Informatie

Probleem bij het begrijpen van Operon

Probleem bij het begrijpen van Operon


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Is er een goed boek dat operonen uitlegt: lac operon en trp operon in detail.

Ik las de werking van het trp-repressoreiwit uit 'Principles of genetics-by Snustard and Simmons', ze hebben vermeld dat de binding van het repressor-corepressorcomplex aan O$_t$$_r$$_p$ de transcriptie van de structurele genen. Maar ze leggen niet uit hoe.

Khan Academy zegt dat het repressor-corepressorcomplex fysiek in de weg staat van het RNA-polymerase. Ze hebben dit diagram hieronder gebruikt dat laat zien dat het grote RNA-polymerase niet kan binden aan de promotorplaats vanwege sterische hindering.

Ik ben op zoek naar een meer authentieke bron om precies te bestuderen hoe deze RNA-polymerase wordt verhinderd het DNA in beide operons te transcriberen.


Hoofdstuk 31 in het biochemieboek Voet en Voet (ik heb de 4e editie) link heeft een vrij uitgebreide uitleg over dit onderwerp. Het is nogal prijzig, maar je kunt een exemplaar van dit exemplaar vinden in bijna elke universiteitsbibliotheek. Het is over het algemeen een goede bron als je meer wilt weten over de DNA- of eiwitstructuur van een basisproces


10.3: Prokaryote genregulatie

Het DNA van prokaryoten is georganiseerd in een cirkelvormig chromosoom supercoiled in het nucleoïde gebied van het celcytoplasma. Eiwitten die nodig zijn voor een specifieke functie worden samen gecodeerd in blokken genaamd operons. Zo zijn alle genen die nodig zijn om lactose als energiebron te gebruiken naast elkaar gecodeerd in het lactose (of lac) operon.

In prokaryotische cellen zijn er drie soorten regulerende moleculen die de expressie van operons kunnen beïnvloeden: repressoren, activatoren en inductoren. onderdrukkers zijn eiwitten die de transcriptie van een gen onderdrukken als reactie op een externe stimulus, terwijl activatoren zijn eiwitten die de transcriptie van een gen verhogen als reactie op een externe stimulus. Eindelijk, inductoren zijn kleine moleculen die transcriptie activeren of onderdrukken, afhankelijk van de behoeften van de cel en de beschikbaarheid van substraat.

Begrijp de basisstappen in genregulatie in prokaryotische cellen

In bacteriën en archaea worden structurele eiwitten met verwante functies, zoals de genen die coderen voor de enzymen die de vele stappen in een enkele biochemische route katalyseren, gewoonlijk samen gecodeerd in het genoom in een blok dat een operon en worden samen getranscribeerd onder de controle van een enkele promotor. Dit vormt een polycistronisch transcript (Figuur 1). De promotor heeft dan gelijktijdige controle over de regulatie van de transcriptie van deze structurele genen, omdat ze ofwel allemaal tegelijk nodig zullen zijn, of geen ervan.

Figuur 1. In prokaryoten zijn structurele genen met een verwante functie vaak samen op het genoom georganiseerd en samen getranscribeerd onder de controle van een enkele promotor. De regelgevende regio van de operon omvat zowel de promotor als de operator. Als een repressor aan de operator bindt, worden de structurele genen niet getranscribeerd. Als alternatief kunnen activatoren binden aan het regulerende gebied, waardoor transcriptie wordt versterkt.

Franse wetenschappers François Jakob (1920&ndash2013) en Jacques Monod aan het Pasteur Instituut waren de eersten die de organisatie van bacteriële genen in operons lieten zien, door middel van hun studies over de lac operon van E coli. Dat vonden ze in E coli, alle structurele genen die coderen voor enzymen die nodig zijn om lactose als energiebron te gebruiken, liggen naast elkaar in de lactose (of lac) operon onder de controle van een enkele promotor, de lac promotor. Voor dit werk wonnen ze in 1965 de Nobelprijs voor de Fysiologie of Geneeskunde.

Elk operon bevat DNA-sequenties die de eigen transcriptie beïnvloeden. Deze bevinden zich in een gebied dat het regulerende gebied wordt genoemd. De regulerende regio omvat de promotor en de regio rond de promotor, waarnaar: transcriptiefactoren, eiwitten die worden gecodeerd door regulerende genen, kunnen binden. Transcriptiefactoren beïnvloeden de binding van RNA-polymerase naar de promotor en laat de progressie ervan structurele genen transcriberen. EEN repressor is een transcriptiefactor die de transcriptie van een gen onderdrukt als reactie op een externe stimulus door te binden aan een DNA-sequentie in het regulerende gebied genaamd de operator, die zich bevindt tussen de RNA-polymerase-bindingsplaats van de promotor en de transcriptionele startplaats van het eerste structurele gen. Repressorbinding blokkeert fysiek RNA-polymerase van het transcriberen van structurele genen. Omgekeerd, een activator is een transcriptiefactor die de transcriptie van een gen verhoogt als reactie op een externe stimulus door de binding van RNA-polymerase aan de promotor te vergemakkelijken. Een inductor, een derde type regulerend molecuul, is een klein molecuul dat transcriptie activeert of onderdrukt door interactie met een repressor of een activator.

Andere genen in prokaryotische cellen zijn voortdurend nodig. Deze genproducten zullen constitutief uitgedrukt, of continu ingeschakeld. De meeste constitutief tot expressie gebrachte genen zijn "huishoudelijke" genen die verantwoordelijk zijn voor het algehele onderhoud van een cel.

Wat zijn de onderdelen in de DNA-sequentie van een operon?

[oefengebied rijen=&rdquo2&Prime][/oefengebied]
[reveal-answer q=&rdquo665976&Prime]Antwoord weergeven[/reveal-answer]
[hidden-answer a=&rdquo665976&Prime]Een operon is samengesteld uit een promotor, een operator en de structurele genen. Ze moeten in die volgorde voorkomen.

Welke soorten regulerende moleculen zijn er?

[oefengebied rijen=&rdquo2&Prime][/oefengebied]
[reveal-answer q=&rdquo665979&Prime]Antwoord weergeven[/reveal-answer]
[hidden-answer a=&rdquo665979&Prime]Er zijn drie soorten regulerende moleculen: repressoren, activatoren en inductoren.[/hidden-answer]


[Het vestigingsproces van het lac-operonmodel en de analyse van verschillende leerproblemen]

Genstructuur en expressieregulatiemechanisme zijn de onderzoekshotspots en focus van moderne life sciences. Het lac-operon is een cluster van genen waardoor Escherichia coli lactose kataboliseert. Het werd voor het eerst voorgesteld door F. Jacob en J. Monod, die in 1965 ook de Nobelprijs voor fysiologie of geneeskunde kregen voor hun bijdragen. Daarna is het lac-operon het klassieke leervoorbeeld geworden van het genregulatiemechanisme in de microbiologie, genetica en moleculaire biologie, en werd het zeer gewaardeerd door zowel docenten als studenten. Hoewel de conclusie gemakkelijk te volgen en uit het hoofd te leren is, hebben de rijke connotatie en esoterische redenering het moeilijk gemaakt om te begrijpen, en evenmin is het gemakkelijk voor leraren om de voordelen van deze leercase volledig te benutten. Daarom is het noodzakelijk om een ​​diepgaand begrip te hebben van de genetische structuur en het werkingsprincipe van het lac-operon, met name de wetenschappelijke achtergrond en het denkproces waardoor wetenschappers deze mysteries hebben onthuld. In dit artikel werd het historische ontdekkings- en analyseproces van het E. coli lac-operon beoordeeld door hun voetafdrukken te volgen en te luisteren naar hun analyse van experimentele resultaten. Op basis van de DNA-sequenties werden ook de redenen voor verschillende ongebruikelijke verschijnselen van lac-operonexpressie besproken om de leerwaarde van de klassieke gevallen in de genetica en moleculaire biologie te illustreren.


Regulatie van genexpressie in prokaryoten (met diagram)

Alle activiteiten van een organisme worden gecontroleerd door genen. De meeste genen van een organisme drukken zich uit door eiwitten te produceren. De genen die eiwitten produceren, worden structurele genen of cistrons genoemd. Elke cel van een organisme bezit alle genen. Maar ze zijn niet altijd functioneel. Als alle genen de hele tijd functioneren, zal enzymatische chaos heersen en zal er niet veel celdifferentiatie zijn.

