getoonde volgorde is van [7]. [4], [5], [7] wijzen op een aantal cistron-heterogeniteiten. Er is echter onzekerheid over het toewijzen van deze verschillende heterogeniteiten aan specifieke cistrons. De RNA-methode die wordt gebruikt door [4], [5], [7] geeft het gemiddelde van alle cistrons die in de cel aanwezig zijn [7]. De heterogeniteiten worden ingedeeld naar hun relatieve verhoudingen in grote, kleine en onbepaalde soorten. De getoonde volgorde komt overeen met de belangrijkste soorten. De heterogeniteiten werden geannoteerd als variaties in de tabel met sites. Het is niet bekend welke van de residuen 'c' (base 633) of 'a' (base 641) een deletie ondergaat, waardoor de kleine component 'atctg' ontstaat. [7] suggereert het bestaan ​​van een of twee gemuteerde cistrons onder de bekende zeven cistrons van ribosomaal RNA. Met uitzondering van een enkele base-deletie is deze sequentie identiek aan de huidige 16S rDNA-sequentie voor het E.coli rRNB-gen.

De NCBI-pagina vermeldt ook verschillende polymorfismen en basemodificaties in het 16S-rRNA binnen en tussen verschillende stammen/"soorten".

NCBI heeft ook verschillende gedeeltelijke sequenties. Toen ik controleerde voor P.aeruginosa en B.subtilis, Ik kon slechts een of twee volledige reeksen vinden (de rest was gedeeltelijk). Bovendien gaf elk item de stam aan waaruit het was verkregen. Daarom neem ik aan dat er geen enkele referentiereeks is.

Ik denk dat mensen de verschillende varianten in overweging nemen tijdens het doen van fylogenetische analyse (of gewoon zoeken naar geconserveerde "signature" sequenties voor een bepaalde soort). Ik ben er zeker van dat er computationele algoritmen zijn om de classificatie op een optimale manier uit te voeren (zie Chatellier et al., 2014). Aangezien ik geen expertise op dit gebied heb, kan ik niets met zekerheid zeggen over de routinepraktijk. In feite is er nog steeds onderzoek gaande om de analyse te verbeteren (bijvoorbeeld Yang et al., 2016 en Sambo et al., 2018).


  • Deze methode is effectief bij het identificeren van algemene groepsverschillen van pathogenen.
  • 16S-rRNA-gensequenties bevatten hypervariabele regio's die soortspecifieke kenmerkende sequenties kunnen verschaffen die nuttig zijn voor bacteriële identificatie.
  • Deze methode kan ook worden verfijnd om pathogenen op soortniveau te identificeren.
  • ribosomen: Grote en complexe moleculaire machine, gevonden in alle levende cellen, die dient als de primaire plaats van biologische eiwitsynthese.

Zestien S-ribosomaal RNA (of 16S-rRNA) is een onderdeel van de kleine 30S-subeenheid van prokaryotische ribosomen. Het is ongeveer 1,5 kb (of 1500 nucleotiden) lang. De genen die ervoor coderen, worden 16S-rDNA genoemd en worden gebruikt bij het reconstrueren van fylogenieën. Binnen een enkele bacterie kunnen meerdere sequenties van 16S-rRNA voorkomen.

Figuur: ribosomaal RNA: Structuur en vorm van het E.coli 70S ribosoom. De grote 50S ribosomale subeenheid (rood) en kleine 30S ribosomale subeenheid (blauw) worden weergegeven met een schaalbalk van 200 & Aringngstrom (20 nm). Voor de 50S-subeenheid worden de 23S (donkerrood) en 5S (oranjerood) rRNA's en de ribosomale eiwitten (roze) weergegeven. Voor de 30S-subeenheid worden het 16S-rRNA (donkerblauw) en de ribosomale eiwitten (lichtblauw) weergegeven.

Het 16SrRNA-gen wordt gebruikt voor fylogenetische studies, omdat het sterk geconserveerd is tussen verschillende soorten bacteriën en archaea. Carl Woese was een pionier in dit gebruik van 16S-rRNA. Bovendien worden ook mitochondriaal en chloroplastisch rRNA geamplificeerd. Helaas, hoewel primers kunnen worden gedefinieerd om dit gen uit enkele genomen te versterken, is deze methode niet nauwkeurig genoeg om de diversiteit van microbiële gemeenschappen uit hun omgeving te schatten. De belangrijkste limieten zijn het ontbreken van echte universele primers.

