Informatie

Zou een verrijking van pyrimidine-runs van twee of meer nucleotiden een vroege indicator zijn van DNA dat beschadigd is?

Zou een verrijking van pyrimidine-runs van twee of meer nucleotiden een vroege indicator zijn van DNA dat beschadigd is?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ik analyseer twee categorieën eiwitcoderende genen en vergelijk hun relatieve kenmerken. Wat ik waarneem is dat een van deze, in vergelijking met de andere, is verrijkt met pyrimidine-runs (twee of meer opeenvolgende pyrimidines). Ik heb het aantal van deze runs geteld (ik noem ze geen dimeren omdat ik geen gegevens heb die een kruisverband tussen twee of meer pyrimidinebasen onderstrepen) per eiwitcoderend gen en vervolgens een Mann Whitney-test uitgevoerd die aangeeft dat een van deze twee groep genen is verrijkt ten opzichte van de andere. Ik veronderstel dat deze verrijking een vroege indicator zou kunnen zijn dat DNA lokale conformatieveranderingen ondergaat. Door uw ervaring, zou deze hypothese betrouwbaar kunnen zijn of ben ik totaal misleidend wat ik waarneem?


Zou een verrijking van pyrimidine-runs van twee of meer nucleotiden een vroege indicator zijn van DNA dat beschadigd is? - Biologie

een Institut de Chimie Mol's 233culaire de l'Universit'233 de Bourgogne, ICMUB CNRS UMR 6302, UBFC Dijon, Frankrijk
E-mailadres: [email protected]

b Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, IPBS, Université'233 de Toulouse, CNRS, UPS, Toulouse, Frankrijk

c Équipe Labellisée la Ligue Contre le Cancer 2018, Toulouse, Frankrijk
E-mailadres: [email protected]

Abstract

Het beschadigen van DNA is een huidige en efficiënte strategie om de proliferatie van kankercellen te bestrijden. Er bestaan ​​tal van mechanismen om DNA-schade tegen te gaan, gezamenlijk aangeduid als de DNA-schaderespons (DDR) en die vaak ontregeld zijn in kankercellen. Nauwkeurige kennis van deze mechanismen is noodzakelijk om chemotherapeutische DNA-targeting te optimaliseren. Nieuw onderzoek naar DDR heeft een reeks veelbelovende therapeutische doelen, eiwitten en nucleïnezuren blootgelegd, met name met toepassing via een benadering die combinatietherapie of combinatorische synthetische letaliteit wordt genoemd. In deze review vatten we de hoeksteenontdekkingen samen die ervoor hebben gezorgd dat het DNA werd beschouwd als een doelwit tegen kanker, en de manipulatie van DDR-routes als een waardevolle strategie tegen kanker. We beschrijven in detail de DDR-signalerings- en herstelroutes die worden geactiveerd als reactie op DNA-schade. Vervolgens vatten we het huidige begrip samen van niet-B-DNA-vouwen, zoals G-quadruplexen en DNA-knooppunten, wanneer ze worden gevormd en waarom ze een specifieker therapeutisch doelwit kunnen bieden in vergelijking met dat van canoniek B-DNA. Ten slotte voegen we deze onderwerpen samen om de nieuwe en veelbelovende chemotherapeutische strategie weer te geven die DNA-beschadigende en DDR-gerichte middelen met verhoogde specificiteit combineert. Dit overzicht laat dus zien hoe de chemische biologie aanleiding heeft gegeven tot aanzienlijke wetenschappelijke vooruitgang dankzij resoluut multidisciplinaire onderzoeksinspanningen die moleculaire en celbiologie, chemie en biofysica combineren. We streven ernaar om de niet-gespecialiseerde lezer een toegangspoort tot dit opwindende veld te bieden en de gespecialiseerde lezer een nieuw perspectief te bieden op de laatste behaalde resultaten en bedachte strategieën.


Essay over erfelijkheid en kanker | Soorten | Ziekten | Biologie

In dit essay zullen we discussiëren over de rol van erfelijkheid bij het vergroten van kanker en de belangrijkste focus van dit essay was op kankertendensen die in families voorkomen.

1. Essay over erfelijk risico:

Genen die betrokken zijn bij het tegenhouden van celproliferatie:

Als er wordt gezegd dat bepaalde vormen van kanker erfelijk zijn, betekent dat niet dat mensen kanker van hun ouders erven. Wat echter kan worden geërfd, is een verhoogde vatbaarheid voor het ontwikkelen van kanker. Kankers die ontstaan ​​door een dergelijke erfelijke aanleg worden familiale of erfelijke kankers genoemd, terwijl de meer voorkomende kankers die geen duidelijk erfelijk patroon vertonen, sporadische of niet-erfelijke kankers worden genoemd. Erfelijke mutaties in verschillende categorieën genen kunnen een persoon vatbaar maken voor het ontwikkelen van kanker.

Omdat kankerverwekkende mutaties grotendeels willekeurig zijn, speelt geluk ook een rol. Als twee mensen identiek zijn blootgesteld aan dezelfde kankerverwekkende stoffen, kan de ene persoon kanker krijgen, terwijl de andere niet simpelweg omdat toevallige mutaties kritieke genen in het ongelukkige individu hebben beschadigd.

Maar er is meer aan het verhaal dan dit. Onder exact dezelfde omstandigheden heeft niet iedereen exact dezelfde kans om kanker te krijgen, omdat erfelijkheid sommige mensen vatbaarder maakt dan anderen. Tachtig tot negentig procent van het totale kankerrisico van een populatie wordt veroorzaakt door omgevings- en leefstijlfactoren, waarbij 10% tot 20% erfelijk is.

Hoewel de impact van erfelijkheid dus klein is voor populaties als geheel, betekent dit niet dat erfelijkheid een ondergeschikte factor is voor elke persoon. Sommige individuen en kinderen erven genmutaties die hun risico op kanker enorm verhogen.

Sommige erfelijke mutaties verhogen het risico zelfs tot bijna 100%, waardoor het vrijwel zeker is dat iemand binnen zijn of haar leven kanker zal krijgen. Andere erfelijke mutaties geven een kleinere, maar nog steeds significante toename van het kankerrisico. De studie van dergelijke mutaties bleek niet alleen ons begrip van erfelijke kankers te verlichten, maar ook van niet-erfelijke vormen van kanker.

Erfelijke mutaties en kankerrisico:

Om onze bespreking van erfelijke mutaties en het risico op kanker te beginnen, is het nuttig om enkele van de basisprincipes te bespreken die erfelijkheidspatronen beheersen. Andere menselijke cellen dan sperma en eicellen hebben twee exemplaren van elk chromosoom en worden daarom diploïde genoemd (van het Griekse woord diplous, wat '8220dubbel' betekent).

Een normale diploïde cel bevat twee sets van 23 chromosomen, wat in totaal 46 chromosomen oplevert. De twee leden van elk chromosoompaar worden homologe chromosomen genoemd, het ene lid van elk paar is geërfd van de vader van een persoon en het andere van de moeder.

Aangezien elk type chromosoom in twee exemplaren aanwezig is, zal elk gen dat in een paar homologe chromosomen wordt vertegenwoordigd, in twee exemplaren aanwezig zijn. De twee versies van elk gen, allelen genaamd, kunnen identiek of lichtjes verschillend zijn. Als de twee allelen voor een bepaald gen identiek zijn, wordt gezegd dat een persoon homozygoot is voor dat gen. Als de twee allelen verschillend zijn, wordt gezegd dat de persoon heterozygoot is.

Wanneer een cel heterozygoot is voor een bepaald gen, is een van de twee allelen vaak dominant en de andere recessief. Deze termen brengen het idee over dat het dominante allel bepaalt hoe de eigenschap zal verschijnen bij een heterozygoot individu.

Met andere woorden, een persoon met één dominant en één recessief allel voor een bepaalde eigenschap zal het dominante allel uitdrukken. Hoewel zulke heterozygote individuen de recessieve eigenschap niet tot uitdrukking brengen, kunnen ze dat recessieve allel wel doorgeven aan hun kinderen. Om een ​​recessieve eigenschap daadwerkelijk uit te drukken, moet een persoon echter homozygoot zijn voor het recessieve allel (Figuur 1).

Niet alle individuen die dominante of recessieve mutaties erven, drukken de eigenschap uit die zou worden verwacht. De frequentie waarmee een bepaald dominant of homozygoot recessief allel de verwachte eigenschap binnen een populatie oplevert, staat bekend als penetrantie. We zullen bijvoorbeeld binnenkort zien dat bepaalde genmutaties worden overgeërfd als dominante eigenschappen die het risico van een persoon om kanker te ontwikkelen drastisch verhogen.

In sommige gevallen ontwikkelt elke persoon die een gemuteerde kopie erft uiteindelijk kanker en daarom wordt gezegd dat de penetrantie 100% is. Meestal ontwikkelt minder dan 100% van de personen die een gemuteerde kopie erven, daadwerkelijk kanker. In dergelijke gevallen zou de mutante vorm van het gen onvolledige penetrantie vertonen.

Personen die de mutatie erven maar zelf geen kanker krijgen, kunnen de mutatie toch doorgeven aan hun kinderen. Onvolledige penetrantie ontstaat wanneer omgevingsfactoren of andere componenten van iemands genetische samenstelling van invloed zijn op het al dan niet tot uiting komen van een bepaalde eigenschap.

Retinoblastoom:

Ons huidige begrip van de relatie tussen overgeërfde mutaties in genen die celprolifera­tion en de ontwikkeling van kanker beperken, is grotendeels te danken aan de studie van retinoblastoom, een zeldzame kanker van jonge kinderen die ontstaat in de lichtabsorberende retinale cellen aan de achterkant van het oog . Vóór het midden van de negentiende eeuw was retinoblastoom bijna altijd dodelijk, omdat tumoren meestal pas werden gediagnosticeerd als ze via de achterkant van de oogbol en in de hersenen waren binnengedrongen.

De uitvinding van de oftalmoscoop in 1850 veranderde de situatie dramatisch. Artsen hadden eindelijk een hulpmiddel waarmee ze in het oog konden kijken en tumoren konden detecteren voordat ze de omliggende weefsels binnendrongen, waardoor de tumoren in een vroeg stadium konden worden verwijderd.

Paradoxaal genoeg had deze indrukwekkende medische vooruitgang een onverwacht gevolg: er ontstond een nieuwe vorm van retinoblastoom die nog niet eerder was gezien. Voordat de oftalmoscoop werd uitgevonden, overleefden maar weinig kinderen met retinoblastoom de volwassenheid. Nu is bijna 90% genezen en gaan ze een normaal leven leiden.

Wanneer deze overlevenden van retinoblastoom opgroeien en hun eigen gezin hebben, lopen hun kinderen mogelijk ook een hoog risico op retinoblastoom. Normaal gesproken heeft een kind minder dan 1 op 20.000 kans om retinoblastoom te ontwikkelen, maar in de families van sommige overlevenden van retinoblastoom ontwikkelt ongeveer 50% van de kinderen de ziekte (Figuur 2).

Deze specifieke vorm van retinoblastoom, die in familieclusters voorkomt, wordt familiaal retinoblastoom genoemd om het te onderscheiden van de sporadische retinoblastomen die worden gezien bij kinderen zonder familiegeschiedenis van de ziekte. Ongeveer 40% van de gevallen van retinoblastoom is familiair en de rest is sporadisch. Kinderen met de familiale vorm van de ziekte ontwikkelen vaak meerdere tumoren in beide ogen, terwijl sporadisch retinoblastoom bijna altijd een enkele tumor is.

Two-Hit-model om de ontwikkeling van retinoblastoom te bestuderen:

Het overervingspatroon dat wordt gezien bij familiaal retinoblastoom is consistent met de overdracht van een enkel mutant gen van ouder naar nageslacht. Maar hoe zit het met de sporadische vorm van de ziekte? Is hetzelfde gen betrokken, of ontstaan ​​de twee vormen van oogkanker door verschillende mechanismen? In 1971 stelde Alfred Knudson het two-hit-model voor om dit probleem aan te pakken. Volgens zijn theorie is de aanwezigheid van twee mutaties vereist om een ​​retinoblastoom te creëren.

In de sporadische vorm van de ziekte, waarbij geen mutaties worden geërfd, moeten de twee mutaties spontaan in dezelfde cel ontstaan. Omdat typische mutatiesnelheden in menselijke cellen ongeveer één op een miljoen per gen per celdeling zijn, is de kans dat de twee vereiste mutaties in dezelfde cel optreden uiterst klein.

Bij familiair retinoblastoom is één mutatie al geërfd van een ouder en is daarom aanwezig in alle lichaamscellen, inclusief die van het netvlies. Een individuele retinale cel hoeft daarom slechts één extra mutatie in stand te houden om de twee mutante genen te creëren die nodig zijn om kanker te produceren.

Aangezien er meer dan tien miljoen cellen in het netvlies zijn en aangezien de mutatiesnelheid ongeveer een op een miljoen per gen per celdeling is, is het waarschijnlijk dat een of meer netvliescellen spontaan de tweede mutatie zullen oplopen die nodig is om kanker te laten ontstaan. Dat zou verklaren waarom het aantal retinoblastomen zo hoog is in families met de erfelijke vorm van de ziekte en waarom kinderen in dergelijke families vaak meerdere tumoren ontwikkelen.

Het voorgaande model laat echter een belangrijke vraag onbeantwoord: hebben de twee mutaties betrekking op verschillende genen, of hebben we te maken met twee defecte allelen van hetzelfde gen, waarvan er één aanwezig is op elk lid van een chromo­some-paar? Microscopisch onderzoek van de chromosomen van retinoblastoomcellen leverde een vroege aanwijzing op.

Cellen van individuen met familiair retinoblastoom bleken soms een verwijderd segment te vertonen in een bepaald gebied van chromosoom 13. Bovendien werd de deletie niet alleen waargenomen in tumorcellen maar in alle cellen van het lichaam, wat erop wijst dat het erfelijke defect dat leidt tot retinoblastoom betrokken was een gen dat zich in het verwijderde gebied van chromo­some 13 bevindt.

Een soortgelijke deletie wordt soms ook waargenomen bij sporadische retinoblastomen (hoewel in dit geval alleen in tumorcellen en niet elders in het lichaam). Alles bij elkaar genomen suggereren dergelijke waarnemingen dat chromosoom 13 een gen bevat waarvan het verlies wordt geassocieerd met zowel de erfelijke als niet-erfelijke vormen van retinoblastoom.

Op zichzelf veroorzaakt het erven van een enkele deletie in dit gebied van chromosoom 13 geen kanker. Om kanker te ontwikkelen, moet er een mutatie ontstaan ​​waarbij hetzelfde gebied van de tweede kopie van chromosoom 13 is betrokken tijdens de vele ronden van celdeling die plaatsvinden wanneer het netvlies wordt gevormd. Deze tweede mutatie werd uiteindelijk gelokaliseerd in een klein gebied van chromosoom 13 dat een gen bevat dat de naam RB kreeg (voor '8220retinoblastoom'8221).

Dus de twee-hit-theorie van Knudson voor retinoblastoom kon eindelijk in meer precieze bewoordingen worden herwerkt (Figuur 3). De '8220twee hits' die nodig zijn voor de ontwikkeling van retinoblastoom betreffen de twee kopieën van het RB-gen die we elk erven, een van onze vader en een van onze moeder.

Elke '8220hit'8221 is een mutatie (of deletie) die de functie van één kopie van het RB-gen verstoort. Volgens dit model is de RB-mutatie recessief omdat beide allelen mutant (of verwijderd) moeten zijn om kanker te laten ontstaan. Het kankerrisicosyndromen waarbij kinderen een sterk verhoogd risico op het ontwikkelen van kanker erven, is echter een dominant kenmerk, omdat slechts één enkele RB-mutatie hoeft te worden geërfd om een ​​zeer hoog kankerrisico te creëren.

Als een kind zo'n defect RB-gen erft, is mutatie van de goede kopie van het RB-gen in een enkele retinale cel alles wat nodig is om kanker te ontwikkelen. Aangezien er miljoenen cellen in het netvlies zijn en aangezien de normale mutatiesnelheid ongeveer één op een miljoen per gen per celdeling is, is de kans dat een dergelijke inactiverende mutatie zich voordoet in ten minste één netvliescel vrij groot.

Ongeveer 90% van de kinderen die een gemuteerd RB-gen van één ouder erven, krijgen uiteindelijk deze tweede mutatie en ontwikkelen kanker. Met andere woorden, de penetrantie van retinoblastoom bij kinderen die een enkel defect RB-gen erven is 90%.

In families zonder voorgeschiedenis van retinoblastoom worden kinderen geboren met twee goede kopieën van het RB-gen. Als gevolg hiervan ontstaat retinoblastoom alleen in het zeer onwaarschijnlijke geval dat beide exemplaren van het RB-gen een mutatie ondergaan in dezelfde cel, wat leidt tot dezelfde genetische uitkomst als bij familiaal retinoblastoom.

Retinoblastoom is een van de weinige vormen van kanker waarbij inactivering van beide kopieën van een enkel gen zo cruciaal lijkt te zijn om rechtstreeks tot kanker te leiden. Het komt vaker voor dat kankers ontstaan ​​als een meerstapsproces waarbij opeenvolgende mutaties in verschillende genen betrokken zijn.

RB Gen als een onderdrukker van celproliferatie:

Wat voor soort gen is RB dat het zo centraal maakt in de ontwikkeling van kanker? De enige groepen kankerverwekkende genen die we tot nu toe hebben besproken, zijn oncogenen, een klasse van genen waarvan de aanwezigheid de ontwikkeling van kanker kan veroorzaken. Daarentegen is RB een gen waarvan de afwezigheid (of inactivatie) in plaats van aanwezigheid geassocieerd is met de ontwikkeling van kanker. Zo'n gen moet volgens totaal andere principes werken dan oncogenen, die coderen voor eiwitten die celproliferatie en overleving bevorderen.