De producten van veel genen worden slechts af en toe door de cel nodig. Daarom worden die eiwitten alleen gesynthetiseerd wanneer het substraat waarop ze werken aanwezig is of wanneer ze door de cel nodig zijn. In sterk gedifferentieerde cellen van eukaryoten zijn slechts enkele genen functioneel en zijn alle andere genen permanent uitgeschakeld. Zelfs een kleine E. coli-bacterie brengt slechts enkele van zijn genen op een bepaald moment tot expressie van de in totaal ongeveer drieduizend genen.

In de cel bestaan ​​verschillende mechanismen die de expressie van genen controleren en reguleren. Het regelsysteem zet de genen aan als het nodig is en zet het weer uit als het niet nodig is. Dit bewijst dat genactiviteit gereguleerd kan worden.

Er zijn verschillende stadia waarin de expressie van een gen kan worden gereguleerd, maar de meest voorkomende is de initiatie van transcriptie. Hier vindt het grootste deel van de genregulatie plaats. Andere niveaus van genregulatie zijn transcriptionele verlenging, mRNA-verwerking tijdens translatie en post-translatiestadium.

Genregulatie in prokaryoten:

Bij bacteriën wordt de expressie van genen gecontroleerd door extracellulaire signalen die vaak aanwezig zijn in het medium waarin bacteriën worden gekweekt. Deze signalen worden door regulerende eiwitten naar de genen gedragen. Regulerende eiwitten zijn van twee soorten. Het zijn positieve regulatoren die activatoren worden genoemd en negatieve regulatoren die repressoren worden genoemd. Deze activatoren en repressoren zijn DNA-bindende eiwitten.

Negatieve regulatoren of repressoren:

Het repressor- of remmer-eiwit bindt aan de doelplaats (operator) op DNA. Deze blokkeren de binding van het RNA-polymerase-enzym aan de promotor, waardoor de transcriptie wordt voorkomen. De repressor bindt aan de plaats waar het het polymerase-enzym overlapt. Zo wordt de activiteit van de genen uitgeschakeld. Het wordt een negatief controlemechanisme genoemd.

Een anti-repressor of anti-remmer genaamd inductor is nodig om de repressor te inactiveren en daardoor de genen te activeren. Zo worden de genen aangezet. Dit wordt aangetoond door lactose-operon.

Positieve regulatoren of activatoren:

Om de transcriptie door de promotor te activeren, helpt de activator het polymerase-enzym te binden aan de promotor.

Genen onder een positief controlemechanisme komen alleen tot expressie wanneer een activator of stimulator of actieve regulator aanwezig is.

Operon:

In bacteriën, cistrons of structurele genen, zijn producerende enzymen van een metabolische route georganiseerd in een cluster waarvan de functies gerelateerd zijn. Polycistronische genen van prokaryoten vormen samen met hun regulerende genen een systeem dat operon wordt genoemd. Operon is een eenheid van expressie en regulatie.

1. Lactose Operon of Lac Operon:

Dit is een negatief controlemechanisme. In 1961 stelden Francois Jacob en Jacques Monod een operonmodel voor voor de regulatie van genexpressie in E. coli. De synthese van het enzym (3-galactosidase is in detail bestudeerd. Dit enzym zorgt voor de afbraak van lactose in glucose en galactose.

Bij afwezigheid van lactose is β-galactosidase in verwaarloosbare hoeveelheden aanwezig. Zodra lactose van buitenaf wordt toegevoegd, neemt de productie van β-galactosidase duizend keer toe. Zodra de lactose binnen is, daalt de productie van het enzym weer. De enzymen waarvan de productie kan worden verhoogd door de aanwezigheid van het substraat waarop het inwerkt, worden induceerbare enzymen genoemd.

Toevoeging van lactose aan het kweekmedium van E. coli induceert de vorming van drie enzymen (5-galactosidase, permease en transacetylase, die lactose afbreken tot glucose en galactose. De genen die coderen voor deze enzymen liggen in een cluster en worden cistrons genoemd. of structurele genen. Ze worden gelijktijdig getranscribeerd in een enkele mRNA-keten, die codons heeft voor alle drie de enzymen. Het mRNA dat van veel genen wordt getranscribeerd, wordt polycistronisch genoemd. Het functioneren van structurele genen om mRNA te produceren wordt gecontroleerd door regulerende genen.

Er zijn drie structurele genen Z, Y en A, die coderen voor respectievelijk de enzymen p-galactosidase, lac-permease en transacetylase. Regulerende genen bestaan ​​uit Regulator I, Promoter P en een controlegen genaamd operatorgen O. Regulator I-gen produceert een eiwit dat repressor of remmer wordt genoemd. De repressor is actief en bindt zich aan het operatorgen O en schakelt deze “uit” en de transcriptie wordt gestopt.

Dit gebeurt omdat het RNA-polymerase-enzym dat aan de promotor bindt, dit niet kan doen omdat de bindingsplaats van RNA-polymerase en de bindingsplaats van de repressor op de operator elkaar overlappen. Vandaar dat in het negatieve controlemechanisme de actieve genen worden "uitgeschakeld" door het repressor-eiwit.

Wanneer de inductor (lactose) van buitenaf wordt aangevoerd, binden de inductoren aan de repressor. Bij het binnenkomen van de bacterie verandert de lactose in allolactase. Allolactose verandert de vorm van de repressor (conformatieveranderingen), waardoor deze inactief wordt en niet in staat is zich aan de operator te binden. De operator wordt gratis en is “Opgewonden” en dus begint de transcriptie.

Op deze manier maakt de aanwezigheid van de inductor de transcriptie van Lac-operon mogelijk, dat niet langer wordt geblokkeerd door het repressor-eiwit. De synthese van enzymen als reactie op de aanwezigheid van een specifiek substraat (lactose) wordt inductie genoemd. Het wordt ook wel de-repressie genoemd.

Het induceerbare systeem werkt in een katabole route. Bij afwezigheid van lactose hebben E. coli-cellen gemiddeld slechts drie moleculen P-galactosidase-enzym per cel. Binnen 2-3 minuten na inductie van lactose worden in elke cel 3000 moleculen P-galactosidase geproduceerd.

Het is ook een negatief controlesysteem, maar vormt een biosynthetische route. Het staat bekend als onderdrukbaar systeem. Het werkt volgens het principe dat wanneer het aminozuur tryptofaan aanwezig is, het niet nodig is om het tryptofaan-operon te activeren.

Repressor-eiwit wordt geactiveerd door de co-repressor (tryptofaan-het eindproduct) en bindt de operator om het uit te schakelen. Tryptofaan wordt in vijf stappen gesynthetiseerd, waarbij voor elke stap een bepaald enzym nodig is. De genen voor het coderen van deze enzymen liggen naast elkaar, genaamd trp E, trp D, trp C, trp B en trp A.

Tryptofaan operon codeert voor vijf enzymen die nodig zijn voor de synthese van aminozuur tryptofaan. In een onderdrukbaar systeem produceert het regulerende gen een repressor-eiwit, dat normaal inactief is en niet in staat is te binden aan operator op DNA. De repressor ondergaat bij zijn toetreding tot de co-repressor (in dit geval het eindproduct tryptofaan) conformationele veranderingen die hem activeren en hem in staat stellen zich aan de operator te binden. Dit voorkomt de binding van RNA-polymerase-enzym aan de promotor. Dit is tegengesteld aan de situatie van lac-operon waarbij de repressor op zichzelf actief is en de affiniteit voor de operator verliest wanneer hij aan de inductor wordt gebonden.

Hier reguleert de beschikbaarheid van tryptofaan, het eindproduct, de expressie van dit operon en onderdrukt de synthese van tryptofaan. Op deze manier wordt de synthese van enzymen van een metabole route gestopt door het eindproduct van de metabole keten. Dit mechanisme stelt de bacteriën in staat om enzymen alleen te synthetiseren wanneer ze nodig zijn. Dit staat bekend als feedbackrepressie.