Paradoxaal genoeg is methodologische ontkenning nu een regel in gepubliceerde artikelen die 16S rRNA-genamplicononderzoeken gebruiken om onbekende microbiële gemeenschappen te bestuderen. In deze artikelen wordt één paar primers (hoewel veel ervan zijn ontworpen en verschillende resultaten opleveren) gebruikt om een ​​gebied van het 16S-rRNA-gen te amplificeren. Naast sterk geconserveerde primerbindingsplaatsen, bevatten 16S-rRNA-gensequenties hypervariabele gebieden die soortspecifieke signatuursequenties kunnen verschaffen die nuttig zijn voor bacteriële identificatie. Als gevolg hiervan is 16S-rRNA-gensequencing gangbaar geworden in de medische microbiologie als een snel en goedkoop (hoewel onnauwkeurig) alternatief voor fenotypische methoden voor bacteriële identificatie. Hoewel het oorspronkelijk werd gebruikt om bacteriën te identificeren, bleek 16S-sequencing vervolgens in staat om bacteriën te herclassificeren in volledig nieuwe soorten, of zelfs geslachten. Het is ook gebruikt om nieuwe soorten te beschrijven die nooit met succes zijn gekweekt.


Wat is 16S-rRNA

16S-rRNA is een type rRNA dat verantwoordelijk is voor het vormen van de kleine subeenheid van het prokaryotische ribosoom. Het is significant dat de grootte van het 16S-rRNA 1542 nt is. Over het algemeen heeft het een structurele rol die vergelijkbaar is met het rRNA in de grote subeenheid om ribosomale eiwitten op gedefinieerde posities te ondersteunen. Bovendien vergemakkelijkt het de binding van de kleine subeenheid aan de grote subeenheid door interactie met het 23S-rRNA in de grote subeenheid.

Figuur 1: 16S rRNA-structuur

Verder bestaat de driedimensionale structuur van het 16S-rRNA uit vier domeinen. Ook bevat het 3′-uiteinde van het 16S-rRNA een ti-Shine-Dalgarno-sequentie, die kan binden aan de Shine-Dalgarno-sequentie van het mRNA dat door het ribosoom moet worden getranslateerd. In het algemeen vindt deze sequentie op het mRNA plaats rond de acht basen stroomopwaarts van het startcodon, AUG. Aan de andere kant is 16S-rRNA verantwoordelijk voor het stabiliseren van de koppeling van codon en anticodon op de A-plaats van het ribosoom.


Nieuwe ribosomale RNA BLAST-databases beschikbaar op de web-BLAST-service en om te downloaden

We hebben een samengestelde set van ribosomale RNA (rRNA) referentiesequenties (Targeted Loci) met verifieerbare organismebronnen en huidige namen. Deze set is van cruciaal belang voor het correct identificeren en classificeren van prokaryotische (bacteriën en archaea) en schimmelmonsters (tabel 1). Om gemakkelijke toegang tot deze reeksen te bieden, hebben we onlangs een aparte rRNA/ITS-databases sectie op de nucleotide BLAST-pagina voor deze gerichte sequenties, waardoor het gemakkelijk is om bronorganismen snel te identificeren (Figuur 1)

Tabel 1. NCBI samengestelde gerichte rRNA-sequenties nu beschikbaar als BLAST-databases.

Figuur 1. Het databaseselectiemenu op de nucleotide-nucleotide BLAST-pagina met het keuzerondje rRNA/ITS-database geselecteerd.

Het gebruik van deze databases voor identificatie zal uw zoekopdrachten versnellen en u de meest informatieve resultaten opleveren. Als u uw zoekopdracht wilt uitbreiden met niet-gecureerde 16S rRNA-sequenties, wijzigt u de in de Nucleotidenverzameling (nr/nt) databank. U kunt ook de Organisme filter naar uw taxonomische groep van belang.

U kunt deze nieuwe databases ook downloaden van de BLAST db FTP-directory voor gebruik in lokale BLAST-zoekopdrachten.


Volgende generatie 16S rRNA-sequencing

Veel plaatsen van het menselijk lichaam worden gekoloniseerd door complexe gemeenschappen van microben (het 'menselijke microbioom') in zowel gezondheidstoestanden als verschillende ziektetoestanden. Zeer diverse, polymicrobiële specimens zijn vaak moeilijk of zelfs onmogelijk om volledig te karakteriseren met technieken die algemeen klinisch worden gebruikt:


Figuur 1. Voorbeelden van conventionele 16S rRNA-gensequencing resultaten van een bacterieel isolaat en een polymicrobieel monster. Voor het bacteriële isolaat (bovenaan) produceren Sanger-sequentiegegevens een schoon elektroferogram dat kan worden gebruikt om een ​​taxonomische classificatie op soortniveau te verschaffen. Voor het polymicrobiële monster (onder), genereert Sanger-sequencing een ander elektroferogram voor elke aanwezige soort, wat resulteert in een gemengd signaal dat niet te interpreteren is.
  • Op cultuur gebaseerde identificatie is afhankelijk van het vermogen van organismen om in vitro te groeien en te repliceren. Daarom is de detectie van kieskeurige of langzaam groeiende organismen, of organismen die niet levensvatbaar zijn geworden door verwerking (zoals in in formaline gefixeerde paraffine ingebedde weefselspecimens) of tijdens opslag (zoals anaëroben die zijn blootgesteld aan zuurstof) beperkt. Bovendien kan met deze benadering slechts een beperkt aantal soorten praktisch worden geclassificeerd.