Het blijkt dat de normale functie van het RB-gen niet is om celproliferatie en overleving te bevorderen, maar eerder om ze te beperken. Het wegwerken van een gen dat celproliferatie en overleving tegenhoudt, is analoog aan het loslaten van het rempedaal van een auto, met andere woorden, het zorgt ervoor dat cellen zich ongecontroleerd kunnen vermenigvuldigen.

De manier waarop het RB-gen zijn normale beperkende functie vervult, is door te coderen voor het Rb-eiwit, een molecuul dat een sleutelrol speelt bij het beheersen van celproliferatie door de passage door het restrictiepunt van de celcyclus te reguleren. De rol van het Rb-eiwit bij het beheersen van de progressie door de celcyclus helpt verklaren waarom retinoblastoom alleen bij jonge kinderen wordt waargenomen.

Tegen de tijd dat een kind de leeftijd van 5 of 6 jaar bereikt, is het netvlies volledig gevormd en verlaten de meeste netvliescellen de celcyclus en stoppen permanent met delen. Zodra dat gebeurt, zijn deze cellen niet meer vatbaar voor ongecontroleerde proliferatie omdat de celcyclus permanent is gestopt.

Genen zoals RB - waarvan het verlies de deur opent naar overmatige en verlegen celproliferatie en kanker - worden tumorsuppressorgenen genoemd. Deze naam is echter enigszins misleidend, omdat de normale functie van tumorsuppressorgenen is om celproliferatie in het algemeen te beperken, niet alleen de vorming van tumoren.

Maar als het RB-gen betrokken is bij de algemene beperking van celpro­liferatie, zou het verlies ervan dan niet moeten leiden tot kankers in andere weefsels dan het netvlies? In feite is retinoblastoom niet de enige vorm van kanker die voorkomt bij kinderen die RB-mutaties erven. Dergelijke personen ontwikkelen vaak ook een tweede type kanker, meestal osteosarcoom maar soms leukemie, melanoom, longkanker of blaaskanker. De tumorcellen in deze kankers vertonen mutaties in de tweede kopie van het RB-gen, net als bij retinoblastoom.

Er zijn ook RB-mutaties gevonden bij verschillende soorten kanker die geen erfelijke aanleg hebben. Bijvoorbeeld, kleincellige longcarcinomen - een type kanker dat vooral voorkomt bij sigarettenrokers zonder familie aanleg voor kanker - vertonen vaak RB-mutaties die worden gecreëerd door de kankerverwekkende stoffen die aanwezig zijn in tabaksrook in plaats van te worden geërfd.

Niet-overgeërfde RB-mutaties zijn eveneens geïmpliceerd bij de ontwikkeling van sommige blaas- en borstkankers. Het RB-gen speelt daarom een ​​bredere rol bij het ontstaan ​​van kanker dan de naam doet vermoeden. Het gen wordt '8220RB'8221 genoemd omdat het aanvankelijk werd ontdekt in families met een hoog risico op retinoblastoom, maar zijn rol bij de beheersing van celproliferatie en kanker is veel breder.

Familiale adenomatose polyposis:

Het RB-gen is een voorbeeld van een gen dat een hoog risico geeft op een zeldzame kanker bij kinderen wanneer het wordt geërfd in een gemuteerde (of verwijderde) vorm. Een andere groep genen creëert erfelijke aanleg voor enkele veelvoorkomende kankers bij volwassenen. Ongeveer 5% van alle gevallen van darmkanker is bijvoorbeeld direct gekoppeld aan erfelijke mutaties in een kleine groep genen die het risico op darmkanker verhogen.

Hoewel 5% geen erg hoog percentage is, vertegenwoordigt het een groot aantal mensen omdat darmkanker een van de meest voorkomende vormen van kanker bij volwassenen is. Elk jaar worden in de Verenigde Staten ongeveer 150.000 nieuwe gevallen van darmkanker gediagnosticeerd, dus 5% van de 150.000 is gelijk aan 7500 nieuwe darmkankers veroorzaakt door erfelijke factoren met een hoog risico.

In het geval van retinoblastoom is een veel groter deel van de gevallen erfelijk (ongeveer 40%), maar retinoblastoom zelf is zeer zeldzaam. Elk jaar worden ongeveer 200 nieuwe gevallen van retinoblastoom ontdekt, dus 40% komt overeen met 80 nieuwe gevallen van erfelijk retinoblastoom, vergeleken met 7500 nieuwe gevallen van erfelijke darmkanker.

Mutaties in verschillende genen zijn betrokken bij erfelijke darmkankers. Een daarvan is het gen dat verantwoordelijk is voor familiale adenomateuze polyposis, een erfelijke aandoening waarbij zich talrijke poliepen in de dikke darm ontwikkelen. De term poliep verwijst naar een kleine weefselmassa die voortkomt uit de binnenbekleding van een hol orgaan en uitsteekt in het lumen. De meeste dikkedarmpoliepen zijn kleine adenomen, dat wil zeggen goedaardige tumoren die zijn samengesteld uit kliercellen.

De aanwezigheid van poliepen die adenomen zijn, verklaart waarom de ziekte familiaire adenomateuze polyposis wordt genoemd. Bij mensen die deze aandoening erven, wordt het binnenoppervlak van de dikke darm bedekt met honderden of zelfs duizenden goedaardige poliepen (figuur 4), en ten minste één van de poliepen zal waarschijnlijk kwaadaardig worden tegen de tijd dat de persoon 40 jaar oud is.

Tenzij de hele dikke darm wordt verwijderd, zal vrijwel iedereen met familiaire adenomateuze polyposis zelfs en schuchter darmkanker krijgen. Dergelijke personen lopen ook een verhoogd risico op kanker van het galkanaal, de dunne darm en de maag. In Japan, waar maagkanker vaker voorkomt dan in de Verenigde Staten, kan het risico op maagkanker zelfs groter zijn dan dat op darmkanker.

De erfelijke mutatie die verantwoordelijk is voor familiale adenomateuze polyposis, bevindt zich in een gen genaamd APC (voor Adenomatous Polyposis Coli). Net als bij het RB-gen is het two-hit-model van toepassing op het gedrag van het APC-gen. Personen met familiale adenomateuze polyposis erven een enkele defecte of ontbrekende kopie van APC van één ouder, en een inactiverende mutatie treedt dan op in de tweede kopie van het gen in een epitheelcel van de dikke darm.

Het resulterende verlies van APC-functie leidt tot ongecontroleerde celproliferatie die het toneel kan vormen voor de ontwikkeling van kanker. Het APC-gen is daarom, net als het RB-gen, een voorbeeld van een tumorsuppressorgen, dat wil zeggen een gen waarvan het verlies of de inactivatie wordt geassocieerd met de ontwikkeling van kanker.

Het APC-gen oefent normaal gesproken zijn remmende effecten uit op celproliferatie door een eiwit te produceren, ook wel APC genoemd, dat de Wnt-signaleringsroute remt. ('8220Wnt'8221 is een afkorting voor '8220wingless-type', wat verwijst naar het lot van fruitvliegjes met mutaties in deze route.) De Wnt-route speelt een prominente rol bij het reguleren van celproliferatie en -differentiatie, vooral tijdens embryonale ontwikkeling.

Wanneer APC-mutaties optreden die een verlies van functioneel APC-eiwit veroorzaken, leidt de resulterende ongecontroleerde activiteit van de Wnt-route tot verhoogde celproliferatie. Epitheelcellen die de dikke darm bekleden, zijn bijzonder gevoelig voor dergelijke effecten. Bij mensen die een APC-mutatie erven, leidt overmatige proliferatie van het colonepitheel tot de vorming van talrijke poliepen en vroeg of laat darmkanker.

Dit verband tussen APC-mutaties en darmkanker is niet beperkt tot erfelijke darmkanker. Mutaties in APC komen ook voor bij ongeveer tweederde van de meest voorkomende vormen van darmkanker die optreden bij mensen zonder familiegeschiedenis van de ziekte.

Het Li-Fraumeni-syndroom:

De twee erfelijke syndromen die tot nu toe zijn beschreven, houden elk een overgeërfd risico in voor één hoofdtype kanker, ofwel retinoblastoom voor individuen die een mutant RB-gen erven, ofwel colonkanker voor diegenen die een mutant APC-gen erven. Bij de erfelijke aandoening die hierna wordt beschreven, het Li-Fraumeni-syndroom genaamd, wordt de gevoeligheid voor kanker in het algemeen in plaats van voor een specifiek type kanker overgedragen van ouder op nageslacht.

De familiestamboom weergegeven in figuur 5 illustreert een dergelijk geval. De vrouw gemarkeerd door de pijl is typerend voor iemand die genetische counseling zou zoeken uit angst dat “kanker zit in de familie.”

Haar vader had darmkanker toen hij 40 was, een sarcoom op 45-jarige leeftijd en longkanker toen hij 53 was haar zus had hersenkanker als tiener haar broer kreeg op 3-jarige leeftijd een osteosarcoom en rabdomyosarcoom (skeletspierkanker) op 14-jarige leeftijd a neef had leukemie als tiener een tante stierf aan borstkanker een oom had maagkanker en haar grootvader stierf aan melanoom.

Wat dit scenario duidelijk onderscheidt van andere erfelijke syndromen, is de verscheidenheid aan kankers. Personen die een gemuteerd RB- of APC-gen erven, hebben ongeveer 90% kans om één enkel type kanker te ontwikkelen, ofwel retinoblastoom in het geval van RB of darmkanker in het geval van APC.

De mutatie die verantwoordelijk is voor het Li-Fraumeni-syndroom geeft ook een risico van ongeveer 90% op het ontwikkelen van kanker, maar geen enkele kanker overheerst. Kankers die gewoonlijk worden geassocieerd met Li-Fraumeni syn­drome omvatten osteosarcomen, borstkankers, leukemieën, bijniercarcinomen, hersentumoren, weke delen sarcomen, melanomen en kankers van de maag, dikke darm en long.

Deze vormen van kanker ontstaan ​​zowel bij volwassenen als bij kinderen, maar de aanvangsleeftijd is gewoonlijk vroeger dan typisch zou zijn voor het betreffende type kanker. Een enkel individu kan achtereenvolgens verschillende soorten kanker ontwikkelen, wat zelden voorkomt bij niet-erfelijke kankers.

Zoals je zou verwachten van de diversiteit van de betrokken kankers, ontstaat het Li-Fraumeni-syndroom door defecten in een gen dat cruciaal is voor de controle van celproliferatie en overleving in veel weefsels. Het gen in kwestie is het p53-gen (ook wel TP53 genoemd bij mensen). Het p53-gen bevordert het p53-eiwit, in verschillende contexten.

Het p53-eiwit speelt een zeer belangrijke rol in de route die ervoor zorgt dat cellen met beschadigd DNA zichzelf vernietigen door apoptose. Ook door zonlicht geïnduceerde mutaties in het p53-gen veroorzaken de ontwikkeling van huidkanker en een viraal op co-eiwit geproduceerd door het humaan papillomavirus bindt aan en bevordert de vernietiging van het p53-eiwit, en draagt ​​zo bij aan de ontwikkeling van baarmoederhalskanker. De diversiteit van deze voorbeelden suggereert dat het p53-eiwit algemeen belangrijk is bij de bescherming tegen de ontwikkeling van kanker.

Het is daarom niet verwonderlijk dat personen met het Li-Fraumeni-syndroom, die een mutatie in één kopie van het p53-gen erven, een groot risico lopen op het ontwikkelen van kanker. De kans is ongeveer één op een miljoen per delende cel dat er een mutatie ontstaat in de tweede kopie van het p53-gen.

Aangezien miljarden cellen zich tijdens het leven van een persoon door het lichaam verdelen, is de kans extreem groot dat een mutatie die de tweede, goede kopie van het p53-gen verstoort, in ten minste één cel ergens in het lichaam verschijnt. Aangezien kanker zich ontwikkelt wanneer de p53-functie verloren gaat, is het p53-gen een ander voorbeeld (zoals RB en APC) van een tumorsuppressorgen.

Li-Fraumeni-syndroom is een uiterst zeldzame aandoening. Wereldwijd zijn er maar een paar honderd families met de aandoening gediagnosticeerd. Dat betekent echter niet dat p53-mutaties zeldzaam zijn bij menselijke kankers. Integendeel, p53-mutaties worden gedetecteerd in bijna de helft van alle niet-erfelijke kankers, waardoor het het meest gemuteerde gen bij menselijke kanker is.

In sommige gevallen is een verband tussen p53-mutaties en specifieke kankerverwekkende stoffen in de omgeving duidelijk vastgesteld, bijvoorbeeld de rol van door zonlicht geïnduceerde p53-mutaties bij niet-melanoom huidkankers.

Bovendien is gevonden dat ongeveer de helft van alle longkankers p53-mutaties vertoont in DNA-basen die worden aangevallen door de polycyclische koolwaterstoffen die aanwezig zijn in tabaksrook. Carcinogeen-geïnduceerde mutaties in p53 komen ook vaak voor bij veel andere soorten kanker, waaronder kanker van de dikke darm, pancreas, eierstok, blaas, lever, maag en borst.

Erfelijke kankersyndromen:

De drie erfelijke kankersyndromen die tot nu toe zijn beschreven:

l. Familiaal retinoblastoom,

ii. Familiale adenomateuze polyposis, en

iii. Li-Fraumeni-syndroom - delen verschillende kenmerken gemeen.

(1) Elk wordt veroorzaakt door een mutatie in een enkel tumorsuppressorgen (RB, APC of p53) geërfd van één ouder.

(2) Het verhoogde risico op het ontwikkelen van kanker is een dominante eigenschap omdat slechts één enkele mutatie hoeft te worden geërfd om een ​​zeer hoog risico op het ontwikkelen van kanker te geven, gewoonlijk in het bereik van 90% tot 100%.

(3) Om kanker daadwerkelijk te laten ontstaan, moet de tweede kopie van het gen ook geïnactiveerd worden (de '8220second hit'8221 van het two-hit-model). De kans dat dat in ten minste één delende cel gebeurt, is erg groot.

(4) Als een persoon met een van deze erfelijke syndromen kinderen krijgt, heeft elk kind een kans van 50:50 om het gendefect en het bijbehorende kankerrisico te erven (zie figuur 3, links).

(5) Kinderen die tot de 50% behoren die het genetische defect niet krijgen, lopen geen verhoogd risico op kanker en zullen het risico niet doorgeven aan hun kinderen.

(6) De genmutaties die verantwoordelijk zijn voor deze erfelijke kankersyndromen hebben betrekking op de inactivatie of het verlies van een tumorsuppressorgen waarvan de normale rol het beperken van celproliferatie is.

(7) Door kankerverwekkende stoffen geïnduceerde mutaties in dezelfde tumorsuppressorgenen kunnen niet-erfelijke kankers veroorzaken.

Naast RB, APC en p53 gedragen verschillende andere tumorsuppressorgenen zich volgens dezelfde principes (tabel 1, bovenaan). Hoewel deze genen allemaal de eigenschap delen om celproliferatie en overleving tegen te gaan, verschillen ze aanzienlijk in de betrokken moleculaire mechanismen.

2. Essay over erfelijk risico: genen die DNA-herstel en genetische stabiliteit beïnvloeden:

De erfelijke kankersyndromen die tot nu toe zijn besproken, worden veroorzaakt door functieverliesmutaties in tumorsuppressorgenen waarvan de normale rol is om celproliferatie en overleving te beperken. Een tweede groep tumorsuppressorgenen werkt via een fundamenteel andere reeks mechanismen die te maken hebben met DNA-herstel en chromosoomstabiliteit.

Terwijl de eerste groep tumorsuppressors eiwitten produceert die betrokken zijn bij de controle van celproliferatie, en waarvan het verlies daarom direct tot tumorvorming leidt, werkt het verlies van genen die betrokken zijn bij het repareren van DNA of het handhaven van chromo­some-stabiliteit indirect door een verhoogde mutatiesnelheid voor alle genen mogelijk te maken . Deze verhoogde mutatiesnelheid vergroot de kans dat willekeurige mutaties genen verstoren die de celproliferatie direct beïnvloeden.

De termen poortwachters en verzorgers worden gebruikt om onderscheid te maken tussen de twee klassen van tumoronderdrukkers. Genen zoals RB, APC en p53, wiens normale rol het is om celproliferatie te beperken, worden beschouwd als 'poortwachters'8221 omdat hun verlies de poorten naar tumorvorming direct opent. Genen die betrokken zijn bij het onderhoud en herstel van DNA worden daarentegen gezien als 'verzorgers'8221 die de integriteit van het genoom van een cel (de totale genetische informatie) behouden.

Het verlies van een verzorger-gen heeft geen directe invloed op de celproliferatie. In plaats daarvan leidt het tot verstoringen in het onderhoud en herstel van het DNA die een verhoogde mutatiesnelheid veroorzaken voor alle genen (inclusief poortwachters), en het is alleen door daaropvolgende mutatie van deze extra genen dat kanker ontstaat. We zullen nu enkele van de erfelijke kankersyndromen onderzoeken die worden veroorzaakt door mutaties in verzorgergenen.