Bij feedbackremming werkt het eindproduct van een metabole route als een allosterische remmer van het eerste enzym van de metabole keten.

Inductie en repressie besparen waardevolle energie door de synthese van onnodige enzymen te voorkomen.

Positieve controle van transcriptie:

Het systeem van regulering van lactose en tryptofaan operon is in wezen een negatieve controle in die zin dat het operon normaal gesproken op '8221' staat, maar op '8220uit' wordt gehouden door het regulerende eiwit. Met andere woorden, de structurele genen mogen niet tot expressie worden gebracht tenzij dit vereist is.

Katabole repressie:

Lac-operon vertoont ook positieve controle door katabole repressie. Dit is een extra controlesysteem dat de repressor-operator bindt. In E. coli wordt, in aanwezigheid van zowel glucose als lactose, eerst de glucose volledig benut en vervolgens wordt lactose opgenomen voor de productie van energie.

Glucose is de rijkste en efficiëntere energiebron. Glucose heeft een remmend effect op de expressie van lac-operon. Het mechanisme van positieve controle stelt E. coli in staat zich efficiënter aan te passen aan de veranderende omgeving van zijn natuurlijke habitat, de menselijke darm.

In aanwezigheid van glucose wordt de synthese van het -galactosidase-enzym onderdrukt. Het remmende effect van glucose is te wijten aan de duidelijke daling in het niveau van een nucleotide genaamd cyclisch AMP (c-AMP), dat de transcriptie van mRNA remt.

Lactose-operontranscriptie vereist niet alleen cyclisch AMP, maar ook een ander eiwit dat katabool activatoreiwit (CAP) wordt genoemd. De cAMP en CAP vormen een complex genaamd cAMP-CRP-complex, dat nodig is voor het functioneren van lactose-operon.

Een katabool afbraakproduct van glucose, glucose-kataboliet genaamd, voorkomt de activering van lac-operon door lactose. Dit effect wordt katabole repressie genoemd. Wanneer de glucoseconcentratie toeneemt, neemt de cAMP-concentratie af en vice versa. Een hoge concentratie cAMP is nodig voor de activering van lac-operon.

Normaal gesproken blijft het lactose-operon in aanwezigheid van glucose inactief.

Glucose-kataboliet voorkomt de vorming van cAMP-CRP-complex.

Op deze manier is het cAMP-CRP-systeem een ​​positieve controle omdat de expressie van lac-operon de aanwezigheid van een activerend signaal vereist, wat in dit geval het geval is in het cAMP-CRP-complex.

Er zijn enkele promotors op DNA waarbij RNA-polymerase de transcriptie niet kan initiëren zonder de aanwezigheid van enkele aanvullende eiwitfactoren zoals het cAMP-CRP-complex. Deze factoren zijn positieve regulatoren omdat hun aanwezigheid noodzakelijk is om de cistrons in te schakelen. Dit worden activatoren of stimulatoren genoemd.


A. Controlemechanismen van het Lac Operon

In het spijsverteringskanaal van dieren (inclusief het onze), genen van de E coli lac operon reguleren van het gebruik van lactose als alternatieve voedingsstof voor glucose. Denk aan kaas in plaats van chocolade! Het operon bestaat uit lacZ-, lacY- en lacA-genen die werden genoemd structurele genen. Per definitie coderen structurele genen voor eiwitten die deelnemen aan de celstructuur en metabolische functie. Zoals reeds opgemerkt, de lac operon wordt getranscribeerd in een mRNA dat codeert voor de Z-, Y- en A-eiwitten.

Laten we de structuur van het lac-operon en de functie van de Y-, Z- en A-eiwitten nader bekijken (hieronder).

Het lacZ-gen codeert voor &bèta-galactosidase, het enzym dat lactose (een disaccharide) afbreekt in galactose en glucose. Het lacY-gen codeert voor lactose doordringen, een membraaneiwit dat het binnendringen van lactose in de cellen vergemakkelijkt. De rol van het lacA-gen (a transacetylase) in het lactose-energiemetabolisme is niet goed begrepen. De ik gene links van het lac Z-gen is a regulerend gen (om het te onderscheiden van structurele genen). Regulerende genen coderen voor eiwitten die interageren met regulerende DNA-sequenties die zijn geassocieerd met een gen om transcriptie te regelen. De operator sequentie die de I- en Z-genen scheidt, is een transcriptieregulerende DNA-sequentie.

De E coli lac-operon is meestal stil (onderdrukt) omdat deze cellen de voorkeur geven aan glucose als energie- en koolstofbron. In aanwezigheid van voldoende glucose, a repressor eiwit (het I-genproduct) is gebonden aan de operator, waardoor de transcriptie van het lac-operon wordt geblokkeerd. Zelfs als lactose beschikbaar is, zullen cellen het niet gebruiken als alternatieve energie- en koolstofbron als de glucosespiegels voldoende zijn. Wanneer de glucosespiegels echter dalen, is het lac-operon actief en worden de drie enzymproducten vertaald. We zullen zien hoe beperkende glucosespiegels maximale lac-operontranscriptie door beide induceren derepressie en direct inductie, wat leidt tot maximale transcriptie van de lac-genen, alleen wanneer dat nodig is (d.w.z. in aanwezigheid van lactose en afwezigheid van glucose). Laten we eens kijken naar enkele van de klassieke experimenten die hebben geleid tot ons begrip van E. coli-genregulatie in het algemeen, en van het lac-operon in het bijzonder.

Eind jaren vijftig en begin jaren zestig bestudeerden Francois Jacob en Jacques Monod het gebruik van verschillende suikers als koolstofbronnen door E coli. Ze kenden dat wilde type E coli zou niet maken de (eta )-galactosidase, (eta )-galactoside permease of (eta )-galactoside transacetylase eiwitten wanneer gekweekt op glucose. Natuurlijk wisten ze ook dat de cellen zouden overschakelen op lactose voor groei en voortplanting als ze geen glucose zouden krijgen! Vervolgens zochten en isoleerden ze verschillende E. coli-mutanten die niet op lactose konden groeien, zelfs als er geen glucose in het groeimedium zat. Hier zijn enkele van de mutanten die ze hebben bestudeerd:

  1. Eén mutant kon geen actief (eta )-galactosidase-enzym maken, maar maakte wel permease aan.
  2. Eén mutant kon geen actief permease maken, maar maakte normale hoeveelheden (eta )-galactosidase aan.
  3. Een andere mutant slaagde er niet in om transacetylase te maken. maar kan lactose nog steeds metaboliseren in afwezigheid van glucose. Vandaar de onzekerheid van zijn rol in het lactosemetabolisme.
  4. Vreemd genoeg kon één gemuteerde stam geen van de drie enzymen maken!

Omdat dubbele mutanten zeer zeldzaam zijn en drievoudige mutanten nog zeldzamer, concludeerden Jacob en Monod dat de activering van alle drie de genen in de aanwezigheid van lactose op de een of andere manier samen werd gecontroleerd. In feite was het deze ontdekking die het operon definieerde als een reeks genen die werden getranscribeerd als een enkel mRNA, waarvan de expressie daarom effectief kon worden gecoördineerd. Ze karakteriseerden later het repressoreiwit dat door het lacI-gen wordt geproduceerd. Jacob, Monod en Andre Lwoff kregen in 1965 de Nobelprijs voor de geneeskunde voor hun werk aan bacteriële genregulatie. Dat weten we nu negatief en positief regulering van de lac operon (hieronder beschreven) zijn afhankelijk van twee regulerende eiwitten die samen de snelheid van het lactosemetabolisme regelen.

1. Negatieve regulatie van het Lac Operon door Lactose

Raadpleeg de onderstaande afbeelding om de spelers in lac-operonderepressie te identificeren.