Figuur 2. Krachtige vergroting van een sequencing-run van de volgende generatie. Elke fluorescerende vlek vertegenwoordigt een individueel DNA-molecuul dat sequentiebepaling ondergaat. De kleur van de vlek geeft de identiteit aan van het nucleotide dat wordt ondervraagd tijdens de huidige sequentiecyclus. Afbeelding van Shendure, Porreca et al. Wetenschap (2005).

In tegenstelling tot conventionele benaderingen biedt de volgende generatie DNA-sequencing (ook wel "NGS", "high-throughput sequencing", "massively parallel sequencing" of "deep sequencing") onafhankelijke sequentiegegevens van miljoenen individuele DNA-moleculen (Figuur 2), waardoor elk fragment afzonderlijk kan worden geclassificeerd.

Dit unieke vermogen breidt de voordelen van de huidige moleculaire methoden uit doordat we de aanwezige organismen in zelfs zeer complexe polymicrobiële bacteriële gemeenschappen kunnen catalogiseren, rechtstreeks van patiëntspecimens.

Informatie over beschikbare assays

Ons lab biedt momenteel high-fidelity Illumina next-generation DNA-sequencing van klinische monsters die meerdere bacteriële DNA-templates bevatten. Methoden worden gevalideerd ten behoeve van klinische moleculaire diagnose en patiëntenzorg. Onderzoeksdiensten zijn ook beschikbaar - neem contact met ons op voor meer informatie.

Deze test is beschikbaar als reflextest voor monsters waarvan wordt verwacht dat ze polymicrobieel zijn op basis van bacteriële PCR met een breed bereik.

Neem contact op met [email protected] voor details of vragen.


Klinische rapportage

Na voltooiing van het testen wordt een rapport uitgegeven waarin de resultaten van 16S next generation sequencing worden beschreven. Klik hier of op de miniatuur aan de linkerkant om een ​​voorbeeldrapport te bekijken.

Neem voor meer informatie over het indienen van een aanvraag en het ontvangen van een melding contact met ons op!


Wat is het referentie 16S-rRNA? - Biologie

Deze training begint met de presentatie van een 16S-pijplijn (http://lotus2.earlham.ac.uk/) in een Galaxy-omgeving.

Dit maakt de voorbewerking van de gegevens mogelijk, gaande van onbewerkte uitlezingen tot taxonomische tabellen en fylogenetische bomen.

Het 2e deel van de training geeft een overzicht van de numerieke ecologie en neemt volledig deel aan R.

Verwerking en statistische analyse van 16S rRNA metagenomische experimenten met behulp van R & Lotus-pijplijn.
De volgende analytische stappen van ruwe data tot overdraagbare resultaten staan ​​op het programma:

  • Planning, uitvoering en analyse van metagenomische experimenten
  • Analyseren van amplicon-sequencinggegevens met up-to-date tools en hoe de kwaliteit van ASV's en OTU's te verhogen, wanneer welke techniek te gebruiken
  • Post-clustering van ASV's om intra-genomische ASV vals-positieven te voorkomen
  • Werken met experimenten met lage biomassa, exogene verontreiniging verwijderen in verschillende scenario's
  • Op numerieke ecologie gerichte analyseworkflow voor zowel op metagenomische als op ampliconsequencing gebaseerde onderzoeken
  • Analyse van alfa/bèta-diversiteit
  • Univariate statistieken om soorten te identificeren die zijn verrijkt in steekproefgroepen
  • Multivariate statistieken en visualisatie om clusters van monsters te identificeren
  • Beoordeling van microbiële gemeenschappen op basis van ecologische principes en soortenverdelingen

De training is bedoeld voor mensen die enige ervaring hebben met R. Als je geen ervaring hebt met R, kun je eerst onze R introductie training volgen.