Xeroderma Pigmentosum is een erfelijke gevoeligheid voor door zonlicht veroorzaakte huidkanker:

De eerste meldingen van een verband tussen DNA-herstel en vatbaarheid voor kanker kwamen uit de studie van een zeldzame erfelijke ziekte die bekend staat als xeroderma pigmentosum. Personen met deze aandoening zijn zo gevoelig voor ultraviolette straling dat zonlicht dodelijk kan zijn. Blootstelling aan zelfs maar een paar minuten daglicht is voldoende om ernstige verbranding en verschillende huidkankers te veroorzaken, waaronder basaalcelcarcinoom, plaveiselcelcarcinoom en melanoom.

Omdat het alleen veilig voor hen is om 's nachts naar buiten te gaan, worden kinderen met xeroderma pigmentosum soms aangeduid als “kinderen van de maan.” Er is zelfs een speciaal kamp in de staat New York, Camp Sundown genaamd, waar getroffen kinderen kunnen deelnemen aan normale recreatieve activiteiten, maar op een andere tijdklok: buitenactiviteiten beginnen na zonsondergang en vinden 's nachts plaats, zodat de kinderen weer binnen kunnen zijn en veilig achter gesloten gordijnen bij zonsopgang.

Wetenschappers van NASA zijn geïnteresseerd in het probleem en werken aan het ontwerp van een speciaal ruimtepak dat voldoende bescherming biedt tegen de zon zodat kinderen met xeroderma pigmentosum af en toe buiten kunnen spelen (Figuur 6).

Xeroderma pigmentosum vertoont niet hetzelfde overervingspatroon, waarbij sprake was van een enkele mutatie die werd geërfd van iemands moeder of vader. Xeroderma pigmentosum vereist dat twee mutante kopieën van hetzelfde gen worden geërfd, één van elke ouder.

Omdat het onwaarschijnlijk is dat beide ouders een gemuteerde versie van hetzelfde gen zullen dragen, is xero­derma pigmentosum een ​​zeer zeldzame aandoening. Als elke ouder echter een mutatie in hetzelfde verantwoordelijke gen draagt ​​(samen met een tweede, normale kopie), hebben hun kinderen 50% kans om de gemuteerde versie van hun vader te erven en 50% kans om een gemuteerde versie van hun moeder. De algehele kans dat een bepaald kind beide mutaties zal erven en xeroderma pigmentosum heeft, is daarom 50% X 50% = 25%.

Aangezien twee mutante kopieën van hetzelfde gen moeten worden geërfd om de ziekte te veroorzaken, vertoont xeroderma pigmentosum een ​​recessief overervingspatroon. Familiestambomen voor xeroderma pigmentosum zien er daarom anders uit dan de stambomen voor familiair retinoblastoom en Li-Fraumeni-syndroom.

Bij familiaal retinoblastoom en het Li-Fraumeni-syndroom, die een dominant overervingspatroon vertonen, lopen ouders die de hoogrisico-eigenschap op hun kinderen overdragen zelf een hoog risico op kanker omdat de eigenschap dominant is, en 50% van hun kinderen zal de aandoening met een hoog risico (zie figuren 2 en 5).

Bij kankersyndromen die een recessief overervingspatroon vertonen, zoals xeroderma pigmentosum, hebben de ouders geen hoog kankerrisico omdat ze elk slechts één enkel recessief gen dragen. De aandoening met een hoog risico zal echter voorkomen bij 25% van hun nakomelingen (Figuur 7).

Ondanks hun verschillende overervingspatronen, is het onderliggende gedrag van de tumorsuppressorgenen die betrokken zijn bij recessieve en dominante kankersyndromen niet zo verschillend als deze verschillen lijken te impliceren. Bij recessieve kankersyndromen ontstaat een hoog risico op kanker wanneer twee defecte kopieën van een gen worden geërfd en de normale genfunctie daardoor verloren gaat (Figuur 8a).

Bij dominante kankersyndromen (Figuur 8b) geeft het erven van één defect exemplaar een hoog risico op het ontwikkelen van kanker, maar kanker ontstaat pas nadat het tweede exemplaar is gemuteerd of verloren is gegaan (de '8220seconde hit'8221 van het two-hit-model). Het eindresultaat is dus in beide gevallen gelijk, dat wil zeggen dat beide kopieën van een tumorsuppressorgen hun functie verliezen.

Xeroderma Pigmentosum is Caused door erfelijke defecten bij excisieherstel:

De gevoeligheid voor huidkanker die het kenmerk is van xeroderma pigmentosum is terug te voeren op erfelijke defecten in DNA-herstel. Ultraviolette straling die door huidcellen wordt geabsorbeerd, leidt tot DNA-mutaties, vooral pyrimidinedimeren, die kanker kunnen veroorzaken als de mutaties niet worden hersteld.

Een mechanisme voor het repareren van pyrimidinedimeren is excisieherstel, een pad dat grote verstoringen in de dubbele DNA-helix herkent en een reeks enzymen gebruikt om het beschadigde gebied uit te snijden en de resulterende leemte op te vullen met de juiste sequentie van nucleotiden.

Eind jaren zestig werd voor het eerst gemeld dat cellen van personen met xeroderma pigmentosum niet in staat zijn excisieherstel uit te voeren. DNA-mutaties stapelen zich daarom op en vormen uiteindelijk kanker. Daaropvolgende studies hebben aangetoond dat mutaties in zeven verschillende genen xeroderma pigmentosum kunnen veroorzaken door hun effecten op excisieherstel.

Elk van deze zeven genen, aangeduid als XPA tot en met XPG, codeert voor een enzym dat betrokken is bij een andere stap van de excisieherstelroute. Het erven van twee defecte kopieën van een van deze zeven genen stopt het herstel van de excisie en creëert het kankerpredispositiesyndroom dat het kenmerk is van xeroderma pigmentosum.

Een achtste gen, genaamd XPV, produceert een variante vorm van xeroderma pigmentosum waarbij de excisieherstelroute niet wordt beïnvloed, maar individuen erven niettemin een verhoogde gevoeligheid voor door zonlicht geïnduceerde kankers. Deze specifieke mutatie beïnvloedt het enzym DNA-polymerase ƞ (eta), een speciale vorm van DNA-polymerase die translesiesynthese katalyseert - dat wil zeggen, de synthese van nieuwe foutvrije stukken DNA in regio's waar de matrijsstreng is beschadigd.

DNA-polymerase n is in staat DNA nauwkeurig te repliceren in gebieden waar pyrimidinedimeren aanwezig zijn, waarbij de juiste basen correct worden ingevoegd. Daarom interfereren erfelijke defecten in DNA poly­merase n, zoals erfelijke defecten in excisieherstel, met het vermogen van cellen om pyrimidinedimeren gecreëerd door ultraviolette straling te corrigeren.

Omdat personen met xeroderma pigmentosum pyrimidinedimeren niet kunnen repareren, vertonen ze huidkankerpercentages die 2000 keer hoger zijn dan normaal. Bovendien is hun gemiddelde leeftijd voor het ontwikkelen van huidkanker 8 jaar, vergelijkbaar met 60 jaar voor de algemene bevolking. De defecten in DNA-herstel geassocieerd met xeroderma pigmentosum veroorzaken ook een 20-voudige toename van kanker van de hersenen, longen, maag, borst, baarmoeder en testikels, evenals leukemieën.

Erfelijke niet-polyposis Darmkanker wordt veroorzaakt door erfelijke defecten bij herstel van mismatch:

Een tweede erfelijk syndroom, erfelijke niet-polyposis colonkanker (HNPCC) genoemd, verhoogt ook het risico van een persoon op het ontwikkelen van darmkanker, in dit geval vanwege een erfelijk defect in DNA-herstel.

Kanker heeft opnieuw de neiging om voort te komen uit colonpoliepen, hoewel mensen met HNPCC doorgaans slechts een paar poliepen hebben in plaats van de honderden of duizenden poliepen die worden waargenomen met familiale adenomateuze polyposis. (Polyposis betekent letterlijk '8220tallige poliepen'8221, dus de aanwezigheid van slechts een paar poliepen in HNPCC verklaart waarom de term niet-polyposis als onderdeel van de naam is opgenomen)

De overgeërfde mutaties die verantwoordelijk zijn voor HNPCC verstoren de herstelroute voor mismatch, die normaal gesproken verantwoordelijk is voor het corrigeren van fouten met basen die onjuist zijn gekoppeld tussen de twee strengen van de dubbele DNA-helix.Mismatch-reparatie vereist de deelname van veel verschillende eiwitten, en defecten in genen die coderen voor ten minste acht van deze eiwitten zijn betrokken bij HNPCC.

De ziekte vertoont een dominant overervingspatroon, wat betekent dat het erven van een enkele mutante kopie van een van de acht genen voldoende is om een ​​verhoogde vatbaarheid voor het ontwikkelen van darmkanker te creëren.

Kanker ontstaat echter alleen als de tweede, functionele kopie van het aangetaste gen wordt gemuteerd in een prolifererende epitheelcel die de dikke darm bekleedt. Als dat gebeurt, krijgt de aangetaste cel een tekort aan herstel van mismatches en produceert de proliferatie ervan cellen die mutaties accumuleren met een hogere snelheid dan normaal, wat op zijn beurt kan leiden tot kanker.

Ongeveer 75% van de personen die een van de acht gemuteerde genen erven die verantwoordelijk zijn voor HNPCC, ontwikkelen uiteindelijk darmkanker. Kleinere risicoverhogingen worden ook waargenomen voor kanker van de baarmoeder, eierstok, maag en nier.

Mutaties in de BRCA1- en BRCA2-genen zijn gekoppeld aan het erfelijke risico op borst- en eierstokkanker:

Bij vrouwen in de westerse wereld is borstkanker de tweede meest voorkomende vorm van kanker (na huidkanker) en de tweede meest voorkomende doodsoorzaak door kanker (na longkanker). De huidige statistieken suggereren dat ongeveer 1 op de 8 vrouwen in de Verenigde Staten in haar leven borstkanker zal krijgen.

Het risico op borstkanker is ruwweg verdubbeld bij vrouwen die een naaste bloedverwant met de ziekte hebben gehad (moeder, zus of dochter), en twee naaste familieleden verhogen het risico ongeveer vervijfvoudigd. Het risico wordt ook verhoogd door een voorgeschiedenis van borstkanker bij verder weg gelegen familieleden (bijv. tante of grootmoeder), die zich aan de kant van de familie van de moeder of van de vader kunnen bevinden.

Het hebben van een naast familielid met borstkanker betekent echter niet altijd dat de ziekte in de familie voorkomt. Borstkanker is een veelvoorkomende ziekte en veel vrouwen krijgen alleen bij toeval een familielid met borstkanker.

Ongeveer 10% van alle gevallen van borstkanker kan worden herleid tot een erfelijke aanleg met een hoog risico, meestal veroorzaakt door een erfelijke mutatie in het BRCA1- of BRCA2-gen (BRCA is een afkorting voor Breast Cancer). Erfelijke defecten in deze genen zijn verantwoordelijk voor familiale borstkanker, die wordt gekenmerkt door het ontstaan ​​van borstkanker op jonge leeftijd en, in sommige gevallen, kanker in beide borsten of borst- en eierstokkanker bij dezelfde persoon.

Afhankelijk van de exacte aard van de specifieke BRCA1- of BRCA2-mutatie die wordt geërfd, ligt het risico doorgaans in het bereik van 40% tot 80% voor borstkanker en 15% tot 65% voor eierstokkanker.

Interessant is dat vrouwen geboren na 1940 die mutaties in de BRCA1- of BRCA2-genen dragen een hoger risico hebben op het ontwikkelen van borst- (maar niet eierstokkanker) op basis van leeftijdsaanpassing dan vrouwen met dezelfde mutaties die vóór 1940 zijn geboren (Figuur 9) . Dergelijke bevindingen geven aan dat niet-genetische factoren het risico op het ontwikkelen van borstkanker significant beïnvloeden, zelfs bij personen en kinderen die een risicovolle aanleg erven.

Toen de BRCA1- en BRCA2-genen voor het eerst werden ontdekt, werd gedacht dat ze een rol speelden bij de controle van celproliferatie. Latere studies onthulden echter dat de eiwitten die door deze genen worden geproduceerd, betrokken zijn bij het herstel van DNA-schade, vooral dubbelstrengs breuken. Er is daarom geconcludeerd dat BRCA1- en BRCA2-mutaties niet direct de poorten openen voor overmatige celproliferatie, maar in plaats daarvan het proces van DNA-herstel belemmeren, waardoor het aantal daaropvolgende mutaties die tot kanker kunnen leiden, toeneemt.

Deze conclusie is consistent met de bevinding dat mutaties waarbij de klassieke tumorsuppressors, zoals RB, APC en p53, betrokken zijn, worden waargenomen bij zowel erfelijke als niet-erfelijke kankers omdat ze direct inwerken op celproliferatie en direct de poorten openen naar ongecontroleerde proliferatie en kanker.

Mutaties waarbij BRCA1 en BRCA2 betrokken zijn, worden daarentegen zelden gezien bij niet-erfelijke kankers, vermoedelijk omdat het 'caretaker'-genen zijn die de celproliferatie niet direct controleren en dus slechts indirect verband houden met de ontwikkeling van kanker.

Erfelijke defecten in DNA-reparatie liggen ten grondslag aan ataxie, teleangiëctasie, bloeisyndroom en Fanconi-anemie:

Erfelijke defecten in DNA-herstel zijn verantwoordelijk voor verschillende aanvullende kankersyndromen met een hoog risico, naast de tot nu toe beschreven. Hoewel ze allemaal voortkomen uit erfelijke defecten in DNA-herstel, vertonen deze syndromen een opmerkelijke diversiteit aan symptomen. Een treffend voorbeeld is een erfelijke aandoening die bekend staat als ataxie telangiectasie (ataxie = “gebrek aan coördinatie, ” telangiectasie = “dilatatie van haarvaten”).

De eerste afwijking die wordt gezien bij kinderen met ataxie-teleangiëctasie, meestal ontstaan ​​tussen 1 en 3 jaar oud, is een onvermogen om gestaag te lopen, veroorzaakt door degeneratie en shytie van het cerebellum, het deel van de hersenen dat de spiercoördinatie en -balans regelt.

Andere symptomen zijn abnormale oogbewegingen, onduidelijke spraak, vertraagde groei, terugkerende infecties als gevolg van een gebrekkig immuunsysteem en rode vlekken op de huid en het binnenoppervlak van de oogleden veroorzaakt door abnormale verwijding van kleine bloedvaten. De voorgaande symptomen gaan gepaard met een risico van ongeveer 40% op het ontwikkelen van kanker, meestal lymfomen en leukemieën, maar ook kanker van de huid, borst, maag, pancreas, eierstok en hersenen.

Het gen dat verantwoordelijk is voor ataxia telangiectasia, het ATM-gen genoemd (voor Ataxia Telangiectasia Mutated), vertoont een recessief overervingspatroon waarbij twee mutante ATM-genen moeten worden geërfd, één van elke ouder, om het syndroom te creëren. Geen van beide ouders zal waarschijnlijk ziektesymptomen vertonen omdat ze elk een enkel gemuteerd ATM-gen dragen waarvan de effecten recessief zijn en dus niet tot expressie worden gebracht.

Het ATM-gen codeert voor een eiwit dat betrokken is bij de reactie op DNA-schade, een ingewikkeld netwerk van cellulaire paden die worden aangeroepen als een beschermende reactie op aanvallen op de DNA-integriteit. Het ATM-eiwit speelt een centrale rol, zowel bij het detecteren van het optreden van DNA-schade, met name dubbelstrengsbreuken, als bij het activeren van een cascade van passende reacties.

Deficiënties in de DNA-schaderespons komen ook voor bij verschillende andere erfelijke syndromen, die elk een onderscheidend patroon van symptomen en kankerrisico's vertonen. Personen met het Bloom-syndroom worden bijvoorbeeld gekenmerkt door een kleine gestalte, door de zon veroorzaakte huiduitslag, immunodeficiëntie, verminderde vruchtbaarheid en een verhoogd risico op het ontwikkelen van kanker vóór de leeftijd van 20, meestal lymfomen, leukemieën en kankers van de mond, maag, strottenhoofd , long, slokdarm, dikke darm, huid, borst en baarmoederhals.

Het BLM-gen, waarvan de mutatie het Bloom-syndroom veroorzaakt, vertoont een recessief overervingspatroon en codeert voor een DNA-helicase, een eiwit dat de dubbele DNA-helix afwikkelt tijdens het herstel van dubbelstrengs breuken en andere soorten DNA-schade.

Bij Fanconi-anemie is het belangrijkste symptoom het onvermogen van het beenmerg om een ​​voldoende aantal bloedcellen te produceren, vergezeld van misvormingen van het skelet, misvormingen van organen, verminderde vruchtbaarheid en duidelijke aanleg voor het ontwikkelen van leukemieën en plaveiselcelcarcinomen. Fanconi-anemie vertoont een recessief overervingspatroon en wordt veroorzaakt door het inactiveren van mutaties in een van ten minste 11 verschillende genen.

De eiwitten die door deze genen worden geproduceerd, interageren met elkaar en met verschillende componenten van DNA-schadereactieroutes, waaronder de eiwitten die worden geproduceerd door de ATM- en BRCA1-genen. Een van de 11 genen die Fanconi-anemie kunnen veroorzaken, is BRCA2, hetzelfde gen dat familiale borstkanker veroorzaakt.

BRCA2 vertoont een dominant overervingspatroon voor familiale borstkanker en een recessief overervingspatroon voor Fanconi-anemie. Met andere woorden, het familiale borstkankersyndroom komt voort uit de overerving van een enkel mutant allel van BRCA2 en Fanconi-anemie komt voort uit de overerving van twee mutante allelen.