Het repressoreiwitproduct van het I-gen wordt altijd gemaakt en aanwezig in E coli cellen. Ik genexpressie is niet gereguleerd! Bij afwezigheid van lactose in het groeimedium bindt het repressoreiwit stevig aan het operator-DNA. Terwijl RNA-polymerase is gebonden aan de promotor en klaar om het operon te transcriberen, de aanwezigheid van de repressor gebonden aan de operatorsequentie dicht bij het Z-gen blokkeert fysiek de voorwaartse beweging ervan. Onder deze omstandigheden wordt er weinig of geen transcriptie gemaakt. Als cellen worden gekweekt in aanwezigheid van lactose, wordt de lactose die de cellen binnenkomt omgezet in allolactose. Allolactose bindt aan de repressor die op het DNA van de operator zit om een ​​2-delig complex te vormen, zoals hieronder weergegeven.

De allosterisch veranderde repressor dissocieert van de operator en RNA-polymerase kan de . transcriberen lac operon-genen zoals hieronder geïllustreerd:

2. Positieve regulatie van de Lac Operon-inductie door katabolietactivering

Het tweede controlemechanisme dat de expressie van lac-operon reguleert, wordt gemedieerd door CAP (cAMP-gebonden) kataboliet activator eiwit of cAMP-receptoreiwit). Wanneer glucose beschikbaar is, zijn de cellulaire niveaus van cAMP laag in de cellen en bevindt CAP zich in een inactieve conformatie. Aan de andere kant, als de glucosespiegels laag zijn, stijgen de cAMP-spiegels en binden ze aan het CAP, waardoor het wordt geactiveerd. Als de lactosegehaltes ook laag zijn, heeft de cAMP-gebonden CAP geen effect. Als lactose aanwezig is en de glucosespiegels laag zijn, bindt allolactose de lac-repressor waardoor deze zich losmaakt van het operatorgebied. Onder deze omstandigheden kan het cAMP-gebonden CAP aan de operator binden in plaats van het repressoreiwit. In dit geval, in plaats van het RNA-polymerase te blokkeren, induceert het geactiveerde Camp-gebonden CAP een nog efficiëntere transcriptie van lac-operon. Het resultaat is de synthese van hogere niveaus van lac-enzymen die een efficiënt cellulair gebruik van lactose mogelijk maken als alternatief voor glucose als energiebron. maximaal activering van het lac-operon in hoge lactose en lage glucose wordt hieronder weergegeven.

cAMP-gebonden CAP is een inductor van transcriptie. Het doet dit door het DNA in het promotor-operatorgebied te dwingen te buigen. En aangezien het buigen van de dubbele helix de H-bindingen losmaakt, wordt het voor RNA-polymerase gemakkelijker om de promotor op de te transcriberen DNA-streng te vinden en te binden, en om de transcriptie te laten beginnen. Door cAMP CAP geïnduceerde buiging van DNA wordt hieronder geïllustreerd.

3. Lac Operon-regulering door uitsluiting van inductoren en meerdere operators

In de afgelopen jaren zijn extra lagen van lac-operonregulatie blootgelegd. In één geval is het vermogen van lac permease om lactose door het celmembraan te transporteren wordt gereguleerd. In een andere is ontdekt dat aanvullende operatorsequenties een interactie aangaan met een multimere repressor om lac-genexpressie te regelen.

A) Regulering van het gebruik van lactose door uitsluiting van inductoren

Wanneer de glucosespiegels hoog zijn (zelfs in aanwezigheid van lactose), wordt fosfaat verbruikt om glycolytische tussenproducten te fosforyleren, waardoor de cytoplasmatische fosfaatspiegels laag blijven. Onder deze omstandigheden bindt ongefosforyleerd EIIAGlc aan de lactose permease enzym in het celmembraan, waardoor het geen lactose in de cel kan brengen.

De rol van gefosforyleerde en niet-gefosforyleerde EIIA Glc bij het reguleren van het lac-operon wordt hieronder getoond.

Hoge glucosespiegels blokkeren het binnendringen van lactose in de cellen, waardoor de vorming van allolactose en de onderdrukking van het lac-operon effectief wordt voorkomen. Uitsluiting van inductoren is dus een logische manier voor de cellen om een ​​overvloed aan glucose te verwerken, ongeacht of lactose aanwezig is of niet. Aan de andere kant, als glucosespiegels laag zijn in het groeimedium, stijgen de fosfaatconcentraties in de cellen voldoende voor een specifiek kinase om de EIIAGlc te fosforyleren. Gefosforyleerd EIIAGlc ondergaat dan een allosterische verandering en dissocieert van het lactosepermease, waardoor het actief wordt zodat meer lactose de cel kan binnendringen. Met andere woorden, de inductor is onder deze omstandigheden niet &ldquo uitgesloten&rdquo!

Het kinase dat EIIA Glc fosforyleert, maakt deel uit van een fosfoenolpyruvaat (PEP)- afhankelijk fosfotransferase systeem (PTS) cascade. Wanneer de extracellulaire glucosespiegels laag zijn, activeert de cel het PTS-systeem in een poging om de glucose die zich in de cel bevindt te brengen. Maar het laatste enzym in de PTS-fosforyleringscascade is het kinase dat EIIA Glc fosforyleert. Gefosforyleerd EIIA Glc dissocieert van het lactosepermease, activeert het en brengt beschikbare lactose in de cel vanuit het medium.

B) Repressor-eiwitstructuur en aanvullende operatorsequenties

De lac-repressor is een tetrameer van identieke subeenheden (hieronder).

Elke subeenheid bevat een helix-draai-helix motief dat aan DNA kan binden. De operator-DNA-sequentie stroomafwaarts van de promotor in het operon bestaat echter uit een paar omgekeerde herhalingen zodanig uit elkaar geplaatst dat ze slechts twee van de repressor-subeenheden kunnen interageren, waardoor de functie van de andere twee subeenheden onbekend blijft & hellip dat wil zeggen, tot voor kort!

Onlangs werden nog twee operatorregio's gekarakteriseerd in het lac-operon. Een, genaamd O2, is binnen de lac z-gen zichzelf en de ander, genaamd O3, ligt aan het einde van, maar binnen de lac ik gen. Afgezien van hun ongebruikelijke locatie binnen werkelijke genen, werden deze operators, die een interactie aangaan met de resterende twee repressor-subeenheden, aanvankelijk onopgemerkt omdat mutaties in de O2- of de O3-regio afzonderlijk niet substantieel bijdragen aan het effect van lactose bij het onderdrukken van het lac-operon. Alleen het muteren van beide regio's tegelijkertijd resulteert in een aanzienlijke vermindering van de binding van de repressor aan het operon.

B. Controlemechanisme van het tryptofaanoperon

Als voldoende tryptofaan (trp) beschikbaar is, kan de tryptofaansyntheseroute op twee manieren worden geremd. Bedenk eerst hoe feedbackremming door overmaat trp allosterisch de trp-syntheseroute kan remmen. Een snelle reactie treedt op wanneer tryptofaan in overmaat aanwezig is, wat resulteert in een snelle remming van de feedback door het blokkeren van de eerste van vijf enzymen in de trp-syntheseroute. De trp operon codeert voor polypeptiden die twee van deze enzymen vormen.

Enzym 1 is een multimeer eiwit, gemaakt van polypeptiden die worden gecodeerd door de trp5 en trp4 genen. De trp1- en trp2-genproducten vormen samen Enzym 3. Als de cellulaire tryptofaanspiegels dalen omdat het aminozuur snel wordt geconsumeerd (bijvoorbeeld vanwege de vraag naar eiwitten tijdens snelle groei), zullen E. coli-cellen het aminozuur blijven synthetiseren, zoals hieronder geïllustreerd.

Aan de andere kant, als de tryptofaanconsumptie vertraagt, hoopt tryptofaan zich op in het cytoplasma. Overtollig tryptofaan zal binden aan de trp-repressor. De trp-gebonden repressor bindt vervolgens aan de trp-operator, waardoor RNA-polymerase het operon niet kan transcriberen. De onderdrukking van het trp-operon door trp wordt hieronder weergegeven.

In dit scenario is tryptofaan een co-repressor. De functie van een co-repressor is om te binden aan een repressor-eiwit en de conformatie ervan te veranderen zodat het aan de operator kan binden.


Jacob, Monod, de Lac Operon en het PaJaMa-experiment - genexpressiecircuits veranderen het gezicht van kankeronderzoek

Bezoek de Kankeronderzoek 75 jarig jubileum tijdlijn.