Sneakers

Falk Hildebrand

Falk Hildebrand is een bio-informaticus met een passie voor microbiële ecosystemen, bacteriële evolutie en het ontwikkelen van computersystemen om deze onderwerpen in een gecombineerd perspectief aan te pakken. Falk trad begin 2019 toe tot het Earlham Institute, waar zijn nieuwe Hildebrand Group (ook bij Quadram Institute) metagenomische hulpmiddelen gaat ontwikkelen voor het volgen van bacteriestammen met hoge resoluties, om hun genomische capaciteiten te voorspellen en hun associaties met ziekten te onderzoeken.

Tijdens zijn vroege carrière werkte Falk aan de Universiteit van Constance (Duitsland) en de Universiteit van Sussex (VK) aan bacteriële evolutie en het volgen van uitbraken van pathogenen door veranderingen in hun genomen te volgen. Hij ging van een genoomcentrische kijk naar een metagenomische kijk op hele microbiële ecosystemen en werkte tijdens zijn doctoraat aan de Universiteit van Brussel (België) aan bacteriële associaties met complexe ziekten zoals IBD, obesitas en diabetes. Hiervoor ontwikkelde Falk bio-informatica-pijplijnen om zowel 16S-gegevens (LotuS) als de statistische tools te verwerken.

Tijdens zijn postdoc aan EMBL Heidelberg (Duitsland) zette Falk zijn onderzoek voort naar de associatie met het menselijk microbioom van complexe ziekten zoals diabetes en de ziekte van Parkinson. Zijn interesses ontwikkelden zich al snel om stammen in de metagenomische datasets te volgen, evenals de novo assemblage van genomen uit metagenomen. Deze technieken worden meestal toegepast op het darmmicrobioom van zoogdieren. Een andere interesse van hem is milieumetagenomica. Zo bewees hij in 2018 dat in bodems doorgaans meer schimmels samenhangen met meer antibioticaresistentie bij bacteriën, en dat geldt zowel op lokale als mondiale schaal.

Ezgi Özkurt

Ezgi werd geboren in Istanbul, Turkije. Ze studeerde Moleculaire Biologie en Genetica aan de Middle East Technical University, Ankara en behaalde haar B.Sc. in 2014. Ze vervolgde haar opleiding aan de faculteit Biologie van dezelfde universiteit waar ze haar M.Sc. diploma 2015.

Ezgi volgde haar interesse voor evolutionaire biologie en vervolgde haar studie aan het Max Planck Instituut voor Evolutionaire Biologie in Duitsland, waar ze binnen de Environmental Genomics-groep werkte als PhD-student. Ze behaalde haar doctoraat in 2020.

Ezgi werkt momenteel als PostDoc in de Hildebrand-groep. Haar voornaamste interesses zijn metagenomics data-analyse en verticale transmissie van microbiële gemeenschappen.

Joachim Fritscher

Joachim Fritscher studeerde Bioinformatica in zijn BSc en MSc. Hij kwam aan het einde van zijn MSc in metagenomics en schreef zijn proefschrift over een op k-mer gebaseerde taxonomische classificatie voor metagenomische reads met behulp van een eiwitreferentie.

Nu probeert Joachim de op k-mer gebaseerde benadering en andere methoden te gebruiken om de resolutie van taxonomische classificatie en SNP-aanroepen tot stamniveau te verbeteren. Hij streeft er ook naar om nieuwe methoden op biologische data te leren en toe te passen en ze performant te maken met C++.

Stefano Romano

Stefano Romano studeerde aan de “Sapienza” Universiteit van Rome en promoveerde aan het Max Planck Instituut voor Mariene Microbiologie in Bremen, Duitsland. Voordat hij overstapte naar het Quadram Institute Bioscience, werkte hij aan de University College Cork in Ierland en aan de Universiteit van Wenen, Oostenrijk.

Stefano's carrièrepad volgt de visie van de Chinese filosoof Lao Tzu, die zei: "Het leven is een reeks natuurlijke en spontane veranderingen". Hij is betrokken geweest bij verschillende projecten die onderzoek doen naar mariene en zoetwatermicro-organismen, vrijlevende en symbiotische bacteriën, elementaire microbiologische aspecten en biotechnologische toepassingen. Al deze onderwerpen vielen onder zijn belangrijkste interesse om de mechanismen te begrijpen die bacteriën gebruiken om te interageren met hun gastheer en zijn microbiota in een veranderende omgeving.

Bij het Quadram Institute bestudeert Stefano Romano de rol van de mens-microbiota bij veroudering, met bijzondere aandacht voor de microbiota-hersen-darm-as om de interactiemechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de interactie tussen gastheer en microbiota en om deze bevindingen te vertalen in verbeterde therapeutische interventies. Hij is ook de manager van de Fecal Microbiota Transplant-faciliteit in samenwerking tussen het Quadram Institute Bioscience en Norfolk and Norwich University Hospital.