3. Essay over andere genen en problemen die erfelijkheidsrisico's veroorzaken:

De kankersyndromen met een hoog risico die tot nu toe zijn besproken, komen allemaal voort uit mutaties in tumorsuppressorgenen, ofwel gate & shykeeper-genen die betrokken zijn bij het beheersen van celproliferatie en overleving, ofwel verzorgergenen die betrokken zijn bij DNA-onderhoud en -herstel. Tumorsuppressors zijn echter niet de enige genen die het erfelijke kankerrisico beïnvloeden.

Meerdere endocriene neoplasie type II:

De erfelijke kankersyndromen die we tot nu toe hebben overwogen, hebben allemaal te maken met functieverliesmutaties, dat wil zeggen met mutaties die genen inactiveren of verwijderen, of ervoor zorgen dat ze niet-functionele producten produceren. Per definitie zijn de aangetaste genen tumorsuppressorgenen omdat een tumorsuppressorgen wordt gedefinieerd als een gen waarvan het functieverlies leidt tot kanker.

Gain-of-function-mutaties, die ervoor zorgen dat een gen een eiwit produceert dat nieuwe of overmatige activiteit vertoont, kunnen ook het erfelijke kankerrisico beïnvloeden. Misschien wel het best gekarakteriseerde syndroom dat op deze manier werkt, is multipele endocriene neoplasie type II, een erfelijke aandoening die gepaard gaat met de ontwikkeling van zowel goedaardige als kwaadaardige tumoren van endocriene klieren.

De ziekte begint meestal in de kindertijd en wordt gekenmerkt door ontwikkelingsafwijkingen die het gevolg zijn van de overproductie van specifieke hormonen. Ongeveer 70% van de getroffen personen ontwikkelt kanker op de leeftijd van 70, meestal schildklierkanker.

Meervoudige endocriene neoplasie type II wordt veroorzaakt door het erven van een enkel mutant RET-gen, dat codeert voor het Ret-receptoreiwit. De Ret-receptor bevindt zich op het oppervlak van endocriene cellen, waar het externe groeifactoren bindt en een signaal uitzendt dat celproliferatie stimuleert.

Normaal gesproken is de Ret-receptor alleen actief wanneer deze wordt gestimuleerd door een geschikte groeifactor, maar het gemuteerde RET-gen produceert een abnormale Ret-receptor die constitutief actief is, met andere woorden, de receptor brengt een signaal over dat celproliferatie stimuleert, ongeacht of er een groeifactor aanwezig is of niet .

De nieuwe functie die hierin is gemaakt “functieversterking” mutatie is daarom de productie van een eiwit waarvan de abnormale structuur het in staat stelt, in tegenstelling tot de normale versie van het eiwit, celproliferatie te stimuleren, onafhankelijk van de aanwezigheid van groeifactor.

De gemuteerde vorm van het RET-gen is dus een oncogen omdat de aanwezigheid ervan tot kanker kan leiden, en het normale RET-gen is een proto-oncogen omdat het nauw verwant is aan en kan worden omgezet in een oncogen.

Figuur 10 vat het fundamentele verschil samen in het gedrag van mutaties waarbij proto-oncogenen en tumorsuppressorgenen betrokken zijn. In wezen zijn tumorsuppressorgenen genen waarin functieverliesmutaties tot kanker leiden, en proto-oncogenen zijn genen waarin functiewinstmutaties tot kanker leiden.

Om de functie van een tumorsuppressorgen te verliezen, moeten beide kopieën meestal een inactiverende mutatie (of deletie) ondergaan. Daarentegen kan een mutatie van één kopie van een proto-oncogen voldoende zijn om een ​​oncogen te creëren waarvan de aanwezigheid bijdraagt ​​aan de ontwikkeling van kanker.

Erfelijke variaties in immuunfunctie en metabole enzymen:

We hebben gezien dat het risico op kanker toeneemt wanneer de immuunfunctie wordt verstoord, hetzij door een HIV-infectie, hetzij door ontvangers van een orgaantransplantatie die immunosuppressiva gebruiken.

Het is daarom niet verrassend dat erfelijke tekortkomingen in de immuunfunctie ook het risico op kanker kunnen verhogen. In sommige gevallen zijn verstoringen in de immuunfunctie een indirect effect van erfelijke mutaties waarvan het primaire effect niet op het immuunsysteem zelf ligt. Voorbeelden zijn onder meer ataxie-teleangiëctasie en het Bloom-syndroom, die het gevolg zijn van erfelijke defecten in DNA-herstel die verhoogde mutatiesnelheden veroorzaken, maar ook het vermogen van lymfocyten om hun normale immuunfuncties uit te voeren, aantasten.

Het resulterende verlies aan immuunactiviteit kan bijdragen aan de verhoogde kankerpercentages die bij dergelijke syndromen worden waargenomen, samen met de primaire rol die wordt gespeeld door defectief DNA-herstel bij het verhogen van de mutatiesnelheid in de cellen die eigenlijk voorbestemd zijn om kanker te worden.

Primaire immunodeficiëntieziekten, veroorzaakt door erfelijke mutaties die het immuunsysteem rechtstreeks uitschakelen, worden eveneens in verband gebracht met een bescheiden toename van het risico op kanker, hoewel een verhoogde vatbaarheid voor infecties meestal het belangrijkste symptoom is.

De meest voorkomende vormen van kanker zijn lymfomen, vaak veroorzaakt door EBV-infecties die ongeremd doorgaan bij afwezigheid van een effectieve immuunrespons. Immunode- en shyficiënties veroorzaakt door malaria of HIV worden op dezelfde manier geassocieerd met een verhoogde incidentie van EBV-geïnduceerde lymfomen.

Erfelijke tekortkomingen in de immuunfunctie hebben een indirect effect op het kankerrisico in plaats van zich rechtstreeks te richten op de cellen die bestemd zijn om tumoren te vormen. Een ander type indirect effect komt voort uit erfelijke verschillen in de leverenzymen die vreemde chemicaliën metaboliseren. Sommige carcino- en shygenen moeten metabolisch worden geactiveerd door cytochroom P450-enzymen in de lever voordat ze mutaties en kanker kunnen veroorzaken.

Vanwege deze vereiste kunnen erfelijke verschillen in leverenzymen de gevoeligheid van een persoon voor het ontwikkelen van kanker beïnvloeden. Van sigarettenrokers die bepaalde vormen van cytochroom P450 erven, is bijvoorbeeld gevonden dat ze hogere longkankerpercentages vertonen dan die van andere rokers.

Gevoeligheid voor kanker:

Mutaties met een hoog risico - dat wil zeggen mutaties die verantwoordelijk zijn voor de opvallende clustering van kanker binnen families - vertegenwoordigen in totaal niet meer dan 5% van de kankergevallen. De rol van erfelijkheid bij het bepalen van het risico op kanker is echter niet beperkt tot mutaties met een hoog risico, maar omvat ook de kleinere bijdragen van vele andere genen. De individuele effecten van deze genen met een klein risico zijn niet sterk genoeg om duidelijke patronen van kankervererving te creëren, maar als groep kunnen hun effecten op de vatbaarheid voor kanker aanzienlijk zijn.

Genen met een klein risico zijn moeilijk te identificeren omdat ze geen duidelijke familiepatronen van kankervererving creëren. Het identificeren van dergelijke genen wordt ook bemoeilijkt door het feit dat kanker ontstaat door een interactie tussen erfelijkheid en omgeving. Bij erfelijke mutaties met een hoog risico is de impact op het aantal kankergevallen zo groot dat omgevingsfactoren worden overschaduwd.

De effecten van genen met een klein risico worden daarentegen gemakkelijk verdoezeld door omgevings- of levensstijlomstandigheden. Stel bijvoorbeeld dat er een variant van een gen zou bestaan ​​die het risico van een persoon op het ontwikkelen van longkanker verdubbelt.

In de praktijk zou het moeilijk zijn om het bestaan ​​van een dergelijke toename op te sporen, omdat verschillen in rookgedrag (of blootstelling aan radon of asbest) een veel grotere invloed hebben op het percentage longkanker en daarom de effecten van de genetische factor.

Verschillen die zijn waargenomen in de kankercijfers van verschillende raciale en etnische groepen illustreren hoe moeilijk het kan zijn om de exacte rol van erfelijkheid te bepalen. Denk bijvoorbeeld aan de zwart-witte bevolking van de Verenigde Staten, die verschillende onderscheidende verschillen in kankerpatronen vertonen.

Een patroon dat gemakkelijk te verklaren is, betreft melanoom, een vorm van huidkanker waarvan de incidentie bij blanken ongeveer 15 keer hoger is dan bij zwarten. De verklaring voor dit verschil is vrij eenvoudig. Mensen met een donker gepigmenteerde huid produceren grote hoeveelheden melanine, een pigment dat ultraviolette straling absorbeert en daardoor de door zonlicht veroorzaakte mutatiesnelheden in de huid verlaagt.

Andere raciale verschillen in kankerpercentages zijn niet zo gemakkelijk te verklaren. Zwarten die in de Verenigde Staten wonen, hebben bijvoorbeeld hogere kankerpercentages dan blanken voor de meest voorkomende kankers, waaronder colon-, long- en prostaatkanker, hoewel geen borstkanker (Figuur 11, links). In theorie kunnen dergelijke verschillen worden veroorzaakt door subtiele variaties in kankergenen met een klein risico, maar niet-erfelijke mechanismen zijn even aannemelijk.

Een mogelijkheid die serieus is overwogen, is de sociaaleconomische status. Afbeelding 11 (rechts) illustreert de bevindingen van een onderzoek waarin het aantal kankergevallen per ras werd vergeleken voor personen met verschillende opleidingsniveaus, wat een indicator is van iemands algemene sociaaleconomische omgeving.

De gegevens tonen aan dat wanneer kankerpercentages worden vergeleken tussen personen met een gelijkwaardig opleidingsniveau, zwarten vergelijkbare (of zelfs lagere) kankerpercentages hebben dan blanken. Dus in plaats van gerelateerd te zijn aan genetische verschillen tussen raciale groepen, kunnen veel van de ongelijkheden in de incidentie van kanker die worden waargenomen bij zwarten en blanken, verband houden met sociaaleconomische variabelen. De risicofactoren die samenhangen met een lagere sociaal-eco­nomische status en die het meest waarschijnlijk van invloed zijn op het aantal kankergevallen, zijn blootstelling aan tabak en alcohol, slechte voeding, gebrek aan lichaamsbeweging en zwaarlijvigheid.

Genetische tests voor aanleg voor kanker:

De belangrijkste focus van dit essay was op kanker tendensen en verlegenheden die in gezinnen voorkomen. Als meerdere mensen in dezelfde familie kanker krijgen, betekent dit natuurlijk niet noodzakelijkerwijs dat erfelijkheid verantwoordelijk is. Kanker is een veel voorkomende ziekte en de aanwezigheid van meerdere gevallen van kanker in één gezin kan toeval zijn.

Gedeelde levensstijl of omgevingsfactoren kunnen ook verantwoordelijk zijn voor de clustering van kankergevallen binnen een gezin. Desalniettemin, wanneer mensen vermoeden dat er een genetische aanleg in het spel is, omdat het kankerpercentage in hun familie ongewoon hoog is.

De antwoorden op verschillende vragen kunnen aanwijzingen geven of de aandoening waarschijnlijk erfelijk is:

(1) Hebben meerdere gezinsleden dezelfde vorm van kanker ontwikkeld zonder duidelijke omgevings- of levensstijlverklaring, zoals het roken van sigaretten?

(2) Ontwikkelen familieleden kanker tijdens de kindertijd of eerder in de volwassenheid dan gebruikelijk is?

(3) Hebben individuele familieleden achtereenvolgens meerdere primaire kankers van hetzelfde type of verschillende soorten kanker ontwikkeld?

Als de voorgaande patronen bestaan, kan een verscheidenheid aan laboratoriumtests worden uitgevoerd om het DNA van een persoon te analyseren op erfelijke mutaties. Dergelijke genetische tests zijn momenteel beschikbaar voor bijna alle kankergevoelige genen die in tabel 1 worden vermeld, en aanvullende tests worden in snel tempo ontwikkeld.

Alvorens te besluiten genetische tests uit te voeren, is het belangrijk om de potentiële risico's en voordelen van testen te begrijpen (tabel 2). Om te beginnen vertelt het niet vinden van een kankerrisicomutatie u alleen over het gen waarvoor de test is ontworpen, en daarom kan er een andere mutatie aanwezig zijn die niet wordt gedetecteerd door de gebruikte procedures. Of de test kan een type mutatie detecteren dat nog niet eerder is gezien en dus van onzekere betekenis is. Het is daarom belangrijk om voorbereid te zijn op de mogelijkheid van ambigue resultaten.

Als genetische tests wijzen op de aanwezigheid van een mutatie met een hoog risico, kan deze ontdekking aanzienlijke angst en ongerustheid veroorzaken en kan ook de mogelijkheid van discriminatie door verzekeringsmaatschappijen of werkgevers toenemen.

Familierelaties kunnen onder druk komen te staan ​​omdat andere familieleden het nieuws dat er een risicovol kankergen in de familie voorkomt, misschien niet op prijs stellen. Bovendien gaat het vermogen om risicovolle mutaties op te sporen niet altijd gepaard met effectieve medische strategieën voor behandeling en preventie. Sommige mensen lopen daarom het risico te horen dat ze een grote kans hebben om kanker te krijgen en dat er weinig aan gedaan kan worden.

Positief is dat een voordeel van genetische tests is dat het een einde maakt aan de onzekerheid over iemands status, vooral als het individu zich al zorgen maakt omdat kanker in de familie lijkt te zitten. Een test die aangeeft dat er geen mutaties met een hoog risico aanwezig zijn, zal bijzonder goed nieuws zijn.

En voor mensen die ontdekken dat ze een mutatie met een hoog risico dragen, kan frequente en strenge medische screening voor vroege diagnose en, waar relevant, preventieve therapieën of gedragsveranderingen hun overlevingskansen verbeteren.

De resultaten van een genetische test kunnen ook helpen om de risico's voor andere familieleden te verduidelijken en kunnen uitwijzen of de mogelijkheid bestaat om een ​​risicovol kankergen door te geven aan de kinderen.

Uiteindelijk is de beslissing om al dan niet genetisch te testen een persoonlijke keuze die zorgvuldig thuiswerk en een goed begrip van je eigen psychologische aard vereist. Als twee mensen met exact dezelfde omstandigheden worden geconfronteerd, kan het gebruik van genetische tests om in de glazen bol te gluren en de toekomst te voorspellen een geschikte keuze zijn voor de ene persoon en niet voor de andere.


Stratton, MR Onderzoek naar de genomen van kankercellen: vooruitgang en belofte. Wetenschap 331, 1553–1558 (2011).

Alexandrov, LB et al. Handtekeningen van mutatieprocessen bij menselijke kanker. Natuur 500, 415–421 (2013).

Burns, MB, Temiz, NA & Harris, R.S. Bewijs voor APOBEC3B-mutagenese bij meerdere menselijke kankers. nat. Genet. 45, 977–983 (2013).

Roberts, S.A. et al. Een APOBEC-patroon van cytidinedeaminasemutagenese is wijdverbreid bij menselijke kankers. nat. Genet. 45, 970–976 (2013).

Burns, MB, Leonard, B. & Harris, R.S. APOBEC3B: pathologische gevolgen van een aangeboren immuun-DNA-mutator. biomed. J. 38, 102–110 (2015).

Harris, R.S. Moleculair mechanisme en klinische impact van APOBEC3B-gekatalyseerde mutagenese bij borstkanker. Borstkanker Res. 17, 8 (2015).

Chan, K. et al. Basisschade binnen enkelstrengs DNA ligt ten grondslag in vivo hypermutabiliteit veroorzaakt door een alomtegenwoordig milieuagens. PLoS Genet. 8, e1003149 (2012).

Landry, S., Narvaiza, I., Linfesty, D.C. & Weitzman, M.D. APOBEC3A kunnen de reactie op DNA-schade activeren en celcyclusstilstand veroorzaken. EMBO-rep. 12, 444–450 (2011).

Burns, MB et al. APOBEC3B is een enzymatische bron van mutatie bij borstkanker. Natuur 494, 366–370 (2013).

Mussil, B. et al. Menselijke APOBEC3A-isovormen verplaatsen zich naar de kern en induceren DNA-dubbelstrengsbreuken die leiden tot celstress en dood. PLoS ONE 8, e73641 (2013).

Nik Zainal, S. et al. Mutatieprocessen die het genoom van 21 borstkankers vormen. Cel 149, 979–993 (2012).

Roberts, S.A. et al. Geclusterde mutaties in gist en in menselijke kankers kunnen ontstaan ​​door beschadigde lange enkelstrengs DNA-gebieden. Mol. Cel 46, 424–435 (2012).

Bisschop, KN. et al. Cytidine-deaminering van retroviraal DNA door diverse APOBEC-eiwitten. Curr. Biol. 14, 1392–1396 (2004).

Dang, Y., Wang, X., Esselman, WJ & Zheng, Y.-H. Identificatie van APOBEC3DE als een andere antiretrovirale factor uit de menselijke APOBEC-familie. J. Virol. 80, 10522–10533 (2006).

Harris, R.S., Petersen-Mahrt, S.K. & Neuberger, MS RNA-editing-enzym APOBEC1 en enkele van zijn homologen kunnen fungeren als DNA-mutators. Mol. Cel 10, 1247–1253 (2002).

Henry, M. et al. Genetische bewerking van HBV-DNA door monodomein menselijke APOBEC3-cytidinedeaminasen en de recombinante aard van APOBEC3G. PLoS ONE 4, e4277 (2009).