Zie gerelateerd artikel van Pitot en Heidelberger, Cancer Res 196323: 1694–700.

Het is een vrijwel universele regel in de wetenschap dat als we een stap terug doen om na te denken over een veld dat momenteel als extreem dynamisch en nieuw wordt beschouwd, we merken dat we op de schouders staan ​​van degenen wiens baanbrekende observaties het veel eerder hebben voortgebracht. Voor degenen onder ons die werkzaam zijn op het gebied van signaaltransductie en epigenetica binnen de arena van kankeronderzoek, is dit absoluut het geval als we kijken naar de briljante realisaties van Jacob en Monod dat regulerende netwerken genexpressie in bacteriën regelen (1-5). Hun erkenning dat expressie van een enkel gen kan worden onderdrukt door een ander gen voor reactie op regulerende signalen uit de omgeving, behoort tot de top, en nu meest onderzochte, gebieden van de biologie in het algemeen en kankerbiologie. Een recensie in Kankeronderzoek in 1961 door Pitot en Heidelberger brengt niet alleen hulde aan dit cruciale werk van Jacob en Monod, maar met de vooruitziende bedoeling om te voorspellen hoe de concepten kunnen worden verweven in ons begrip van carcinogenese (6). Om te zeggen dat hun voorspellingen juist waren, zou een understatement zijn, zoals duidelijk blijkt uit het huidige huwelijk tussen de verkenning van de regulatie van genexpressie en onze huidige inspanningen om de basismechanismen te ontleden die ten grondslag liggen aan de oorsprong, het begin en de progressie van kanker. Het wordt ook duidelijk dat de studies van Jacob en Monod, en hun implicaties, zoals gevisualiseerd door Pitot en Heidelberger, hielpen een biologie in te luiden die onze huidige zoektocht ondersteunt om nieuwe strategieën te ontwikkelen voor het verbeteren van de behandeling van kanker. Vandaar de selectie van de recensie van Pitot en Heidelberger voor opname in de huidige viering van 75 jaar publiceren in Kankeronderzoek.

De onthullingen van Jacob en Monod begonnen, zoals veel grote verhalen in de wetenschap, met een reeks openbaringen van de jongere onderzoeker, Jacob, die hij in gesprekken bracht met de meer gevestigde wetenschapper, Monod. Ze volgden hun uiteindelijke gezamenlijke opwinding over de mogelijkheden die werden geboden met een reeks experimenten, uitgevoerd van 1958 tot 1961 aan het Pasteur Instituut in Parijs. Deze resulteerden in het schetsen van een model voor genregulatie, dat vandaag de dag als een kernparadigma overleeft. Hun observaties vestigden het principe dat om de reactie van een organisme op veranderende omgevingsomstandigheden goed te reguleren, in specifieke bacteriën voor hun experimenten, een gencircuit bestaat waarin één genproduct de controle over een ander gen regelt. Het resultaat is een verandering in cellulair fenotype voor cellulair metabolisme (2-5). Voortbouwend op experimenten om aan te tonen dat lambda-faaggenen zowel kunnen worden geïnduceerd als onderdrukt in bacteriën, hebben de onderzoekers vastgesteld dat veranderingen in de behoefte aan lactosegebruik leiden tot negatieve regulatie van β-galactosidase (2-5). De schakelingen voor deze schakelaar vormden wat nu bekend staat als het lac-operon (1-5). De studies maakten gebruik van het paringssysteem dat in bacteriën wordt gebruikt, waarbij het chromosomale materiaal van het mannetje geleidelijk in het vrouwtje wordt geïnjecteerd, waardoor het genetisch materiaal geleidelijk met zich meedraagt. Hierdoor konden onderzoekers mannelijke genen in kaart brengen op chromosoompositie, aangezien hun binnenkomst genexpressiegebeurtenissen bij de vrouw vergemakkelijkte. Om de seksuele connotaties voor de literatuur af te zwakken, werd de baanbrekende studie van Jacob en Monod, met deelname van Arthur Pardee, voor het eerst gepubliceerd als een voorlopig rapport in 1958, waar het het "PaJaMa" -experiment werd genoemd (1, 3, 5). In deze studie konden de onderzoekers aantonen dat een gen lacl gecodeerd een trans-acting repressor voor de lac gen. In dit concept wordt de activiteit van het regulatorgen geïnduceerd wanneer het repressoreiwit in het cytoplasma wordt geïnduceerd door een product met een klein molecuulgewicht dat wordt gegenereerd door het doelenzym. Dit schakelparadigma draagt ​​robuust bij aan mechanismen voor remming van padfeedback.

De aard van de trans-werkende moleculen waardoor het repressieve proces wordt gemedieerd, moest nog worden bepaald met veel discussies over de vraag of directe DNA-DNA-interacties, RNA, eiwitten, enz. Deze rol zouden spelen. Deze daaropvolgende discussies, gehouden op de belangrijkste bijeenkomsten die werden bijgewoond door vele beroemdheden in het embryonale veld van de moleculaire biologie, worden gecrediteerd als leidend tot de ontdekking van mRNA, zoals uiteengezet in een recensie door Alexander Gann (3). Hierin wordt een lunch beschreven in de kamers van Sydney Brenner in King's College op Goede Vrijdag, nu zo'n 55 jaar geleden, bijgewoond door Jacob, Brenner, Francis Crick, Alan Garen en anderen waar "plotseling die middag duidelijk werd - eerst voor Brenner en Crick , en vervolgens aan de anderen die aanwezig waren - dat het PaJaMa-experiment een onstabiel tussenproduct in genexpressie voorspelde", waarvan werd geconcludeerd dat het RNA was. Dit suggereerde de aanwezigen dat de bemiddelaar voor de repressoractie mogelijk "echt op genetisch niveau handelde en de productie van het onstabiele mRNA controleerde. Deze discussie, die die avond op een feestje bij Crick's huis werd voortgezet, leidde direct tot het experiment van Brenner en Jacob, die die zomer samen met Matt Meselson van Caltech het bestaan ​​van mRNA aantoonden. Afzonderlijk kwamen Jim Watson, Wally Gilbert en Francois Gros op verschillende manieren op Harvard tot een vergelijkbaar resultaat” (3). De komende jaren in ons huidige biologietijdperk hebben onthuld dat alle hypothesen die zijn afgeleid van de eerste bevindingen van Jacob en Monod relevant waren en een voorbode waren van de bevindingen over het aantal verschillende manieren waarop dergelijke transacties moleculair kunnen worden gemedieerd.

In decennia volgend op de bovenstaande waarnemingen luidde het paradigma van het lac-operon en zijn samenstellende repressor binding aan een operator en inductor een tijdperk in, dat vandaag de dag steeds groter wordt, voor ons begrip van cellulaire controle door middel van signaaltransductiecircuits en de concepten belichaamd voor erfelijkheid van resulterende genexpressieveranderingen vastgesteld door epigenetische mechanismen (2-4, 7). Er is terecht gesteld dat "weinig eiwitten zo'n sterke invloed hebben gehad op een veld als de lac-repressor in Molecular Biology" (2). Als we terugkijken, is het moeilijk voor te stellen in welke mate het werk van Jacob en Monod een kennisbasis zou worden om op voort te bouwen bij het ophelderen van de enorme reeks mechanismen die door cellen worden gebruikt om omgevingsfactoren te interpreteren in processen variërend van ontwikkeling tot die van volwassen celvernieuwende systemen die worden uitgedaagd door een groot aantal normale en abnormale stimuli. Een duizelingwekkend portfolio van cellulaire machines om deze processen te implementeren, blijft zich ontrafelen in wat we nu elke dag onderzoeken als activering van en erfelijke overdracht van informatie van celsignaleringsroutes. Deze omvatten schakelaars in patronen van genexpressie en de celkerngebeurtenissen die deze gengebeurtenissen fixeren, inclusief lusvorming tussen DNA-regio's voor controle door genversterkers van promotors, de rollen van niet-coderende RNA's zoals lang-niet-coderende en miRNA's, en de rollen van DNA methylatie, chromatine en nucleosoompositionering in erfelijke vergrendeling in genexpressieveranderingen, die allemaal kunnen bijdragen aan het creëren van nieuwe cellulaire fenotypes (8). Men kan dit inderdaad zien als de uitbreiding en definitie van mechanismen voor de typen gencircuits die zijn voorgesteld en gedocumenteerd door Jacob en Monod.