Angela Del Castillo Izquierdo

Ángela Del Castillo Izquierdo is een MSc by Research postdoctorale student binnen de Hildebrand-groep als onderdeel van de Gut Microbes and Health ISP. Ze onderzoekt de microbiële samenstelling vanuit een multikoninkrijk perspectief voor verschillende ziekten. Haar onderzoeksinteresses omvatten microbiële ecologie en evolutie, populatiegenetica en bacteriële pathogenese.

Voordat ze bij QIB kwam, ontving ze mijn BSc (Hons) Biologie van de Universiteit van York in 2019, waar ze een project deed om de DNA-segregatiefactoren die betrokken zijn bij plasmide-segregatie te onderzoeken en een proefschrift uitvoerde waarin ze het mechanisme bestudeert dat verantwoordelijk is voor de segregatie van een lage kopie nummer plasmide in Sulfolobus solfataricus archeon bij Barilla groep

Rebecca Ansorge

Rebecca Ansorge studeerde aan de Universiteit van Bremen, Duitsland, waar ze een BSc in Biologie en een MSc in Microbiologie behaalde aan de International Max Planck Research School of Marine Microbiology. Ze promoveerde in 2019 aan het Max Planck Instituut voor Mariene Microbiologie, waarbij ze dier-microbe symbiose bestudeerde, meestal met behulp van metagenomica. Ze is gefascineerd door de diversiteit van stammen en de implicaties daarvan in gastheer-microbesystemen en interacties.

Rebecca is momenteel een PostDoc in de Hildebrand-groep bij Quadram Institute Bioscience, waar ze haar onderzoek naar microbiële variatie op stamniveau en microbiële pangenoomdiversiteit in het menselijke darmmicrobioom verdiept. Ze is vooral geïnteresseerd in het belichten van de relevantie van deze kleinschalige diversiteit in gezondheid en ziekte

Nicola Soranzo

Nicola Soranzo werkt sinds 2014 bij het Earlham Institute (EI) als onderdeel van de groep Data Infrastructure and Algorithms. Hij beheert een Galaxy-webserver die wordt gebruikt om grootschalige bioinformatica-analyses op een toegankelijke, reproduceerbare en transparante manier uit te voeren. Nicola werkt al vele jaren mee aan de open source ontwikkeling van het Galaxy platform en van Galaxy tools en workflows.
Hij is co-auteur van meer dan 25 peer-reviewed tijdschriftartikelen en geeft regelmatig trainingen voor de Carpentries en het Galaxy Training Network.
Sinds 2018 is Nicola ook technisch coördinator voor ELIXIR-UK, de UK Node van ELIXIR (een pan-Europese organisatie die life science-bronnen coördineert in één onderzoeksinfrastructuur). Daarnaast is Nicola een van de leiders van de Galaxy Community in ELIXIR.
Voordat hij bij EI kwam, voltooide Nicola een master in computerwetenschappen aan de universiteit van Udine en een doctoraat in functionele en structurele genomica aan SISSA, Triëst, en werkte vervolgens 5 jaar aan systeembiologie en Galaxy bij CRS4, Italië.


Pato, M.L., en Meyenburg, K.V., Cold Spring Harbor Symp. aantal. Biol., 35, 497 (1970).

Rose, T.K., Mosteller, R.D., en Yanofsky, C., J. Moi. Biol., 51, 541 (1970).

Colli, W., Smith, I., en Oishi, M., J. Mol. Biol., 56, 117 (1971).

Rosset, R., Monier, R., en Julien, J., Stier. Soc. Chim. Biol., 46, 87 (1964).

Zimmerman, R.A., en Levinthal, L., J. Mol. Biol., 30, 349 (1967).

Bremer, H., en Yuan, D., J. Mol. Biol., 38, 163 (1968).

Mueller, K., en Bremer, H., J. Mol. Biol., 38, 329 (1968).

Anderson, Z.H., Proc. Amerikaanse Nat. Acad. Wetenschap., 32, 120 (1946).

Bremer, H., en Yuan, D., Biochim. Biofysica. Acta, 169, 21 (1968).