Yu, Q. et al. APOBEC3B en APOBEC3C zijn krachtige remmers van de replicatie van het apenimmunodeficiëntievirus. J. Biol. Chem. 279, 53379–53386 (2004).

Cescon, D.W., Haibe-Kains, B. & Mak, T.W. APOBEC3B-expressie bij borstkanker weerspiegelt cellulaire proliferatie, terwijl een deletiepolymorfisme geassocieerd is met immuunactivering. Proc. nat. Acad. Wetenschap. VS 112, 2841–2846 (2015).

Waters, CE, Saldivar, J.C., Amin, Z.A., Schrock, M.S. & Huebner, K. FHIT-verlies-geïnduceerde DNA-schade creëert optimale APOBEC-substraten: inzichten in APOBEC-gemedieerde mutagenese. Oncotarget 6, 3409–3419 (2015)

Sasaki, H. et al. APOBEC3B genoverexpressie bij niet-kleincellige longkanker. biomed. vertegenwoordiger 2, 392–395 (2014).

Leonard, B. et al. APOBEC3B-upregulatie en genomische mutatiepatronen bij sereus ovariumcarcinoom. Kanker onderzoek. 73, 7222–7231 (2013).

de Bruin, EC et al. Ruimtelijke en temporele diversiteit in processen van genomische instabiliteit definieert de evolutie van longkanker. Wetenschap 346, 251–256 (2014).

Caval, V., Suspène, R., Vartanian, J.-P. & Wain-Hobson, S. Orthologe zoogdier APOBEC3A cytidine deaminasen hypermuteren nucleair DNA. Mol. Biol. Evol. 31, 330–340 (2014).

Shee, C. et al. Gemanipuleerde eiwitten detecteren spontane DNA-breuk in menselijke en bacteriële cellen. eLife 2, e01222 (2013).

Nik-Zainal, S. et al. Associatie van een kiemlijn kopie aantal polymorfisme van APOBEC3A en APOBEC3B met last van vermeende APOBEC-afhankelijke mutaties bij borstkanker. nat. Genet. 46, 487–491 (2014).

Caval, V., Suspène, R., Shapira, M., Vartanian, J.-P. & Wain-Hobson, S. Een veelvoorkomende gevoeligheid voor kanker APOBEC3A hybride allellager APOBEC3B 3' UTR verbetert chromosomale DNA-schade. nat. gemeenschappelijk 5, 5129 (2014).

Roberts, S.A. & Gordenin, D.A. Hypermutatie in het genoom van menselijke kanker: voetafdrukken en mechanismen. nat. Rev. Kanker 14, 786–800 (2014).

Poon, S.L., McPherson, J.R., Tan, P., Teh, B.T. & Rozen, S.G. Mutatiekenmerken van blootstelling aan kankerverwekkende stoffen: genoombrede detectie en nieuwe kansen voor kankerpreventie. Genoom Med. 6, 24 (2014).

Degtyareva, NP et al. Door oxidatieve stress geïnduceerde mutagenese in enkelstrengs DNA vindt voornamelijk plaats bij cytosines en is alleen -afhankelijk van DNA-polymerase voor adenines en guanines. Nucleïnezuren Res. 41, 8995–9005 (2013).

O'Shea, JP et al. pLogo: een probabilistische benadering voor het visualiseren van sequentiemotieven. nat. Methoden: 10, 1211–1212 (2013).

Taylor, BJ et al. DNA-deaminasen induceren breuk-geassocieerde mutatiedouches met implicatie van APOBEC3B en 3A bij kataegis van borstkanker. eLife 2, e00534 (2013).

Fredriksson, N.J., Ny, L., Nilsson, J.A. & Larsson, E. Systematische analyse van niet-coderende somatische mutaties en genexpressieveranderingen bij 14 tumortypen. nat. Genet. 46, 1258–1263 (2014).

Walker, BA et al. Mutatiesignaturen van de APOBEC-familie zijn geassocieerd met een slechte prognose van translocaties bij multipel myeloom. nat. gemeenschappelijk 6, 6997 (2015).

Lang, J. et al. Een veel voorkomende schrapping in de APOBEC3 genen en het risico op borstkanker. J. Natl. Kanker Inst. 105, 573–579 (2013).

Xuan, D. et al. APOBEC3 deletiepolymorfisme wordt in verband gebracht met het risico op borstkanker bij vrouwen van Europese afkomst. Carcinogenese 34, 2240–2243 (2013).

Chan, K., Resnick, MA & Gordenin, D.A. De keuze van nucleotide ingevoegd tegenover abasische plaatsen gevormd in chromosomaal DNA onthult de polymerase-activiteiten die deelnemen aan translesie-DNA-synthese. DNA-reparatie (Amst.) 12, 878–889 (2013).

Droger, Y. et al. Somatische herschikkingen over kanker onthullen klassen van monsters met verschillende patronen van DNA-breuk en door herschikking geïnduceerde hypermutabiliteit. Genoom onderzoek. 23, 228–235 (2013).

Mimitou, EP & Symington, L.S. DNA-uiteinderesectie - het ontrafelen van de staart. DNA-reparatie (Amst.) 10, 344–348 (2011).

Sakofsky, CJ et al. Door breuk geïnduceerde replicatie is een bron van mutatieclusters die ten grondslag liggen aan kataegis. Cel vertegenwoordiger 7, 1640–1648 (2014).

Het kankergenoomatlas onderzoeksnetwerk. Uitgebreide moleculaire karakterisering van urotheelblaascarcinoom. Natuur 507, 315–322 (2014).

Davis, C.F. et al. Het somatische genomische landschap van chromofoob niercelcarcinoom. kankercel 26, 319–330 (2014).

Broad Institute TCGA Genome Data Analysis Center. Analyse van mutagenese door APOBEC Cytidine-deaminasen (P-MACD) (Breed Instituut van MIT en Harvard, 2014).

Rooney, M.S., Shukla, S.A., Wu, C.J., Getz, G. & Hacohen, N. Moleculaire en genetische eigenschappen van tumoren geassocieerd met lokale immuuncytolytische activiteit. Cel 160, 48–61 (2015).

Snyder, A. et al. Genetische basis voor klinische respons op CTLA-4-blokkade bij melanoom. N. Engl. J. Med. 371, 2189–2199 (2014).

Casey, R.G. et al. Diagnose en behandeling van urotheelcarcinoom ter plaatse van de lagere urinewegen: een systematische review. EUR. Urol. 67, 876–888 (2015).

Powles, T. et al. Behandeling met MPDL3280A (anti-PD-L1) leidt tot klinische activiteit bij uitgezaaide blaaskanker. Natuur 515, 558–562 (2014).

Bellí, G., Garí, E., Piedrafita, L., Aldea, M. & Herrero, E. Een activator/repressor duaal systeem maakt strakke tetracycline-gereguleerde genexpressie in ontluikende gist mogelijk. Nucleïnezuren Res. 26, 942–947 (1998).

Storici, F. & Resnick, MA in Methoden Enzymologie Vol. 409 (eds. Judith, LC & Paul, M.) 329-345 (Academic Press, 2006).

Morrison, A., Bell, JB, Kunkel, T.A. & Sugino, A. Eukaryotische DNA-polymerase-aminozuursequentie vereist voor 3' → 5'-exonuclease-activiteit. Proc. nat. Acad. Wetenschap. VS 88, 9473–9477 (1991).

Sakamoto, A.N. et al. Mutatorallelen van gist-DNA-polymerase ζ. DNA-reparatie (Amst.) 6, 1829–1838 (2007).

Matsuda, T., Bebenek, K., Masutani, C., Hanaoka, F. & Kunkel, T.A. Low-fidelity DNA-synthese door humaan DNA-polymerase-ɛ. Natuur 404, 1011–1013 (2000).

Haldane, JBS Over een methode om frequenties te schatten. Biometrie 33, 222–225 (1945).

Laurens, MS et al. Mutatie heterogeniteit bij kanker en de zoektocht naar nieuwe kanker-geassocieerde genen. Natuur 499, 214–218 (2013).

Benjamini, Y. & Hochberg, Y. Beheersing van het percentage valse ontdekkingen: een praktische en krachtige benadering van meervoudig testen. J.R. Stat. soc. B 57, 289–300 (1995).

Maiorov, V.N. & Crippen, G.M. Betekenis van wortel-gemiddelde-kwadraatafwijking bij het vergelijken van driedimensionale structuren van bolvormige eiwitten. J. Mol. Biol. 235, 625–634 (1994).


Dankbetuigingen

Dit werk is uitgevoerd op gegevens die eerder werden gepubliceerd onder auspiciën van het International Cancer Genome Consortium and Breast Cancer Somatic Genetics Study (BASIS), een onderzoeksproject gefinancierd door het zevende kaderprogramma van de Europese Gemeenschap (FP7/2010-2014) in het kader van de subsidieovereenkomst nummer 242006.

MH wordt ondersteund door de kernbeurs van het Wellcome Trust Sanger Institute. SN-Z was een Wellcome-Beit Fellow en werd persoonlijk gefinancierd door een Wellcome Trust Intermediate Clinical Research Grant (WT100183MA) aan het begin van het schrijven van dit manuscript, en vervolgens gefinancierd door een CRUK Advanced Clinician Scientist Award (C60100/A23916).


I. inleiding

Wetenschappelijke en klinische grondgedachte voor het aanpakken van 𠇌T- en IR-resistente MMR-deficiënte kankers bij de mens

DNA-mismatchreparatie (MMR) is een zeer geconserveerd maar complex DNA-reparatiesysteem dat zorgt voor genomische stabiliteit op verschillende niveaus, waaronder: het corrigeren van mismatches die zijn gegenereerd tijdens DNA-replicatie het blokkeren van genetische recombinatiegebeurtenissen tussen uiteenlopende DNA-sequenties en het bemiddelen van celdood als reactie op bepaalde DNA-beschadigende middelen ( Jiricny, 2006). MMR-deficiëntie wordt voornamelijk geassocieerd met het autosomaal dominante erfelijke niet-polyposis colorectale kanker (HNPCC)-syndroom, als gevolg van MMR-genmutaties, waaronder de hMLH1, hMSH2, hMSH6, en hPMS2 genen (Lynch en de la Chapelle, 2003). MMR-deficiëntie wordt ook geassocieerd met een toenemend aantal sporadische microsatelliet-instabiliteit-hoge (MSI-H) solide tumoren, voornamelijk gerelateerd aan promotormethylering van hMLH1 of hMSH2 genen (Peltomaki, 2003). Deze sporadische MSI-H-kankers omvatten verschillende soorten GI-kanker (maag-, pancreas-, slokdarm-, colorectaal), GYN-kanker (endometrium, eierstok), GU-kankers (blaas, urineleider) en niet-kleincellige longkanker (NSCL), en hooggradige primaire hersentumoren, waarbij MMR-deficiëntie (MSI-H-fenotype) wordt gevonden in tot 10�% van deze veel voorkomende kankers (Peltomaki, 2003). Belangrijk is dat MMR-deficiëntie geassocieerd is met: in vitro/in vivo “schadetolerantie” (resistentie) tegen meerdere verschillende klassen van klinisch actieve chemotherapiemedicijnen (Stojic et al., 2004 Jiricny, 2006 Modrich, 2006 Kinsella, 2009) en tegen andere soorten DNA-schade (stress) waaronder ioniserende straling (IR Yan et al., 2001, 2009 Brown et al., 2003 Cejka et al., 2004) en hypoxie (Kondo et al., 2001 Mihaylova et al., 2003 Koshiji et al., 2005 Klein en Glazer, 2010) . Interessant is dat promotor hypermethylering van hMLH1 en hMSH2 genen en het daaropvolgende verlies van MMR-eiwitexpressie werd gevonden in bijna 50% van de NSCL-kankers die voorkomen bij niet-rokers en werd geassocieerd met een slechte prognose, zelfs bij longkankers in een vroeg stadium (Hsu et al., 2005). MSI-H gelokaliseerde colonkankers lijken echter een betere prognose te hebben dan MMR-bekwame (MMR+) tumoren na een operatie (Lynch en de la Chapelle, 2003, Peltomaki, 2003). Deze tegenstrijdige klinische gegevens onderstrepen de biologische complexiteit van MMR en het translationele belang ervan voor kankertherapieën.

De MMR-route is een multi-eiwitsysteem dat drie subprocessen heeft (Lynch en de la Chapelle, 2003 Jiricny, 2006 Kinsella, 2009). Deze subprocessen omvatten: ten eerste, mismatch-herkenning door MutS'x003b1 (een MSH2/MSH6-dimeer) of MutS'x003b2 (een MSH2/MSH3-dimeer) ten tweede, mismatch-excisie, die wordt geïnitieerd door de binding van MutL'x003b1 (een MLH1 /PMS2-dimeer) of MutLβ (een MLH1/MLH3-dimeer) naar MutSα en de daaropvolgende rekrutering van een exonuclease (EXO1) dat sequentieel nucleotiden verwijdert tussen een aangrenzende enkelstrengige breuk (SSB) tot en voorbij de mismatch op de dochter-DNA-streng en ten derde, hersynthese en ligatie geïnitieerd door DNA-polymerase δ samen met ten minste twee andere eiwitten, prolifererend celkernantigeen (PCNA) en replicatie-eiwit A (RPA), gevolgd door het afdichten van de inkeping in de dochterstreng door een DNA-ligase.

�schadigingstolerantie” (geneesmiddelresistentie) is aangetoond in MMR-deficiënte (MMR −) cellen van mens en muis voor methylerende middelen zoals temozolomide, dacarbazine en procarbazine-platina-analogen, waaronder cisplatina en carboplatina antracyclines zoals nucleosidemycine en analogen zoals 6-thioguanine (6-TG), jododeoxyuridine (IUdR) en de fluoropyrimidinen [zowel 5-fluorouracil (5-FU) als 5-fluorodeoxyuridine (FUdR)] (Berry et al., 1999, 2000, 2003 Meyers et al., 2001, 2003 Yan et al., 2003 Jiricny, 2006 Modrich, 2006 Kinsella, 2009). IR-resistentie in MMR − cellen wordt ook gevonden, met name bij gebruik van lage dosistempo (LDR)–IR (Yan et al., 2009). Op basis van biochemische en moleculaire analyses is aangetoond dat MMR-eiwitten (voornamelijk het MutSα-complex) de meeste van deze chemisch gemodificeerde 'misparen' herkennen. Deze chemisch of IR-gemodificeerde DNA-basen zullen echter niet worden verwijderd tijdens de DNA-afbraakstap van MMR, tenzij ze aanwezig zijn in de streng die de discontinuïteit bevat (dwz de dochterstreng). Als er geen functionele MMR is, zien cellen deze chemisch of IR-gemodificeerde basen niet in hun DNA en blijven ze accumulerende mutaties in het DNA repliceren.

Na herkenning van een geneesmiddel of een IR-geïnduceerd adduct in DNA, kunnen MMR+-cellen een cytotoxische (celdood) respons ondergaan. Het is nog steeds onduidelijk of deze reactie direct wordt veroorzaakt door de MMR-machinerie die een signaalcascade initieert die de cellen aanstuurt om ofwel de mismatch te herstellen of celdood te ondergaan (algemeen schadesensormodel van MMR), of dat deze toxiciteit indirect te wijten is aan vergeefse pogingen van MMR om het DNA te repareren dat een medicijn of IR-geïnduceerd structureel adduct in de sjabloon (ouderstreng) bevat in overeenstemming met het futiele cyclusreparatiemodel van MMR (Stojic et al., 2004 Jiricny, 2006 Modrich, 2006). Doorgaans vertonen MMR+-cellen een verlengde G2 stopzetting van de celcyclus en een daaropvolgende cytotoxische respons na twee of meer ronden van DNA-replicatie na blootstelling aan geneesmiddelen zoals temozolomide, 6-TG en de fluoropyrimidinen (5-FU, FdUrd Meyers et al., 2001, 2003 Yan et al., 2003 Stojic et al., 2004 Jiricny, 2006 Kinsella, 2009). Deze tijdelijke waarnemingen kunnen erop wijzen dat de MMR-eiwitten gewijzigde mismatches herkennen die het gevolg zijn van daaropvolgende replicatierondes (Ϣ) van DNA dat de adducten bevat, in plaats van de initiële adducten gevormd door de opname of interactie van deze geneesmiddelen en IR met DNA.

Ongeacht het mechanisme waarmee MMR een cytotoxische respons in cellen op de vele verschillende soorten geneesmiddelen of IR-geïnduceerde DNA-adducten bemiddelt, resulteert een tekort aan MMR (MMR − ) in een “schadetolerantie” of 𠇍rug en Fenotype van IR-resistentie, dat directe implicaties kan hebben voor het succes van chemotherapie en voor op fluoropyrimidine en/of platina gebaseerde radiosensibilisatie in de kliniek. Er zijn steeds meer voorbeelden in de literatuur van klinisch relevante chemotherapie, radiotherapie of chemotherapie + radiotherapie “resistance” in MMR − menselijke kankers. In een humaan glioblastoom multiforme tumor xenotransplantaatmodel bijvoorbeeld, bleek verlies van MMR na behandeling met procarbazine resistentie te verlenen tegen temozolomide, MNNG en busulfan, naast procarbazine (Friedman et al., 1997). Een klinische vervolgstudie door dezelfde onderzoekers heeft gesuggereerd dat analyse van de niveaus van MLH1- en MSH2-expressie voorafgaand aan chemotherapie met temozolomide kan helpen bij het voorspellen van de behandelingsreacties bij patiënten met nieuw gediagnosticeerde kwaadaardige gliomen (Friedman et al., 1998). In deze klinische studie vertoonden patiënten met MMR-maligne gliomen een duidelijk verminderde respons en overleving in vergelijking met patiënten met MMR+-gliomen. Belangrijk is dat het gebruik van bestralingstherapie en gelijktijdige temozolomide (TMZ) gevolgd door maandelijks onderhoud TMZ nu de standaardbehandeling is bij patiënten met glioblastoom (Stupp et al., 2005). Inderdaad, somatische puntmutaties in hMSH6 worden aangetroffen in tot 30% van de recidiverende/progressieve glioblastomen, die niet aanwezig waren in monsters vóór de behandeling. Inactivering van hMSH6 was gecorreleerd met eerdere of aanhoudende TMZ-blootstelling en resulteerde in verbeterde tumorgroei en kortere overleving (Cahill et al., 2007).