Met de bovenstaande achtergrond in gedachten is het opmerkelijk hoe snel en met zo'n vooruitziendheid Pitot en Heidelberger de concepten naar voren brachten die in hun 1961 Kankeronderzoek recensie (6). Ze veronderstelden dat componenten van de door Jacob en Monod geschetste systemen zouden kunnen worden getransponeerd naar een concept van geïnduceerde fenotypes die erfelijk worden bestendigd en gehandhaafd voor cellulaire reacties op korte, voorbijgaande blootstelling aan kankerverwekkende stoffen (6). Ze theoretiseerden dat lopende experimenten op het gebied van carcinogenese suggereerden dat deze bovenstaande interacties mogelijk het ontstaan ​​van een kwaadaardige cel mogelijk zouden maken zonder de deelname van genetische (DNA) veranderingen zoals genmutaties. Cruciaal voor dit voorstel was dat ze een mogelijke staat van "reversie" voor ogen hadden die het mogelijk zou kunnen maken om het kwaadaardige fenotype terug te brengen naar de niet-kwaadaardige staat (6).Deze concepten liggen na aan het hart van onderzoekers die voortdurend op zoek zijn naar het schetsen van de precieze rol van epigenetische veranderingen in de initiatie en progressie van kanker en de mogelijkheid dat het richten op dergelijke veranderingen, en/of wat ze controleert, kan zorgen voor krachtige strategieën voor kankerbeheer (9, 10). Ze verweven scherpzinnig de concepten van Jacob en Monod tot een mogelijk alternatief voor de toen heersende doctrine dat "kanker het gevolg kan zijn van een directe interactie van carcinogeen met genetisch materiaal" - een theorie die volgens hen was ontwikkeld door "door velen geaccepteerd te worden als het mechanisme van carcinogenese op basis van theoretische eenvoud in plaats van wetenschappelijke gegevens.” Als alternatief hebben Pitot en Heidelberger overwogen, en diepgaand gemodelleerd, hoe de bevindingen van Jacob en Monod zouden kunnen leiden tot de mogelijkheid dat "een cytoplasmatische interactie van een carcinogeen en een doeleiwit zou kunnen leiden tot een permanent veranderde en stabiele metabolische situatie zonder de noodzaak van elke directe interactie van het kankerverwekkende en genetisch materiaal” (6). Een cruciaal kenmerk van hun hypothese was dat "onder de juiste omstandigheden en voordat chromosomale veranderingen plaatsvonden, het proces zou kunnen worden omgekeerd en leiden tot de productie van een normaal uit een tumorcel."

In hun voorstel stelden ze, via een reeks gepresenteerde complexe modellen, meerdere scenario's en verschillende variaties van biochemische en genetische thema's voor die hun voorgestelde interacties zouden kunnen bemiddelen, en kwamen tot de volgende voorspelling: dat een kankerverwekkende stof kan binden aan en interfereren met de repressor van een groeiproces, waardoor de functie van de repressor effectief teniet wordt gedaan door een proces van 'cytoplasmatische overerving'. Deze interferentie is dus niet afhankelijk van de voortdurende aanwezigheid van het carcinogeen in dochtercellen terwijl ze zich delen (6). Het is duidelijk dat we deze dynamiek in het moderne spraakgebruik visualiseren terwijl ze door het cytoplasma naar de kern gaan via een reeks signaaltransductiegebeurtenissen die vervolgens abnormaal worden gefixeerd door epigenetische processen met DNA-methylatie, chromatine en veranderingen in nucleosoompositie (8-10). Dit suggereert duidelijk een grote rol van epigenetische afwijkingen vroeg tijdens het begin van kanker en deze mogelijkheid is het onderwerp van veel onderzoeken vandaag (9, 10). In dit opzicht formuleren Pitot en Heidelberger wijselijk verschillende belangrijke regels en waarschuwingen die inherent zijn aan hun voorgestelde mechanismen en deze wijsheid verrijkt hun voorspellingen zoals ze zich vandaag voordoen. Ten eerste benadrukken ze dat “het de lezer duidelijk moet zijn dat we hier alleen te maken hebben met de vroegste veranderingen in de carcinogenese. Zodra de gewijzigde regulatie is vastgesteld (mogelijk binnen minuten of uren), treden andere effecten op, zoals aneuploïdie, verhoogde glycolyse, schijnbaar meerdere enzymdeleties, enz., Die waarschijnlijk secundair zijn aan de primaire veranderingen” (6). Ten tweede: “Het is niet onze bedoeling om de mogelijkheid uit te sluiten of te ontkennen dat chemische carcinogenese een gevolg is van de directe interactie van de verbinding met genetisch materiaal. Het is veeleer ons doel om de aandacht te vestigen op alternatieve verklaringen, gebaseerd op de huidige concepten van metabole regulatie en controle, die de voortzetting van metabolische veranderingen mogelijk maken die worden veroorzaakt door de tijdelijke interactie van het carcinogeen en een cytoplasmatisch eiwit” (6). Ten slotte concluderen ze dat "door de toepassing van deze of vergelijkbare theoretische modellen het mogelijk is om de grote hoeveelheid degelijke experimentele gegevens over chemische carcinogenese te verzoenen met de huidige concepten van metabole regulatie, en vroege kanker zou kunnen worden beschouwd als een fenotypisch in plaats van een genotypische ziekte” (6).

Bij het beoordelen van het werk van Jacob en Monod geeft John Beckwith (5) een prachtig gevoel dat ook zou kunnen dienen als een coda voor het ingenieuze samengaan van Pitot en Heidelberger van het lac-operonverhaal met het veld van menselijke carcinogenese - "nieuwe theorieën die succesvolle paradigma's voor hun vakgebied, althans in hun oorspronkelijke vorm, bieden geen juiste verklaring voor alle verschijnselen die voor dat vakgebied belangrijk worden geacht.” En toch, zoals hier geïmpliceerd, beletten aanvankelijke gebreken in dergelijke theorieën niet dat ze nooit worden gescheiden van het geheel van onschatbaar werk dat ze helpen voortbrengen. Ons begrip van gentranscriptie is de drijvende kracht achter vrijwel elk aspect van de basale en translationele tumorbiologie, wat ons opnieuw herinnert aan onze rit op de schouders van degenen die eraan voorafgingen. De publicatie van Pitot en Heidelberger staat dan ook symbool voor waarom we 75 jaar publiceren in Kankeronderzoek.


Discussie

In deze studie vonden we dat genexpressie lineair toeneemt met de afstand van het begin van een gen tot het einde van het operon (transcriptieafstand). Deze relatie werd waargenomen in meerdere sets operons van verschillende lengtes, op verschillende genposities in meerdere operons, met meerdere coderende sequenties en met verschillende 5'-UTR-sequenties. Bovendien was de relatieve toename in translatie per nucleotide van transcriptieafstand (d.w.z. de translatiecoëfficiënt) vergelijkbaar tussen de verschillende experimenten en operons. Samen bieden deze bevindingen overtuigende ondersteuning voor een verband tussen genexpressie en de transcriptieafstand en duiden ze op een gemeenschappelijk mechanisme.

We hebben een algemeen model voorgesteld dat aantoont dat genen met langere transcriptieafstanden een verhoogde expressie hebben omdat ze een langere periode hebben voor translatie tijdens transcriptie. Er zijn drie punten ter ondersteuning van het model. Ten eerste voorspelt het correct uit de eerste principes dat de relatie tussen genexpressie en de transcriptieafstand lineair is. Ten tweede bleek het vergroten van de transcriptieafstand de translatie te verhogen zoals voorspeld. Ten derde biedt het een enkele verklaring waarom variërende operonlengte en variërende genpositie hetzelfde effect hebben op genexpressie (d.w.z. dezelfde translatiecoëfficiënt).