Auteurs informatie

Voorkeuren

Carl R. Woese Instituut voor Genomische Biologie, Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign, Champaign, IL, VS

Nam-Phuong Nguyen, Tandy Warnow & Bryan White

Afdeling Bioengineering, Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign, Champaign, IL, VS

Afdeling Computerwetenschappen, Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign, Champaign, IL, VS

Centrum voor Bio-informatica en Computational Biology, University of Maryland, College Park, College Park, MD, VS


Veel van de microbiële taxonomie en metagenomische analyses zijn tegenwoordig gebaseerd op studies van het bacteriële 16S ribosomale RNA-gen (16S). 16S-rRNA is een onderdeel van de kleine 30S-subeenheid van het prokaryotische ribosoom, dat een essentieel gen is in alle bacteriën en archaea. Het overeenkomstige gen is ongeveer 1500 basen lang en heeft zowel sterk geconserveerde als variabele regio's, waardoor het een ideale taxonomische marker is. Gewoonlijk worden primers die zijn ontworpen om overeen te komen met geconserveerde gebieden in het 16S-gen, gebruikt om de volledige DNA-sequentie te bepalen via PCR-amplificatie. De sequentie van variabele regio's tussen de primers biedt voldoende taxonomische informatie om elk geamplificeerd DNA-fragment te matchen met een database van bekende 16S-sequenties en verschaft een vermoedelijke identificatie voor het organisme dat dat DNA-fragment in zijn genoom bevatte. De meeste, zo niet alle, bacteriën kunnen worden onderscheiden door sequentiebepaling van amplicons die zijn afgeleid van een van de volgende variabele regio's: V1-V3, V3-V4 of V3-V5.

Voor de studie van metagenomica heeft 16S-sequencing een grote kracht, omdat deze methode automatisch alleen bacterieel DNA selecteert voor amplificatie en sequencing en het een uiterst efficiënte taxonomisch informatieve kleine markersequentie biedt om de overvloed van elk taxon te meten. Er zijn verschillende tools ontwikkeld voor het bepalen van de classificatie van 16S-metagenoomsequenties, zoals SINA ingebouwd in SILVA, Classifier in RDP en QIIME. De latere QIIME verpakt veel pakketten die kunnen worden gebruikt om meerdere processen af ​​te handelen en is daarom de dominante tool geworden.

16S rRNA Sequencing Services bij Creative Biogene

Creative Biogene biedt een snelle en effectieve sequencingservice voor het 16S-rRNA-gen uit uw bacterie- of schimmelkolonies. Om de microbiële gemeenschap in uw monster te identificeren, bieden we een one-stop-service voor het uitvoeren van DNA-extractie, PCR, sequencing en assemblage om uw tijd op de bank te besparen.

Creative Biogene biedt ook diensten voor geavanceerde bio-informatische analyse, waaronder i) 16S rRNA-metagenoomanalyse ii) Taxonomische toewijzing en schatting van de hoeveelheid voor alle OTU's tot op soortniveau iii) Overvloedschatting van bacteriële en archaeale OTU's rekening houdend met afstammingsspecifieke kopie-aantallen van markergenen . Als extra service zal Creative Biogene ook het hoogmoleculaire DNA isoleren en zuiveren uit verschillende uitgangsmaterialen.

Toepassingen:
• 16S rRNA-gensequencing
• 16S rRNA-metagenoomanalyse
• DNA-isolatie en -zuivering
• Identificatie van bacteriesoorten

Voordelen:
• Hoge kwaliteit
• Snelle en betrouwbare doorlooptijd
• Gemakkelijk toegankelijke, toegewijde klantenservice

Verwijzing
1. Hao, Y., Pei, Z., Brown, S.M. (2017) Bio-informatica in microbioomanalyse. Methoden in de microbiologie. 44: 1-18.

Figuur 1 Schematische weergave van 16S rRNA van Escherichia coli.
(Methoden in de microbiologie 2017)


Principes en workflow van 16S/18S/ITS Amplicon Sequencing

Dit artikel laat zien wat 16S/18S/ITS amplicon-sequencing is en hoe het werkt. Laten we ons klaarmaken om te leren.

16S/18S/ITS-amplificatiesequencing maakt gebruik van het volgende/derde generatie sequencingplatform en voert high-throughput-sequencing uit van PCR-producten uit specifieke regio's, zoals 16S rDNA/18S rDNA/ITS/ functionele genen. Het overwint het nadeel van sommige micro-organismen die moeilijk of onmogelijk te kweken zijn, en verkrijgt de informatie over de microbiële gemeenschapsstructuur, evolutionaire relaties en microbiële correlatie met de omgeving in milieumonsters.

Wat is 16S rDNA /18S rDNA/ITS?

  • 16s-rDNA: 16S-rDNA is een DNA-sequentie die codeert voor kleine subeenheid-rRNA van prokaryoten met een lengte van ongeveer 1542 bp. Met een matige molecuulgrootte en een lage mutatiesnelheid is 16S-rDNA de meest gebruikte marker in de studie van bacteriële systematiek. De 16S rDNA-sequentie bestaat uit 9 variabele regio's en 10 conservatieve regio's, de geconserveerde regiosequenties weerspiegelen de genetische relaties tussen soorten, terwijl de variabele regiosequenties het verschil tussen soorten weerspiegelen. 16S rDNA-sequencing wordt voornamelijk gebruikt om de diversiteit van bacteriën of archaea te analyseren.