Eerdere studies in cellijnen van eierstokkanker suggereren dat behandeling met platinaverbindingen geselecteerd wordt op overlevende cellen met lagere MMR-eiwitexpressie of verlies van MMR Brown et al. (1997). Een significante afname van de expressie van zowel MSH2- als MLH1-eiwitten na chemotherapie met cisplatina werd gevonden bij patiënten met sporadisch optredende ovariumtumoren (Samimi et al., 2000). Een verminderde eiwitexpressie van MLH1 na op adriamycine gebaseerde chemotherapie bij borstkankerpatiënten correleerde ook significant met een verminderde ziektevrije overleving (P =𠂐.0025), (Mackay et al., 2000), wat aangeeft dat de resistentie die MMR-deficiëntie aan veel middelen voor kankerchemotherapie verleent, klinisch relevant is.Analyses van het gebruik van op fluoropyrimidine gebaseerde adjuvante chemotherapie bij patiënten met MMR − (microsatelliet-instability-high, MSI-H) colon- en slokdarmkanker toonden significant minder voordeel in ziektevrije overleving in vergelijking met een significant voordeel bij patiënten met MMR + colon- en slokdarmkanker. (Kishi et al., 2003 Ribic et al., 2003 Sargent et al., 2010) Bovendien vertonen MMR-endometrium- en rectumkankers verminderde lokale controle en pathologische responspercentages na alleen bestralingstherapie (Bilbao et al., 2010) of met 5-fluorouracil-bestralingstherapie gecombineerde modaliteitsbehandeling (Choi et al., 2007). Daarentegen hebben we aangetoond dat deze MMR-geneesmiddel- en IR-resistente kankers bij de mens verbeterde IUdR-opname en verhoogde IUdR (IPdR)-gemedieerde radiosensibilisatie vertonen met behulp van experimentele in vitro/in vivo modellen. (Berry en Kinsella, 2001 Seo et al., 2004, 2005 Kinsella et al., 2007, 2008) De resultaten van deze experimentele gegevens zullen hieronder worden besproken.

Wetenschappelijke en klinische grondgedachte voor het gebruik van IUdR en zijn orale prodrug, IPdR, als radiosensitizers bij MMR-deficiënte menselijke kankers

IUdR is een gehalogeneerde thymidine-analoog en is erkend als een in vitro/in vivo en potentiële klinische radiosensitizer gedurende meerdere decennia (Kinsella, 1996). Na actief nucleosidetransport door celmembranen, wordt IUdR sequentieel gefosforyleerd tot IdUTP en opgenomen in DNA in competitie met thymidinetrifosfaat (dTTP Kinsella, 1996). De biochemische mechanismen van cellulaire radiosensibilisatie zijn gerelateerd aan het genereren van zeer reactieve vrije radicalen door IR van IUdR𠄽NA-opname, wat resulteert in verbeterde IR-geïnduceerde DNA-strengbreuken [zowel enkelstrengs (SSB) als dubbelstrengs (DSB)] terwijl ook IR-schade verandert reparatie (Kinsella, 1996). Over het algemeen wordt erkend dat de mate (%) van thymidine-vervanging door IUdR in DNA direct correleert met de mate (%) van radiosensibilisatie. Gerichte radiosensibilisatie door IUdR van bepaalde menselijke kankers is getest op basis van de hogere proliferatiesnelheid bij deze kankers in vergelijking met aangrenzende normale weefsels. In onze eerdere in vivo preklinische studies met dagelijkse orale of continue intraveneuze infusies van IUdR gedurende 4�  dagen voorafgaand aan IR met korte kuur (vier fracties/4  dagen), merkten we verhoogde radiosensibilisatie op (1,3𠄱.5× vergeleken met IR alleen ) maar verhoogde ook de % IUdR𠄽NA-opname in zowel het beenmerg als de darm (Kinsella et al., 1996). Klinisch beperkten systemische acute toxiciteiten voor beenmerg en darm de duur en totale dosis van continue intraveneuze infusies van IUdR tijdens gefractioneerde uitwendige bestralingstherapie (Epstein et al., 1994 Schulz et al., 2004).

IPdR is een pyrimidinon-nucleoside, dat oorspronkelijk werd gesynthetiseerd als een antiviraal middel, gebaseerd op de hypothese dat nucleosiden zonder een amino- of ketogroep op positie vier van de pyrimidinering zouden worden gebruikt als een substraat van viraal thymidinekinase (TK), maar geen zoogdier TK (Saif et al., 2007). Deze zelfde onderzoekers ontdekten vervolgens echter dat IPdR efficiënt kon worden omgezet in IUdR door een aldehyde-oxidase dat voornamelijk gelokaliseerd was in de lever van knaagdieren (Saif et al., 2007). Vervolgens hebben we aangetoond dat een aldehyde-oxidase in normaal leverweefsel bij knaagdieren (muizen, ratten) en niet-knaagdieren (fretten, apen) IPdR snel omzet in IUdR in vivo evenals het tonen van vergelijkbaar IPdR-metabolisme met behulp van cytosolische extracten van normale menselijke lever in vitro (Kinsella et al., 1994, 1998). We hebben ook gemeld dat orale IPdR de therapeutische index van IUdR-gemedieerde radiosensibilisatie aanzienlijk kan verbeteren, vergeleken met continue infusie IUdR met behulp van humane colorectale en glioblastoma tumor xenograft-modellen (Kinsella et al., 1994, 1998, 2000a, b). De mate (%) van IUdR'x02013DNA-opname in dunne darm en beenmerg was opmerkelijk verminderd met een vergelijkbaar of hoger % IUdR𠄽NA-opname in de menselijke tumorxenotransplantaten met behulp van orale IPdR eenmaal daags toegediend × 14  dagen vergeleken met de maximaal getolereerde dosis IUdR als continue infusie (Kinsella et al., 1994, 1998, 2000a,b).

Als onderdeel van onze ICBP-onderzoeken hebben we aangetoond dat IUdR- (en IPdR)-cytotoxiciteit wordt beïnvloed door zowel MMR- als base-excisieherstel, waarbij beide DNA-reparatiesystemen G:IU-misparen kunnen herkennen (Kinsella, 2009). We hebben ook aangetoond dat MMR-cellen hogere niveaus van IUdR'x02013DNA-opname behouden met behulp van isogene in vitro en in vivo modellen, wat resulteert in verbeterde radiosensibilisatie in MMR-− vs. MMR+-kankers (Kinsella, 2008). Als zodanig ontwikkelen we nu IPdR als een potentiële klinische radiosensitizer voor MMR's en andere kankers die resistent zijn tegen 'cIR', in samenwerking met het National Cancer Institute. Een doel van de ontwikkeling van: in silico (computationele) modellen van MMR-verwerking van zowel IUdR als IR (zoals hieronder beschreven) is bedoeld om inzichten te verschaffen voor de opzet van klinische proeven om het doseringsschema voor oraal toegediende IPdR voor IUdR-gemedieerde radiosensibilisatie bij MMR's en andere IR-resistente menselijke kankers (Kinsella, 2008, 2009).


Dankbetuigingen

We danken dr. Caroline Kisker en dr. Jochen Kuper voor het delen van hun gegevens voorafgaand aan publicatie, dr. Masayoshi Honda en Shyamal Subramanyam voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de HHMI Early Career Scientist Award voor MS. CGW is een postdoctoraal onderzoeker van de American Cancer Society.

Auteursbijdragen: RAP, CGW en MS ontwierpen het onderzoek RAP en CGW voerden de experimenten uit en data-analyse RAP, CGW en MS interpreteerden de gegevens en schreven het manuscript.


Invoering

Figuur 1. Chemische structuren van gefunctionaliseerde nucleotiden, onnatuurlijke basenparen en suikers. 1, DNA 2, Ds:Px 3, dZ:dP 4, dNaM:d5SICS 5, S-DNA 6, γ-fosfaat-O-linker-dabcyl 7, N7-positie purine 8, C5-positie pyrimidinen 9, tryptamino 10, benzyl 11, naftyl 12, ethylindol 13, CeNA 14, HNA 15, FANA 16, PNA 17, 2′F 18, ANA 19, LNA 20, TNA 21, 2′OMe 22, 3′OMe 23, 2′deoxy 24, 2′SeMe.


Nieuwe op PCR gebaseerde test kan mogelijk lage niveaus van aanhoudende CML detecteren, leidende TKI-therapiekeuzes

Nieuwe op PCR gebaseerde test kan mogelijk lage niveaus van aanhoudende CML detecteren, leidende TKI-therapiekeuzes

Van CancerNetwork.com: Nieuwe test kan helpen bij het nemen van beslissingen over het stoppen van behandelingen bij CML

Verslaggever: Stephen J. Williams, Ph.D.

Nieuws | 15 februari 2016 | Chronische myeloïde leukemie, hematologische maligniteiten, leukemie en lymfoom
Door Dave Levitan
Een nieuwe gepersonaliseerde DNA-gebaseerde test kan volgens een nieuwe studie zeer lage niveaus van aanhoudende ziekte detecteren bij patiënten met chronische myeloïde leukemie (CML) waarvan wordt aangenomen dat ze in diepe remissie zijn. De test zou kunnen helpen bij de behandelingskeuzes met betrekking tot het staken van de therapie met een tyrosinekinaseremmer (TKI) bij deze patiënten.
Een aantal recente studies hebben de mogelijkheid onderzocht dat sommige patiënten de TKI-therapie zouden kunnen stoppen nadat ze diepe moleculaire remissie hadden bereikt. "De veilige introductie van een TKI-ontwenningsstrategie zou echter een betrouwbare en kosteneffectieve methode vereisen voor de identificatie van die patiënten met de laagste kans op terugval", schreven studieauteurs onder leiding van Alistair G. Reid, BSc, PhD, van Imperial College Londen.

Omdat de kans op terugval na stopzetting van de therapie waarschijnlijk verband houdt met de persistentie van de resterende ziekte, is testen op lage niveaus van BCR-ABL1-positieve ziekte van cruciaal belang. In de nieuwe studie testten de onderzoekers een test met behulp van gepersonaliseerde DNA-gebaseerde polymerasekettingreactie (dPCR) met identificatie van t(922)-fusieverbindingen. De resultaten zijn gepubliceerd in het Journal of Molecular Diagnostics.

Ze brachten met succes genomische breekpunten in kaart in 32 van de 32 monsters van CML-patiënten met een ziekte in een vroeg stadium. Vervolgens testten ze 46 monsters van 6 patiënten na behandeling met een TKI en vergeleken de resultaten met andere kwantitatieve PCR-methoden. 10 van de monsters werden gebruikt als positieve controles, terwijl de andere werden beschouwd als in diepe moleculaire remissie.

Van die 36 monsters detecteerde dPCR in 81% aanhoudende ziekte. Dit was gevoeliger dan twee andere op PCR gebaseerde benaderingen, waaronder RT-dPCR (25%) en op DNA gebaseerde kwantitatieve PCR (19%).

"De beschreven technologieën maken de toewijzing van absolute hoeveelheden aan beide" BCR-ABL1 DNA- en RNA-targets, waardoor voor het eerst een directe vergelijking van gemiddelde expressie versus cellulaire ziektelast mogelijk is”, schreven de auteurs. Ze voegden eraan toe dat het nog moet worden onderzocht of het risico op terugval na stopzetting van de therapie gerelateerd is aan alleen het aantal CML-cellen of ook aan de mate van transcriptionele activiteit in die cellen.

"Als deze techniek wordt gevalideerd in klinische onderzoeken naar het stoppen van TKI's, zal deze techniek een meer gepersonaliseerde benadering mogelijk maken van aanbevelingen voor dosisverlaging of stopzetting van het medicijn bij individuele patiënten, zodat de therapie alleen wordt stopgezet bij patiënten met de grootste kans op langdurige remissie", zei studie auteur Jane F. Apperley, MD, PhD, ook van Imperial College London, in een persbericht. "De techniek die we beschrijven, waarmee we bij alle geteste patiënten met succes een ziektespecifiek knooppunt in kaart hebben gebracht, is relatief eenvoudig, kosteneffectief en geschikt voor een laboratorium met hoge doorvoer."


Methoden:

Cel cultuur

Muis ES-cellen werden gekweekt zoals eerder beschreven [15]. In het kort werden 1,0 x 105 cellen gezaaid op een schaal van 60 mm bekleed met gelatine (0,1%). Cellen werden gehouden in op GMEM gebaseerd medium dat 10% FBS en 1000 eenheden/ml leukemie-remmende factor (Millipore ESGRO) bevat. De cellijn die in deze studie werd gebruikt, was G6GRGFP, die in een eerdere studie werd vastgesteld [23]. Er is gemeld dat bijna alle G6GRGFP differentieerden tot primitieve endoderm-achtige cellen na behandeling met dexamethason [15, 23]. Om ES-cellen te differentiëren tot primitieve endoderm-achtige cellen, werden 1,0 x 105 cellen gezaaid op een schaal van 60 mm bedekt met gelatine en gekweekt in op GMEM gebaseerd medium dat 10% FBS, 1000 eenheden/ml LIF en 100 mM dexamethason bevat voor 72 u. We hebben bevestigd dat bijna alle met Dex behandelde G6GR ES-cellen differentiëren tot primitieve endoderm-achtige cellen. Bovendien hebben we J1 ES-cellen gekweekt in overeenstemming met een procedure beschreven in een eerder rapport [21].

Celkleuring

Om dode of beschadigde cellen te identificeren, werd propidiumjodide (PI) aan de celsuspensie toegevoegd (eindconcentratie 1-2 g / ml). Als indicator van een ongedifferentieerde toestand in een suspensie die een mengsel van cellen bevat, werd Calcein-AM gebruikt. Suspensies voor cellen gekweekt onder onderhouds- en differentiatieomstandigheden werden onafhankelijk bereid en cellen in de onderhoudsconditie werden gedurende 10 minuten op ijs behandeld met 1 g / ml Calcein-AM. Na wassen met PBS werden celsuspensies van ES-cellen en PrE-cellen in dezelfde concentratie gemengd. Hoechst 33.342 werd gebruikt als indicator voor het DNA-gehalte in een cel. De procedures werden uitgevoerd zoals eerder beschreven [15].

Eencellige voorbereiding voor stromale vasculaire fractie

Deze experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met het protocol dat is goedgekeurd door de commissie voor dieronderzoek van het Nara Institute of Science and Technology en de RIKEN Animal Experiment Committee. Onderhuidse vetweefsels van drie tot vier maanden oude ICR mannelijke muizen (N = 3 per monster, twee biologische replicamonsters) werden in kleine stukjes gehakt en gedurende 35 minuten bij 37 ° C in een schuddend waterbad geïncubeerd met 0,4 U/mL collagenase NB4G (Serva). De verteerde oplossing werd achtereenvolgens gefiltreerd door celzeven van 100 en 40 m (Corning), gevolgd door centrifugatie bij 250 xG gedurende 5 minuten om volwassen adipocyten te verwijderen. De pellet werd behandeld met erytrocyt lysisbuffer (BD Biosciences) en gecentrifugeerd bij 180×G gedurende 5 minuten. De cellen met kern werden gesuspendeerd in HBSS met 0, 1% BSA, gefiltreerd door een celzeef van 20 m (pluriSelect) en vervolgens op ijs bewaard (celoplossing A). De celaggregaten die niet door de zeef van 20 m gingen, werden verder behandeld met Accutase (Thermo Fisher Scientific) bij 37 ° C gedurende 15 minuten om ze te dissociëren in afzonderlijke cellen, gecentrifugeerd bij 180 ×G gedurende 5 minuten en gesuspendeerd in HBSS met 0,1% BSA (celoplossing B). Celoplossingen A en B werden gemengd en opnieuw gefiltreerd door de celzeef van 20 m, gevolgd door centrifugatie bij 180 xG gedurende 5 minuten. De pellet werd opnieuw gesuspendeerd met HBSS met 0,1% BSA, gekleurd met PI en gebruikt voor eencellige analyse.

RNA voorbereiding

Totaal RNA werd gezuiverd uit gekweekte cellen met behulp van Direct-zol RNA MiniPrep-kit (Zymo Research) met TRIzol RNA Isolation Reagents (Thermo). We hebben de concentratie van gezuiverd totaal RNA gemeten met behulp van een NanoDrop 1000-spectrofotometer (Thermo). We hebben bevestigd dat het RNA-integriteitsgetal van totaal RNA meer dan 9,5 was met behulp van een Agilent RNA 6000 Nano Kit (Agilent). Schatting van de gemiddelde hoeveelheid totaal RNA per enkele cel voor respectieve monsters werd uitgevoerd in overeenstemming met onze vorige studie [15]. Voor high-throughput eencellige RNA-seq hebben we totaal RNA bereid uit een enkele cel met ERCC spike-in RNA. Eerst hebben we het ERCC spike-in RNA tienvoudig verdund. We voegden vervolgens 6 L 1:10 verdund ERCC spike-in RNA toe per 10 μg totaal RNA. We gebruikten verdund 10 pg totaal RNA met ERCC spike-in RNA voor de technische validatie van Quartz-Seq2. Voor afzonderlijke cellen gebruikten we dezelfde concentratie ERCC-spike-in-RNA.