De meest intrigerende voorspelling van het model is dat de productiesnelheid van eiwitten tijdens transcriptie (β1) zesvoudig groter is dan na mRNA-afgifte (β2). Dit resultaat betekent dat het verlengen van de transcriptietijd met 24 s (als gevolg van een toename van de transcriptieafstand van 1 kb) een equivalent effect op de expressie heeft als het verlengen van de mRNA-levensduur met 144 s. Het verschil in transcriptionele en posttranscriptionele eiwitproductiesnelheden kan te wijten zijn aan lokale verschillen in ribosoomconcentraties en/of aan een andere mRNA-structuur tijdens transcriptie (15). Ter ondersteuning van het eerste is aangetoond dat ribosomen bij voorkeur gelokaliseerd zijn op plaatsen van actieve transcriptie in Bacillus subtilus (16) en er is steeds meer bewijs dat ruimtelijke lokalisatie belangrijk is voor bacteriële translatie (17, 18). Beide mechanismen zouden de initiatie van translatie verhogen.

De transcriptieafstand had een meetbare invloed op de expressie in een grote verscheidenheid aan operons en er zijn aanwijzingen voor een verband tussen genexpressie en transcriptieafstand in sommige natieve operons (19, 20). Daarom, hoewel de transcriptieafstand slechts een matig effect heeft op genexpressie, mag de rol ervan niet worden genegeerd. Bovendien is het veranderen van genexpressie door het variëren van de transcriptieafstand fundamenteel verschillend van het veranderen van de RBS (21) of de transcriptiesnelheid (22, 23). Bijgevolg kan het unieke effecten hebben op genruis en voor het coördineren van expressie van meerdere genen. Bovendien heeft het variëren van de transcriptieafstand een voorspelbaar effect op genexpressie en dit zou kunnen worden benut om patronen en niveaus van genexpressie in synthetische en natieve operons af te stemmen (24). Het zou met name kunnen worden gebruikt om de genvolgorde in operons te optimaliseren om de output van een route (25) te verhogen en om specifieke stoichiometrieën voor eiwitcomplexen te genereren.

Concluderend laten we zien dat operon-organisatie niveaus en patronen van genexpressie kan moduleren. Het was bekend dat de proximale genen in een operon de expressie van distale genen (bijvoorbeeld polaire mutaties) kunnen beïnvloeden. Hier hebben we aangetoond dat het omgekeerde ook voorkomt. distale genen kunnen proximale genen in een operon reguleren via hun effect op de transcriptieafstand. Deze bevindingen bieden ook een voorbeeld van hoe synthetische biologie kan helpen bij het deconstrueren van complexe biologische processen. In dit geval maakten synthetische operons het mogelijk om het effect van operon-organisatie op genexpressie te ontkoppelen van de regulerende mechanismen die in natieve operons bestaan, waardoor het gemakkelijker te identificeren is. De volgende en moeilijkere taak zal zijn om de rol van de transcriptieafstand te onderzoeken bij het moduleren van de expressie van niet-fluorescerende genen in natieve operons.


Kwantitatieve benaderingen voor de studie van bistabiliteit in de lac operon van Escherichia coli

In dit artikel worden de geschiedenis en het belang van de lac operon in de ontwikkeling van moleculaire en systeembiologie worden kort besproken. We beginnen met een beschrijving van de regulerende mechanismen in dit operon, rekening houdend met de meest recente ontdekkingen. Dan bieden we een overzicht van de geschiedenis van de lac operon, inclusief de ontdekking van de belangrijkste elementen en de daaropvolgende invloed op de ontwikkeling van moleculaire en systeembiologie. Vervolgens wordt het bistabiele gedrag van het operon besproken, zowel wat betreft zijn ontdekking als zijn moleculaire oorsprong. Vervolgens wordt een overzicht gegeven van de literatuur waarin dit bistabiele fenomeen is bestudeerd vanuit een wiskundig modelleringsoogpunt. We sluiten af ​​met enkele korte opmerkingen.

1. Inleiding

Glucose is de favoriete koolstof- en energiebron voor Escherichia coli, evenals voor vele andere organismen. Hoewel deze bacterie zich ook kan voeden met andere suikers, doet hij dat alleen als er geen glucose is. Dus als een bacteriecultuur groeit in een medium dat een mengsel van glucose en een andere suiker (zoals lactose) bevat, zal deze zich uitsluitend voeden met de eerste totdat deze is uitgeput, voordat hij overschakelt op de tweede. Een gevolg van dit gedrag is dat de bacteriegroeicurve twee verschillende fasen vertoont, zoals te zien is in figuur 1. Dit fenomeen werd oorspronkelijk bestudeerd door Monod (1941), die het beschreef als diauxische groei. Op dit punt is het vermeldenswaard dat diauxische groei alleen voorkomt in batchculturen, en gelijktijdig gebruik van suikers wordt vaak waargenomen in continue culturen (Lendenmann et al. 1996).

Figuur 1 Typische diauxische groeicurve. Let op het bestaan ​​van twee verschillende exponentiële groeifasen, gescheiden door een kort interval waarin de cultuur niet groeit. De eerste (tweede) fase komt overeen met de bacteriecultuur die zich voedt met glucose (lactose), terwijl het interval zonder groei overeenkomt met de tijd die de bacteriën nodig hebben om de genen aan te zetten die nodig zijn om lactose te metaboliseren na uitputting van de glucose.

Het begrip op moleculair niveau van hoe een organisme achtereenvolgens verschillende metabolieten gebruikt, heeft de afgelopen vijftig jaar enorme belangstelling gewekt. Jacob & Monod (1961)een,B) pakte dit probleem aan en schetste conceptueel hoe bacterieculturen zo snel en volledig van de ene groeiwijze naar de andere konden overschakelen. Daarbij introduceerden ze het operon-concept (Jacob et al. 1960), dat een paradigmatisch voorbeeld van genregulatie is geworden.

Volgens de constructie van Jacob & Monod bestaat een operon uit een reeks structurele genen die samen worden gereguleerd, afhankelijk van de metabolische vereisten van de cel. Deze structurele genen coderen voor een groep enzymen of eiwitten die verantwoordelijk zijn voor een specifieke taak of metabolisch proces, en hun regulatie wordt bereikt via een of meer gemeenschappelijke regulerende mechanismen. Repressie was het eerste regulerende mechanisme dat door hen werd ontdekt. Daarin bindt een repressormolecuul een specifieke DNA-plaats (die zij de operator noemden) die zich stroomopwaarts van de structurele genen bevindt, en remt hun transcriptie. De regulatie van de expressie van de structurele genen wordt bereikt door het aantal actieve repressormoleculen te variëren. Hoewel Jacob en Monod oorspronkelijk dachten dat de repressors RNA-moleculen waren, is het nu bekend dat het eiwitten zijn.

De lactose (of gewoon lac) operon is samengesteld uit drie structurele genen: lacZ, kanten en lacA. Deze genen coderen respectievelijk voor β-galactosidase, lac permease en een transacetylase. β-Galactosidase werkt om lactose te splitsen in galactose en glucose, wat de eerste stap is in het lactosemetabolisme lac permease is een transmembraaneiwit dat nodig is voor de opname van lactose. transacetylase draagt ​​een acetylgroep over van co-enzym A (CoA) naar de hydroxylgroep van de galactosiden. Van deze eiwitten zijn alleen β-galactosidase en lac permease spelen een actieve rol bij de regulatie van de lac operon. Het regulerende gen lacI (in een andere operon) codes voor de lac repressor die, indien actief, in staat is de transcriptie van de structurele genen te remmen door een operator te binden. De lac repressor wordt geïnactiveerd wanneer het wordt gebonden door allolactose, een bijproduct van het lactosemetabolisme. eindelijk, de lac operongenen worden ook opgereguleerd door een activator die de affiniteit van het mRNA-polymerase voor de lac promotor, en waarvan de productie wordt gecontroleerd door de concentratie van extracellulaire glucose.

De lac operon heeft een centrale rol gespeeld in de ontwikkeling van de moleculaire biologie en heeft momenteel een belangrijke invloed op de ontwikkeling van de systeembiologie. In §2 geven we een meer gedetailleerde beschrijving van de lac operon regulerende mechanismen, in §3 bespreken we de belangrijkste aspecten van de ontwikkeling van moleculaire biologie beïnvloed door de lac operon en in §4 geven we een uitgebreid overzicht van de kwantitatieve studies van de lac operon bistabiel gedrag.