Fig.1 16S rDNA en amplificatieprimers

  • 18S-rDNA: 18S rDNA is een DNA-sequentie die codeert voor rRNA van kleine subeenheden van eukaryote ribosomen. Net als 16S-rDNA bestaat de 18S-rDNA-sequentie ook uit conservatieve regio's en variabele regio's (V1-V9, afwezigheid van V6). Van de variabele regio's heeft V4 de meest complete database-informatie en het beste classificatie-effect, het is de meest gebruikte en de beste keuze voor 18S rRNA-genanalysenotities. 18S rDNA-sequencing weerspiegelt de soortverschillen tussen eukaryote organismen in bepaalde monsters.


Fig.2 18S rDNA en amplificatieprimers

  • ZIJN: ITS (Internal Transcribed Spacer) maakt deel uit van het niet-transcriptionele gebied van het schimmel-rRNA-gen. De ITS-sequenties die worden gebruikt voor de identificatie van schimmels, omvatten meestal ITS1 en ITS2. Omdat in schimmels 5.8S-, 18S- en 28S-rRNA-genen sterk geconserveerd zijn, terwijl ITS meer mutaties in het evolutionaire proces kan verdragen vanwege minder natuurlijke selectiedruk, en een extreem breed sequentiepolymorfisme vertoont bij de meeste eukaryoten. Tegelijkertijd is het conservatieve type ITS relatief consistent binnen soorten en zijn de verschillen tussen soorten (of ooit vlekken) duidelijk. ITS-sequentiefragmenten zijn klein (respectievelijk 350 bp en 400 bp lang) en gemakkelijk te analyseren. Ze zijn op grote schaal gebruikt in de fylogenetische analyse van verschillende schimmels.


Fig.3 ITS en amplificatieprimers

Wat is 16S/18S/ITS-ampliconsequencing?

16S/18S/ITS amplicon-sequencing maakt gebruik van Illumina- of PacBio-sequencing om de PCR-producten te lezen die zijn geamplificeerd met geschikte universele primers van een of meerdere regio's van 16S/18S/ITS. Door de sequentievariatie en abundantie van het doelgebied te detecteren, kon de informatie over soortclassificatie en abundantie, populatiestructuur, fylogenetische evolutie en gemeenschapsvergelijking van milieumonsters worden verkregen.

Hoe voer je een 16S/18S/ITS amplicon-sequencing uit?
Kortom, de belangrijkste stappen van 16S/18S/ITS amplicon-sequencing omvatten bibliotheekconstructie, sequencing en bio-informatica-analyse.

    : We raden de constructiemethode van de fusieprimerbibliotheek aan, dat wil zeggen dat de primers die zijn gefuseerd met de doelsequentieprimers en de adapter, index en andere sequenties vooraf worden gesynthetiseerd, waarna de genomische DNA-doelen direct worden geamplificeerd door PCR. Ampliconbibliotheken worden gezuiverd en een equimolaire verzameling van de ampliconbibliotheken wordt bereid. De verdunning die nodig is voor de voorbereiding van de sjabloon wordt bepaald en gevolgd door sequentiebepaling.
  • Volgorde aanbrengen in: De huidige sequencingplatforms omvatten voornamelijk Illumina Miseq/HiSeq en het sequencingplatform van de derde generatie.
    • Illumina NGS (MiSeq/HiSeq2500/HiSeq4000): vanwege de beperking van de leeslengte kan het NGS-platform alleen een enkele variabele regio, dubbele variabele regio of drievoudige variabele regio selecteren als de doelregio's voor de sequencing. Bij sequencing kunnen alleen de volledig gesequenced Reads (Tags) worden gebruikt voor verdere analyse, dus verschillende amplificatieregio's moeten de bijbehorende sequencingstrategie strikt volgen. Als u bijvoorbeeld V4 kiest voor analyse, is de PE250-sequencing nodig, maar voor V1-V3-regio's moet de sequencing-strategie PE300 zijn. Alleen op deze manier kan de volledigheid van sequenties worden gegarandeerd. De originele gegevens worden eruit gefilterd om uitlezingen van lage kwaliteit te verwijderen en schone gegevens van hoge kwaliteit achter te laten voor latere analyse.
    • PacBio SMRT-sequencing: In tegenstelling tot NGS kan het derde generatie sequencingplatform volledige sequencing uitvoeren voor 16S/18S/ITS, en de sequentie-uitlijningssnelheid en identificatienauwkeurigheid zijn hoger dan die van de NGS.