Bulk RNA-seq-methoden voor celpopulaties

We hebben sequentiebibliotheek-DNA bereid met 1 μg totaal RNA met behulp van NEBNext Poly (A) mRNA Magnetic Isolation Module en NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit. Het totale RNA bevatte geen ERCC spin-in mix I. Daarnaast gebruikten we SuperScript III in plaats van ProtoScript in de RT-stap en KAPA HiFi DNA-polymerase in plaats van NEBNext High-Fidelity PCR DNA-polymerase in de PCR-stap. Het resulterende sequentiebibliotheek-DNA werd geanalyseerd door HiSeq2500.

Ontwerp van celbarcodes

De selectie van 384 of 1536 sequenties voor v3.1- en v3.2-barcodeprimersets werd uitgevoerd zoals hieronder beschreven. Eerst werden 1582 of 4714 kandidaatsequenties gemaakt met behulp van het DNABarcodes-pakket van R Bioconductor voor respectievelijk de v3.1-set met 14-mer en de v3.2-set met 15-mer (versie 1.0.0). Om het verlies van reads omgezet in UMI-tellingen te verminderen, hebben we de Sequence-Levenshtein-afstand toegepast als een bewerkingsafstand om het vermogen te maximaliseren om fouten te corrigeren die optreden tijdens de synthese van oligonucleotiden of sequencing [22]. De minimale afstand tussen twee willekeurige reeksen werd op 5 gehouden, wat leidde tot de correctie van maximaal twee fouten van substitutie, invoeging of verwijdering. Omdat de basesamenstelling van de gecreëerde sequenties niet uniform was, selecteerden we 384 of 1536 sequenties uit 1582 of 4714 gecreëerde sequenties zodat de variantie van de basesamenstelling afnam. Deze sequenties worden vermeld in Aanvullend bestand 5: Tabel S4.

Eencellige verzameling met behulp van flowcytometrie

Gekleurde cellen werden geanalyseerd met behulp van flowcytometrie SH800 (Sony) of MoFlo Astrios EQ (Beckman Coulter). Voor SH800 gebruikten we microfluïdische sorteerchips van 130 m. Voor MoFlo Astrios EQ hebben we spuitmondafmetingen van 100 μm gebruikt. Elke celsorteerder was uitgerust met een op maat gemaakte spatbescherming om besmetting door onverwachte druppeltjes tussen de doelput en aangrenzende putjes te voorkomen. We gebruikten twee sets RT-primer voor Quartz-Seq2. De set v3.1 RT-primers heeft 384 soorten unieke celbarcodes, met een lengte van 14 nucleotiden (OPC-zuivering, FASMAC). De set v3.2 RT-primers heeft 1536 soorten unieke celbarcodes, met een lengte van 15 nucleotiden (OPC-zuivering, Sigma). De set v3.1 RT-primers komt overeen met een set van de 384-wells PCR-plaat met lysisbuffer, waarvan de wells unieke barcodes hebben. De set v3.2 RT-primers komt overeen met vier sets van de 384-well PCR-plaat met lysisbuffer. De RT-primerpositie in de 384-wells-plaat en de sequentie waren zoals beschreven in aanvullend bestand 5: tabel S4. Enkele cellen werden geïsoleerd in de 384-wells PCR-plaat met 1 μL lysisbuffer (0,1111 μM respectievelijke RT-primers, 0,12 mM dNTP-mix, 0,3% NP-40, 1 eenheid/μL RNasin plus) die ERCC spike-in RNA bevatte. Tijdens eencellige sortering werd de PCR-plaat met 384 putjes op een 384 aluminiumstandaard bij 4 ° C gehouden. Voor Moflo Astrios EQ gebruikten we G5498B-060 Insert 384 Eppendorf twin.tec PCR als een 384 aluminium standaard (Agilent). Voor de SH800 hebben we een SH800 384 aluminium standaard (Sony) gebruikt. Onmiddellijk na de celverzameling werd de plaat tijdelijk verzegeld met LightCycler 480 Sealing Foil (Roche) en werd de verzegelde PCR-plaat met 384-wells gedurende 1 minuut gecentrifugeerd bij 10.000 g en 4 ° C met behulp van TOMY MX307, uitgerust met een Rack-in- Rotor en centrifugatierek PCR96-02. Deze stappen waren erg belangrijk om de druppel met een enkele cel in lysisbuffer op een efficiënte manier te verzamelen. Door het volume van de lysisbuffer te wijzigen van 0,4 L (zoals beschreven in het originele Quartz-Seq-papier) naar 1 μL (Quartz-Seq2), was het borrelen van de lysisbuffer niet nodig voordat eencellige sortering plaatsvond en kon de lysisbuffer gemakkelijk worden gehanteerd . Vervolgens hebben we de tijdelijke verzegeling opengetrokken en opnieuw verzegeld met Agilent PlateLoc Thermal Microplate Sealer (Agilent). We hebben de plaat gedurende 1 minuut bij 2600 rpm en 4 ° C geroerd met ThermoMixer C (Eppendorf), waarna we de plaat opnieuw hebben gecentrifugeerd. De resulterende plaat met 384 putjes werd vervolgens onmiddellijk gecryopreserveerd bij -80 ° C en onder dergelijke omstandigheden gehouden tot daaropvolgende RT voor celbarcodering. Na cryopreservatie voerden we binnen enkele maanden een daaropvolgende amplificatie van het hele transcript uit met behulp van de gecryopreserveerde 384-wells PCR-plaat.

Gehele transcriptieversterking van Quartz-Seq2

Gecryopreserveerde platen met 384 putjes met eencellig lysaat werden gedurende 1 minuut bij 10.000 g en 4 ° C gecentrifugeerd. Vervolgens hebben we gedurende 90 seconden totaal RNA in elke 384 plaat bij 70 ° C gedenatureerd en de RT-primer gedurende 15 seconden bij 35 ° C gehybridiseerd met gepolyadenyleerd RNA met behulp van de C1000/S1000 thermische cycler. De resulterende platen werden opnieuw 1 minuut gecentrifugeerd bij 10.000 g en 4 ° C. Vervolgens werden de platen bij 0°C op de 384 aluminiumplaat geplaatst. We pelden de verzegeling weg en voegden 1 L RT-premix (2× Thermopol-buffer, 5 eenheden/μL SuperScript III, 0,55 eenheden/μL RNasin plus) toe aan 1 μL lysisbuffer voor elk putje met behulp van een Mantis microfluïdisch doseersysteem (Formulatrix) of een 384 Transfer Plate-systeem (1859-384S, Watson). De bovenstaande RT-oplossing werd gebruikt voor de RT25-conditie. Voor de RT100-conditie hebben we de volgende RT-oplossing gebruikt: 2 × Thermopol-buffer, 20 eenheden/μL SuperScript III en 2,2 eenheden/μL RNasin plus. We verzegelden de platen opnieuw en roerden ze gedurende 1 minuut bij 2600 rpm en 4 ° C. De platen werden vervolgens gedurende 1 minuut bij 10.000 g en 4 ° C gecentrifugeerd.We voerden vervolgens RT uit bij 35 ° C gedurende 5 minuten en 50 ° C gedurende 50 minuten. De RT werd gedurende 15 minuten bij 70 ° C gestopt. Vervolgens werden de platen op een voorgekoeld aluminium blok geplaatst, waarna we de zegels eraf haalden. Vervolgens hebben we de platen ondersteboven gekeerd op de gemonteerde collector type A of type B (Aanvullend bestand 1: Figuur S4). We gebruikten voornamelijk type A. We centrifugeerden de platen met een verzamelcollector bij 3010 g en 4 ° C gedurende 3 minuten met rotors met zwenkbak. Vervolgens verzamelden we de cDNA-oplossing in een wegwerpreservoir. Doorgaans verkregen we 650-700 μL cDNA-oplossing van één PCR-plaat met 384 putjes. We hebben de cDNA-oplossing gezuiverd en geconcentreerd met behulp van de DNA Clean & Concentrator™-5 kit (Zymo Research). We gebruikten drie zuiveringskolommen voor één PCR-plaat met 384-wells in het geval van het v3.1 RT-primersysteem (384-cell barcode). Gezuiverd cDNA werd geëxtraheerd in 20 L nuclease-vrij water uit één kolomzuivering en overgebracht naar een acht-gekoppelde PCR-buis (TaKaRa). De PCR-buisjes werden bij 0°C op een aluminium PCR-standaard geplaatst. We hebben 25 L TdT-oplossing (1× Thermopol-buffer, 2,4 mM dATP, 0,0384 eenheden/μL RNase H (Invitrogen), 26,88 eenheden/μL terminal transferase (Roche)) toegevoegd aan 20 μL geëxtraheerd cDNA met behulp van een pipet bij 0 °C . De resulterende 45 L TdT-oplossing werd gedurende 1 minuut gemengd met een pipet bij 0 ° C of ThermoMixer bij 2000 g en 0 ° C. Onmiddellijk daarna werden de PCR-buizen gedurende 1 minuut bij 10.000 g en 0 ° C gecentrifugeerd. We gebruikten een C1000/S1000 thermische cycler uitgerust met de 96-Deep Well Reaction Module voor de volgende stappen. De PCR-buisjes werden op het blok van de thermische cycler geplaatst, die was voorgekoeld tot 0 °C. We voerden vervolgens een poly (A) tailing-reactie uit bij 37 ° C gedurende 75 s. De oplossing werd gedurende 10 minuten bij 65°C geïnactiveerd. De PCR-buisjes werden bij 0°C op een aluminium PCR-standaard geplaatst. Vervolgens hebben we ongeveer 11 L oplossing in vier putjes gedoseerd van 45 L TdT-oplossing. We hebben 46,16 L PCR I-premix (1,08492 × MightyAmp Buffer versie 2, 0,06932 μM Tagging-primer, 0,05415 eenheden/μL MightyAmp DNA-polymerase) toegevoegd aan 11 μL TdT-oplossing voor de respectieve putjes van de PCR-buis. MightyAmp DNA-polymerase, dat werd gebruikt in Quartz-Seq en Quartz-Seq2, wordt op de markt gebracht als Terra PCR Direct-polymerase [15]. We voerden zachte inversiemenging uit op de resulterende oplossing in de PCR-buis. De buizen werden vervolgens gedurende 1 minuut bij 10.000 g en 4 ° C gecentrifugeerd. Vervolgens werd de oplossing 2 minuten gemengd met ThermoMixer bij 2000 rpm en 4°C. Daarna draaiden we weer door de buis. Vervolgens hebben we de oplossing gedurende 130 s bij 98 ° C gedenatureerd en de tagging-primer gedurende 1 minuut bij 40 ° C gehybridiseerd met poly (A) -tailed cDNA. Daarna voerden we de stap Increment uit door elke seconde te verwarmen tot 68 ° C bij 0, 2 ° C en voerden we synthese van de tweede streng uit bij 68 ° C gedurende 5 minuten. De buisjes werden bij 0°C op een aluminium PCR-standaard geplaatst. We hebben 50,232 L PCR II-premix (0,99697 × MightyAmp Buffer-versie.2, 1,8952 μM gM-primer) toegevoegd aan 56,16 μL PCR I-oplossing. We voerden zachte inversiemenging uit op de resulterende oplossing in de PCR-buis. De buizen werden vervolgens gedurende 1 minuut bij 10.000 g en 4 ° C gecentrifugeerd. Vervolgens werd de oplossing 2 minuten gemengd met ThermoMixer bij 2000 rpm en 4 °C, waarna we de buis weer naar beneden centrifugeerden. We plaatsten het vervolgens op het blok van de thermische cycler bij 68 ° C. Vervolgens hebben we het cDNA gedurende 11 cycli geamplificeerd onder de volgende omstandigheden: 98 ° C gedurende 10 seconden, 65 ° C gedurende 15 seconden en 68 ° C gedurende 5 minuten. Vervolgens hebben we de buis nog 5 minuten bij 68 ° C geïncubeerd. Ten slotte hebben we alle PCR-oplossing, afgeleid van een PCR-plaat met 384 putjes, overgebracht naar een polypropyleen centrifugebuis van 50 ml (Watson). Meestal verkregen we ongeveer 1,2 ml PCR-oplossing per 384-wells PCR-plaat. We hebben 32 L 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en 6420 μL PB-buffer (Qiagen) aan de PCR-oplossing toegevoegd. Het mengsel werd vervolgens gezuiverd met behulp van een MinElute Spin Column (Qiagen). Gezuiverd cDNA werd geëxtraheerd in 40 L nuclease-vrij water. We hebben het cDNA bovendien gezuiverd met 32 ​​L Ampure XP-kralen. Ten slotte hebben we 32 L gezuiverd cDNA verkregen. We hebben de lengteverdeling van geamplificeerd cDNA gecontroleerd met een Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent). De typische gemiddelde grootte van het geamplificeerde cDNA in Quartz-Seq2 was ongeveer 1400 bp (aanvullend bestand 1: figuur S2c). De primersequenties worden vermeld in Aanvullend bestand 5: Tabel S4.

In het geval van het gebruik van de v3.2 RT-primer in Quartz-Seq2 hebben we de bovenstaande stappen als volgt gewijzigd. Na RT verzamelden we cDNA-oplossing in een wegwerpreservoir van vier sets van platen met 384 putjes, wat overeenkwam met 1536 putjes. We hebben de cDNA-oplossing gezuiverd en geconcentreerd met behulp van acht zuiveringskolommen voor vier PCR-platen met 384-putjes in het geval van het v3.2 RT-primersysteem. In de PCR-stap hebben we cDNA gedurende negen cycli geamplificeerd met de volgende voorwaarden: 98 ° C gedurende 10 s, 65 ° C gedurende 15 s en 68 ° C gedurende 5 minuten. Ten slotte hebben we alle PCR-oplossing afgeleid van vier 384-wells-platen overgebracht naar een 50 ml polypropyleen centrifugebuis (Watson). Meestal verkregen we ongeveer 3,5 ml PCR-oplossing per vier 384-well PCR-platen. We voegden 88 L 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en 17,6 ml PB-buffer (Qiagen) toe aan de PCR-oplossing. Het mengsel werd gezuiverd met behulp van de MinElute Spin Column (Qiagen). Vervolgens werd cDNA opnieuw gezuiverd met behulp van Ampure XP magnetische korrels.

Voor de Quartz-Seq1-achtige reactie hebben we de volgende procedure uitgevoerd in overeenstemming met onze vorige studie. We hebben 1 L RT-premix (2× PCR-buffer, 5 eenheden/μL SuperScript III, 0,55 eenheden/μL RNasin plus) toegevoegd aan 1 μL lysisbuffer. Vervolgens hebben we RT gedurende 5 minuten bij 35 ° C en gedurende 20 minuten bij 45 ° C uitgevoerd. Deze RT werd gedurende 15 minuten gestopt bij 70 ° C. We hebben 5 L ExoIB-oplossing toegevoegd (1,6 × Exonuclease I-buffer, 3,2 × PCR-buffer, 16 mM DTT) en 20 μL TdT-oplossing (1 × PCR-buffer, 3 mM dATP, 0,0384 eenheden/μL RNase H (Invitrogen), 33,6 eenheden/μL terminal transferase (Roche)) in 20 μL geëxtraheerd cDNA met behulp van een pipet bij 0 °C. De PCR-buisjes werden op het blok van de thermische cycler geplaatst die was voorgekoeld tot 0 °C. We voerden een poly (A) tailing-reactie uit bij 37 ° C gedurende 75 s. Vervolgens hebben we de oplossing gedurende 130 s bij 98 ° C gedenatureerd en de tagging-primer gedurende 1 minuut bij 40 ° C gehybridiseerd met poly (A) -tailed cDNA. Daarna hebben we synthese van de tweede streng gedurende 5 minuten bij 68 ° C uitgevoerd. Vervolgens hebben we het cDNA geamplificeerd via een PCR-reactie gedurende 12 cycli.

Bereiding van afgeknotte sequentieadapter

De getrunceerde sequentieadapter was samengesteld uit een rYshapeP5-primer (HPLC-gezuiverd) en rYshapeP7LT-primers (HPLC-gezuiverd), die een TruSeqLT-compatibele poolbarcode hadden. We hebben 100 M respectieve primers bereid met adapterbuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,8, 0,1 mM EDTA pH 8,0, 50 mM NaCl). We hebben 5 L van 100 μM rYshapeP5-primer en rYshapeP7LTxx-primer toegevoegd aan een enkele PCR-buis. We hebben de oplossing gedurende 90 s bij 90 ° C gedenatureerd. Daarna bereikten we gloeien door elke 30 s af te koelen tot 10 ° C met 0,5 ° C en het monster vervolgens op 4 ° C te houden. Vervolgens plaatsten we de buis op een aluminium PCR-standaard bij 0 ° C. Vervolgens hebben we adapterbuffer, die was voorgekoeld bij 0 ° C, toegevoegd aan 10 μL van 50 μM afgeknotte adapter. Ten slotte hebben we ongeveer 50 L van 10 μM afgeknotte adapter verkregen. We hebben 1 μL van 10 μM afgeknotte adapter in een PCR-buis bij -80 ° C gecryopreserveerd tot gebruik in de adapterligatiestap. De primersequenties worden vermeld in Aanvullend bestand 5: Tabel S4.