    Operationele taxonomische eenheden (OTU's) worden vaak gebruikt om groepen nauw verwante individuen te classificeren. Als de overeenkomst tussen verschillende 16S rDNA/18S rDNA/ITS-sequenties hoger is dan 97%, kunnen die sequenties in het algemeen worden gedefinieerd als een OTU. Elke OTU komt overeen met een andere 16S rDNA/18S rDNA/ITS-sequentie, dat wil zeggen dat elke OTU overeenkomt met één soort. Door OTU-analyse kan de microbiële diversiteit en de overvloed aan verschillende micro-organismen in het monster bekend worden.

    Vervolgens worden op basis van OTU- en soortenannotatieresultaten, analyse van de complexiteit van monstersoorten en analyse van soortenverschillen uitgevoerd. Op soorten gebaseerde analyse, LDA-effectgrootteanalyse en meer analyses worden ook verstrekt.


    Fig.4 De workflow van 16S/18S/ITS amplicon-sequencing

    Bij CD Genomics kan ons deskundige team met uitgebreide ervaring u helpen microbiële gemeenschappen volledig te begrijpen en ervan te profiteren. Naast 16S/18S/ITS Amplicon Sequencing bieden we ook andere microbiële genomics-diensten, waaronder:

    1. Michelsen, C. F., Pedas, P., Glaring, M. A., Schjoerring, J. K., & Stougaard, P. (2014) ‘Bacterial diversity in greenlandic soils as affected by potato cropping and inorganic versus organic fertilization’, Polar Biology, 37(1), 61-71.
    2. Edwards, J., Johnson, C., Santosmedellín, C., Lurie, E., Podishetty, N. K., & Bhatnagar, S., et al. (2015) ‘Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice’, Proceedings van de National Academy of Sciences van de Verenigde Staten van Amerika, 112(8), E911.
    3. Evans, C. C., Lepard, K. J., Kwak, J. W., Stancukas, M. C., Laskowski, S., & Dougherty, J., et al. (2014) ‘Exercise prevents weight gain and alters the gut microbiota in a mouse model of high fat diet-induced obesity’, Plos One, 9(3), e92193.
    4. Shehab, N., Li, D., Amy, G. L., Logan, B. E., & Saikaly, P. E. (2013) ‘Characterization of bacterial and archaeal communities in air-cathode microbial fuel cells, open circuit and sealed-off reactors’, Appl Microbiol Biotechnol, 97(22), 9885-9895.
    5. Man, K. C., Au, C. H., Chu, K. H., Kwan, H. S., & Chong, K. W. (2010) ‘Composition and genetic diversity of picoeukaryotes in subtropical coastal waters as revealed by 454 pyrosequencing’, Isme Journal, 4(8), 1053.
    6. Lie, A. A. Y., Liu, Z., Hu, S. K., Jones, A. C., Kim, D. Y., & Countway, P. D., et al. (2014) ‘Investigating microbial eukaryotic diversity from a global census: insights from a comparison of pyrotag and full-length sequences of 18s rrna genes’, Appl Environ Microbiol, 80(14), 4363-4373.
    7. Lu, L., Yin, S., Liu, X., Zhang, W., Gu, T., & Shen, Q., et al. (2013) ‘Fungal networks in yield-invigorating and -debilitating soils induced by prolonged potato monoculture’, Bodembiologie en biochemie, 65, 186-194.
    8. Orgiazzi, A., Lumini, E., Nilsson, R. H., Girlanda, M., Vizzini, A., & Bonfante, P., et al. (2012) ‘Unravelling soil fungal communities from different mediterranean land-use backgrounds’, Plos One, 7(4), e34847.
    9. Lakshmanan, V., Ray, P., & Craven, K. D. (2017) ‘Rhizosphere sampling protocols for microbiome (16s/18s/its rrna) library preparation and enrichment for the isolation of drought tolerance-promoting microbes’, Methods Mol Biol, 1631, 349-362.

    Get cutting-edge science information from CD Genomics sent straight to your inbox every month.


    Bekijk de video: 16S rRNA Sequencing In Urdu Hindi. 16S rRNA Bacteria Identification (September 2022).


Opmerkingen:

  1. Set

    Het is waar! The idea of ??a good, I agree with you.

  2. Hardy

    Bedankt voor het verhelderen van, en vooral, net op tijd. Denk maar vijf jaar al op internet, maar dit is de eerste keer dat ik erover heb gehoord.

  3. Krejci

    Natuurlijk. Al het bovenstaande is waar.

  4. Grole

    Ik bedoel, je hebt het mis. Ik kan mijn positie verdedigen. Schrijf me in PB.

  5. Thai

    Het is de juiste informatie



Schrijf een bericht