Sequentiebibliotheek voorbereiding van Quartz-Seq2

We hebben 130 L nuclease-vrij water inclusief 5-10 ng geamplificeerd cDNA toegevoegd aan een Crimp-Cap microTUBE met AFA Fiber. Vervolgens voerden we cDNA-fragmentatie uit met behulp van een LE220 Focused-ultrasonicator (Covaris) onder de volgende omstandigheden: arbeidsfactor 15%, piekinvallend vermogen 450 W, cycli per burst 200 en behandelingstijd 80 s. We hebben de cDNA-oplossing gezuiverd en geconcentreerd met behulp van de DNA Clean & Concentrator™-5 kit. Gezuiverd cDNA werd geëxtraheerd in 10 μL nuclease-vrij water uit één kolomzuivering en overgebracht naar een acht-gekoppelde PCR-buis (TaKaRa).

Vervolgens hebben we 2 L End-Repair premix (1,4 L End repair & A-tailing buffer en 0,6 μL End repair & A-tailing Enzyme (KAPA Biosystems)) toegevoegd aan 10 μL gefragmenteerde cDNA-oplossing. Vervolgens hebben we de oplossing gemengd door pipetteren op een aluminium PCR-standaard bij 0 ° C. De PCR-buisjes werden op het blok van de thermische cycler geplaatst, die was voorgekoeld tot 20 °C. Vervolgens hebben we de buizen gedurende 60 minuten bij 37 ° C en gedurende 30 minuten bij 65 ° C geïncubeerd. Hierna hebben we 2 L adapterbuffer (1,5 μM afgeknotte adapter, 10 mM Tris-HCl pH 7,8, 0,1 mM EDTA pH 8,0, 50 mM NaCl) en 8 μL ligatie-premix (6 μL ligatiebuffer, 2 μL DNA-ligase (KAPA Biosystems)) bij 4 °C. De 22 L ligatieoplossing werd goed gemengd door pipetteren bij 4 ° C. Vervolgens hebben we adapterligatie gedurende 15 minuten bij 20 ° C uitgevoerd. Na ligatie hebben we 18 L Ampure XP-kralen toegevoegd aan 22 μL adapter-ligatieoplossing en goed gemengd. Adaptor-geligeerd cDNA werd geëxtraheerd in 20 L nuclease-vrij water. We hebben 32 L PCR-premix (25 L 2 × KAPA HiFi ready-mix, 1,75 L 10 μM TPC2-primer (HPLC-gezuiverd), 10 μM P5-gMac hybride primer (HPLC-gezuiverd)) toegevoegd aan 18 μL adapter- geligeerd cDNA. We hebben de oplossing gedurende 45 s bij 98 ° C gedenatureerd. Vervolgens hebben we cDNA gedurende acht cycli geamplificeerd onder de volgende omstandigheden: 98 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 1 minuut. Ten slotte hebben we de buis gedurende 5 minuten bij 72 ° C geïncubeerd.

We hebben 40 L Ampure XP-korrels toegevoegd aan 50 L PCR-oplossing. Gezuiverd sequentiebibliotheek-DNA werd geëlueerd in 20-30 L nuclease-vrij water. We hebben de DNA-concentratie en DNA-grootte van sequentiebibliotheek-DNA gecontroleerd met behulp van de Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent) en QuantiFluor® dsDNA-systeem (Promega). We hebben ook sequentiebibliotheek-DNA bereid met Tn5-transposase, in overeenstemming met een aangepaste versie van een procedure die in een eerdere studie werd gebruikt [6]. In het bijzonder waren de wijzigingen als volgt. We gebruikten 0,75 ng geamplificeerd cDNA voor de Nextera XT-bibliotheekvoorbereidingskit. We hebben sequentiebibliotheek-DNA geamplificeerd met de P5-gMac hybride primer en de Nextera XT-primer, die de P7-sequentie heeft.

Diepe sequencing voor Quartz-Seq2

We analyseerden het DNA van de sequentiebibliotheek van Quartz-Seq2 met behulp van NextSeq500 (Illumina) en HiSeq2500 (Illumina). Voor de Read1-sequentie gebruikten we een aangepaste sequentie-primer genaamd Read1DropQuartz-primer (HPLC-gezuiverd). In het geval van de v3.1 RT-primer was de sequentiespecificatie als volgt (Read1, 22 cycli Index1, 6 cycli Read2, 64-118 cycli). In het geval van de v3.2 RT-primer was de sequentiespecificatie als volgt (Read1, 23 cycli Index1, 6 cycli Read2, 63 cycli). Toen de Read1-lengte binnen 64 nucleotiden lag, gebruikten we voornamelijk de NextSeq 500/550 High Output v2 Kit (75 cycli), die kan worden gebruikt voor het sequencen van maximaal 92 nucleotiden. Voor lange sequenties (meer dan 64 nucleotiden) analyseerden we sequentiebibliotheek-DNA met behulp van de HiSeq Rapid SBS Kit v2. Sequentieanalyse met HiSeq2500 werd ondersteund door de Genomic Network Analysis Support-faciliteit (GeNAS) in RIKEN en Phyloinformatics Unit van RIKEN Center for Life Science Technologies (voorheen GRAS) in RIKEN.

Amplificatievrije eencellige qPCR-analyse

Amplificatievrije eencellige qPCR werd uitgevoerd in overeenstemming met onze eerdere studie met de volgende wijzigingen [15]. We verzamelden een enkele cel in 1 L lysisbuffer (2,5 μM willekeurige hexameer, 1 mM dNTP-mix, 0,3% NP40, 2 eenheden/μL RNasin plus) van een 384-wells PCR-plaat (Eppendorf) met behulp van SH800. De resulterende PCR-plaat met 384 putjes werd gecryopreserveerd bij -80 ° C. We denatureerden totaal RNA in de 384-wells PCR-plaat bij 70 ° C gedurende 1,5 minuut met behulp van een C1000/S1000 thermische cycler en hybridiseerden de willekeurige primer met RNA bij 0 ° C gedurende 2 minuten. We hebben 1 μL RT-oplossing (2 × SSIV-buffer, 10 mM DTT, 2 eenheden/μL RNasin plus, 20 eenheden/μL SuperScript IV) aan de lysisbuffer toegevoegd. Vervolgens voerden we RT uit bij 23 ° C gedurende 10 minuten en 50 ° C gedurende 10 minuten. De RT werd gedurende 10 minuten bij 80 ° C gestopt. De resulterende oplossing werd verdund met qPCR-oplossing (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,05% Tween-20). De verkregen verdunde oplossing werd vervolgens gebruikt voor qPCR-detectie met QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix en het LightCycler480-systeem. Zie aanvullend bestand 5: tabel S4 voor primersets voor elk gen.

Drop-seq-experimenten en gegevensanalyse

Drop-seq werd uitgevoerd zoals eerder gerapporteerd [6] en in overeenstemming met een online protocol (//mccarrolllab.com/dropseq/), maar met de volgende aanpassingen: stroomsnelheden voor olie en waterige suspensies waren 14.000 μl/h en respectievelijk 4000 l/h. De diameter van de druppels was 95-100 m. Microfluïdische apparaten werden vervaardigd door Fluidware Technologies (Japan). Het lotnummer van kralen met streepjescode was 051415 (ChemGenes). Gegevensanalyse voor Drop-seq werd uitgevoerd zoals online beschreven (//mccarrolllab.com/dropseq/). De versies van de software en databases waren als volgt: STAR: v2.5.1b muisgenoom, GRCm38/mm10 genoomannotatie, gencode GRCm38.p4 vM9 en Drop-seq tools, v1.11.

Quartz-Seq2 uitlijning lezen en genereren van digitale expressiegegevens

De structuur van de sequentiebibliotheek en gegevensverwerking is ontworpen op basis van die van Drop-seq ([6] en online zoals hierboven vermeld). BCL-bestanden gegenereerd door Illumina NextSeq500 werden geconverteerd naar fastq-bestanden door bcl2fastq2 (v2.17.1.14) met demultiplexing pool-barcodes. De parameter --mask-short-adapter-reads was ingesteld op 20. Indien nodig werden fastq-lezingen willekeurig gedownsampled door seqtk-software (versie sgdp). We hebben de read2-lengte voornamelijk teruggebracht tot 62 nucleotiden voor Quartz-Seq2 met behulp van FASTX-Toolkit (versie 0.0.14). Fastq-bestanden voor Read1 en Read2 zijn door FastqToSam van Picard-tools (versie 1.134) geconverteerd naar een bam-bestand. Het extraheren van celbarcodes en UMI (ook wel moleculaire streepjescode genoemd) en het uitfilteren van uitlezingen met een lage streepjescodekwaliteit werden uitgevoerd met behulp van Drop-seq-tools (versie 1.11). De resulterende bam-bestanden werden opnieuw geconverteerd naar fastq-bestanden door SamToFastq van Picard-tools en toegewezen aan het muisgenoom (GRCm38/mm10) met behulp van STAR (versie 2.5.1b). Na het sorteren van de resulterende bam-bestanden met behulp van SortSam of Picard-tools, werden de niet-uitgelijnde bam en uitgelijnde bam samengevoegd door MergeBamAlignment of Picard-tools. Vervolgens werden gennamen toegewezen aan elk record met behulp van TagReadWithGeneExon of Drop-seq-tools en gtf-bestand (versie gencode GRCm38.p4 vM9). Voor de correctie van fouten van celbarcodes, rekening houdend met de Sequence-Levenshtein-afstand, werd een op maat gemaakt Python-programma (correct_bacode.py) gebruikt, waarmee de correctie van maximaal twee nucleotidefouten van substitutie, invoeging of verwijdering mogelijk was. Dit programma gebruikte Python2 (versie 2.7.11+), PypeR (versie 1.1.2), R (versie 3.2.3), Bioconductor (versie 3.2) en het Bioconductor-pakket DNABarcodes (versie 1.0.0). Ten slotte werd de UMI voor elk gen voor elke cel geteld met behulp van DigitalExpression of Drop-seq-tools, die de digitale expressiematrix genereerden. Om een ​​niet-UMI-gefilterde matrix te genereren, werd een op maat gemaakt Python-programma gebruikt dat reads voor elk gen voor elke cel telt. Om de kwantitatieve prestaties tussen Quartz-Seq2 en gerapporteerde gegevens in Fig. 4 te vergelijken, gebruikten we Ensembl75 als referentietranscript. Bovendien hebben we de read2-lengte voor de vergelijking teruggebracht tot 45 nucleotiden.

Dimensionaliteitsreductie, clustering en termanalyse

Cellen met een laag aantal gedetecteerde genen werden verwijderd voor verdere analyse (Quartz-Seq2 op ES/PrE-mengsel, 4000 genen Quartz-Seq2 op SVF, 500 genen). De totale tellingen van elke cel werden genormaliseerd tot 10.000 of het gemiddelde van de totale UMI-tellingen voor cellen. UMI-tellingen hadden 1 toegevoegd en werden vervolgens log-getransformeerd (natuurlijke logaritme), waarna ze werden geschaald om gemiddelde en variantie voor elk gen van respectievelijk 0 en 1 te hebben. Voor PCA werden UMI-tellingen voor alle gedetecteerde genen (voor ES/PrE-mengsel) of genen met zeer variabele expressie (voor SVF) gebruikt. Voor t-SNE werden de top 10 tot 40 belangrijkste componenten van matrices geproduceerd door PCA gebruikt. Voor clustering werd het DBSCAN-algoritme gebruikt. De waarden van de parameter epsilon waren 0,69 voor Quartz-Seq2 op het 4500 muis ES/PrE-mengsel, 5 voor Quartz-Seq2 op het 384 muis ES/PrE-mengsel, 3 voor Drop-seq op het 500 muis ES/PrE-mengsel, en 2.2 voor SVF-analyse. Aanzienlijk verrijkte Gene Ontology (GO) -termen met de belangrijkste hoofdcomponenten werden berekend met behulp van het GO-PCA-pakket [45].

Identificatie van differentieel tot expressie gebrachte genen voor elke cluster

Markergenen voor elk cluster werden geïdentificeerd op basis van een gegeneraliseerd lineair model. Voor de genen werd het verschil in afwijking tussen twee modellen, waarin het gen wel of niet differentieel tot expressie werd gebracht tussen twee clusters, berekend. Om ruis uit te filteren, werd pseudocount 1 toegevoegd aan de gemiddelde genexpressie in clusters en werden alleen genen met een vouwverandering van 2 of meer tussen twee clusters verder geanalyseerd. P waarden werden berekend als 1 cumulatieve dichtheidsfunctie van een chi-kwadraat continue willekeurige variabele voor verschil in afwijking. Na correcties voor meerdere testen werden genen met een FDR van minder dan 0,05 geïdentificeerd als differentieel tot expressie gebrachte genen voor het cluster. Voor vergelijking tussen differentieel tot expressie gebrachte genen geïdentificeerd door scRNA-seq-methoden en die geïdentificeerd door bulk-RNA-seq, werd deze pseudotelling niet toegevoegd.

Identificatie van variabele genen in hetzelfde celtype

Om genen te identificeren waarvan de expressie verandert afhankelijk van de fase van de celcyclus, gebruikten we de intensiteit van Hoechst 33.342 kleuring gemeten met een celsorteerder. Eerst werden cellen gediscretiseerd in 40 emmers van gelijke grootte op basis van de rangschikking van Hoechst 33.342 kleurintensiteit. Vervolgens werd de CV van de gemiddelde UMI-tellingen voor een gen in elke bak berekend. Na z-schaling hiervan werden genen met hoge z-scores geïdentificeerd. Om genen te identificeren waarvan de expressie fluctueert op een manier die geen verband houdt met de celcyclusfase, hebben we de CV van UMI-tellingen berekend voor een gen in elke cel en de CV van gemiddelde UMI-tellingen voor een gen in elke bak. Na z-schaling van dergelijke gegevens werden de genen waarvoor het verschil tussen twee geschaalde CV's groot was, geïdentificeerd als "variabele genen waarvan de expressie minder geassocieerd is met de celcyclusfase".

Verrijkingsanalyse op traject- en GO-termen

Pathways die bijzonder verrijkt waren voor de differentieel tot expressie gebrachte genen werden berekend met behulp van het ReactomePA-pakket van R Bioconductor (versie 1.14.4) [46] en Metascape (//metascape.org/) [47]. De afkapparameter voor de q-waarde was 0,05. Termen die waren verrijkt voor genen met zeer variabele expressie werden berekend met behulp van DAVID, de Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (versie 6.8) [48, 49]. Ontologie die voor de berekening werd gebruikt, was GOTERM_BP_FAT, GOTERM_MF_FAT en GOTERM_CC_FAT.De termen met FDR < 0,05 werden geïdentificeerd als verrijkte termen.

Kwantitatieve analyse voor externe RNA-moleculen

Om de ERCC-opname-efficiëntie te berekenen, hebben we de helling van de regressie tussen de input-ERCC-moleculen en gedetecteerde UMI-tellingen voor elke ERCC bepaald. We hebben onze berekening getest met behulp van de digitale expressiematrix (GSM1599501) van de inDrop eencellige sequentiemethode als controle, en hebben bevestigd dat onze berekende ERCC-opname-efficiëntie (7,2%) ongeveer overeenkwam met hun gerapporteerde ERCC-opname-efficiëntie (7,1%). Om het aantal kopieën van ERCC-spike-in-RNA te berekenen bij de detectiewaarschijnlijkheid van 50%, werd de methode van Svensson et al. werd gebruikt [50]. We hebben bevestigd dat onze berekende resultaten en die in het artikel van Svensson et al. waren ongeveer gelijk. Voor de berekening van de ERCC-capture-efficiëntie en het aantal kopieën van ERCC-spike-in-RNA bij de 50% detectiekans voor eerdere gegevens, hebben we de concentratie van ERCC-spike-in-RNA gebruikt, die werd gerapporteerd door de oorspronkelijke auteurs. Voor het artikel van Ziegenhain et al. [21], hebben we de concentratie bevestigd door persoonlijke communicatie.

Op simulatie gebaseerde vermogensanalyse

PowsimR werd gebruikt om vermogensanalyse uit te voeren [51]. De parameters van de negatieve binomiale verdeling, namelijk gemiddelde, spreiding en uitvalkans, werden geschat door de functie schattingParam met de volgende parameters: sigma = 1,96, distributie = "NB", RNAseq = "singlecell" en normalisatie = "scran ”. Om differentiële expressie tussen twee groepen te simuleren met behulp van deze parameters, wordt het aantal genen weergegeven door het aantal gedetecteerde genen (telling > 0) in elke methode. Differentieel tot expressie gebrachte genen zetten simulaties op met het aantal gedetecteerde genen, waarbij 23,6% genen differentieel tot expressie worden gebracht, log-fold veranderingsmonster uit een smalle gamma-verdeling (vorm 1.02, snelheid 0,78). Die parameter is afgeleid van parameterschattingen op basis van bulk-RNA-seq-gegevens van ES- en PE-cellen van muizen (N = 3). De functie simulatieDE werd gebruikt om vermogensanalyse uit te voeren met de volgende parameters: DEmethod = MAST en normalisatie = scran. De resultaten van vermogenssimulatie werden uitgezet met R met ggplot2-pakketten.


Bekijk de video: NUKLEOTIDA-DNA IPA KELAS IX (September 2022).


Opmerkingen:

  1. Emile

    Excuseer, dat ik u onderbreek, maar ik stel voor om nog een keer langs te gaan.

  2. Dace

    Dit bericht, is matchless))), het is interessant voor mij :)

  3. Ascot

    Ze zou het moeten vertellen - de fout.

  4. Knocks



Schrijf een bericht