2. De lac operon regulerende mechanismen in detail

In §1 is de lac operon controlesysteem werd kort besproken. Hoewel dat korte overzicht een goed idee geeft van hoe dit systeem werkt, is het in werkelijkheid veel complexer. In de volgende paragrafen een meer gedetailleerde beschrijving van alle regelgevende mechanismen in de lac operon, inclusief de meest recente ontdekkingen, zal worden gegeven.

De lac operon regulerende elementen (afgebeeld in figuur 2een) zijn als volgt over de DNA-keten verdeeld (Reznikoff 1992 Müller-Hill 1998): lac promotor is gelokaliseerd tussen bp −36 (bp staat voor basenpaar, en posities worden verwezen ten opzichte van het startpunt van gen lacZ, bp +1) en bp -7. Operator O1 is 21 bp lang en is gecentreerd rond bp +11. Er zijn twee extra operators, aangeduid met O2 en O3, die zich respectievelijk op 401 bp stroomafwaarts en 92 bp stroomopwaarts van O1 bevinden. Ten slotte strekt de activator (CAP) -bindingsplaats zich uit van bp 72 tot bp −50.

Figuur 2 (een) Schema van de regelgevende elementen in lac operon-DNA. P staat voor de promotor, O1, O2 en O3 komen overeen met de drie operatoren (repressor-bindingsplaatsen) en C is de bindingsplaats voor het cAMP-CRP-complex. De verschillende manieren waarop een repressormolecuul kan interageren met de operatorplaatsen worden weergegeven in: B, C, NS en e. Namelijk een vrij repressormolecuul (B), één met een enkele subeenheid gebonden door allolactose (NS) of een met de twee subeenheden aan dezelfde kant gebonden door allolactose (e) kan een enkele operator binden. Bovendien kan een vrij repressormolecuul tegelijkertijd twee verschillende operatoren binden (C). Figuur aangepast van Santillán (2008).

De lac repressor is een homotetrameer (bestaande uit twee functionele homodimeren) van lacI polypeptiden (Lewis 2005 Wilson et al. 2007). Elke functionele dimeer kan de operatoren O1, O2 en O3 binden. Verder kan DNA ook zo vouwen dat een enkele repressor twee operatoren tegelijk bindt, één per dimeer. Elk monomeer in de lac repressor kan worden gebonden door een allolactosemolecuul, waardoor het vermogen van het overeenkomstige dimeer om een ​​operator te binden wordt geremd. Dit betekent dat vrije repressoren één operator kunnen binden (figuur 2B) of twee tegelijk (figuur 2C), kunnen repressoren met drie vrije monomeren één maar niet twee operators binden (figuur 2NS), kunnen repressoren met twee vrije monomeren één operator binden, als de gebonden monomeren tot hetzelfde dimeer behoren (figuur 2e), of helemaal geen, en dat repressoren met slechts één vrij monomeer geen enkele operator kunnen binden, net als repressoren met alle vier de monomeren gebonden door allolactose (Narang 2007).

Deletie-experimenten hebben aangetoond dat een aan O1 gebonden repressor de initiatie van transcriptie remt, terwijl een aan O2 of O3 gebonden repressor bijna geen effect heeft op de expressie van de lac operon structurele genen. Niettemin hebben O2 en O3 een indirect effect omdat het complex dat wordt gevormd door een enkele repressor die tegelijkertijd aan O1 en ofwel O2 of O3 is gebonden, veel stabieler is dan dat van een repressor die alleen aan O1 is gebonden. Het gevolg hiervan is dat door interactie met de lac repressoroperator O1 kan de expressie van de operon-genen slechts 18 keer verminderen wanneer het samenwerkt met O2, het repressieniveau kan oplopen tot 700-voudig wanneer O1 en O3 samenwerken, ze kunnen de operon-activiteit tot 440 keer verminderen wanneer alle drie de operators aanwezig zijn, kan de repressie-intensiteit oplopen tot 1300-voudig (Oehler et al. 1990).

De intracellulaire productie van cyclisch AMP (cAMP) neemt af naarmate de concentratie van extracellulaire glucose toeneemt. cAMP bindt verder aan een specifiek receptormolecuul (CRP) om het zogenaamde CAP-complex te vormen. Ten slotte bindt CAP een specifieke DNA-plaats (hier aangeduid als C) stroomopwaarts van de lac promotor, en door dit te doen verhoogt het de affiniteit van het mRNA-polymerase voor deze promotor (Reznikoff 1992). Dit regulerende mechanisme staat bekend als katabolietrepressie.

Er is onlangs een nieuwe bron van samenwerking ontdekt in de lac operon: wanneer een CAP-complex is gebonden aan site C, buigt het DNA lokaal en verhoogt het de kans op het complex waarin een repressor tegelijkertijd de operatoren O1 en O3 bindt (Kuhlman et al. 2007).

Het laatste reguleringsmechanisme in de lac operon is de zogenaamde inductoruitsluiting. Daarin vermindert externe glucose de efficiëntie van lac permease om lactose te transporteren (Reznikoff 1992), en heeft daardoor een negatieve invloed op de inductie van de operongenen.

Deze regulerende mechanismen die hierboven zijn besproken, zijn samengevat in figuur 3. Zoals we hebben gezien, is de activiteit van de lac operon wordt gereguleerd door extracellulaire glucose en lactose.Terwijl extracellulaire glucose de operon-activiteit verlaagt via katabolietrepressie en uitsluiting van inductoren, verhoogt extracellulair lactose het operon-expressieniveau door de repressor te deactiveren. Een ander opmerkelijk feit is het bestaan ​​van een positieve feedbacklus: naarmate meer moleculen van lac permease en β-galactosidase worden geproduceerd, er is een verhoogde lactose-opnameflux en een verhoogde lactosemetabolismesnelheid, dit verhoogt de productie van allolactose verder en als gevolg daarvan vermindert de hoeveelheid actieve repressor. Dit verhoogt op zijn beurt de operon-activiteit, en dus meer lac permease- en β-galactosidase-moleculen worden geproduceerd.

Figuur 3 Schema van de lac operon regulerende mechanismen. Dit operon bestaat uit genen lacZ, kanten en lacA. Eiwit LacY is een permease dat externe lactose in de cel transporteert. Eiwit LacZ polymeriseert tot een homotetrameer genaamd β-galactosidase. Dit enzym zet interne lactose (Lac) om in allolactose (Allo) of in glucose en galactose (Gal). Het zet ook allolactose om in glucose en galactose. Allolactose kan binden aan de repressor (R) die het remt. Indien niet gebonden door allolactose, kan R binden aan een specifieke plaats stroomopwaarts van de structurele genen van het operon en zo transcriptie-initiatie vermijden. Externe glucose remt de productie van cAMP dat, wanneer gebonden aan eiwit CRP om complex CAP te vormen, werkt als een activator van de lac operon. Externe glucose remt ook de opname van lactose door permease-eiwitten. Figuur aangepast van Santillán et al. (2007).

De lezer die geïnteresseerd is in de details van de lac operon regulerende mechanismen wordt verwezen naar de uitstekende recensie van Beckwith (1987) en de referenties daar. Een goede beschrijving van de operon-regulerende elementen en hun locatie op de DNA-keten is te vinden in Reznikoff (1992). De meest recente ontdekkingen met betrekking tot de samenwerking tussen CAP-bindingsplaats en operator O3 worden gerapporteerd in Kuhlman et al. (2007).

3. Belang van de lac operon

Het operon-model, ontwikkeld door Jacob en Monod in hun poging om diauxische groei te verklaren, liet zien hoe genetische mechanismen metabole gebeurtenissen kunnen controleren als reactie op omgevingsstimuli via de gecoördineerde transcriptie van een reeks genen met een verwante functie. Het werd letterlijk een paradigma voor genregulatie in prokaryoten, waar veel meer operons zijn ontdekt, en heeft ook het begrip van genregulatie in eukaryoten beïnvloed. Verder zijn niet alleen de lac operon als geheel, maar ook de afzonderlijke componenten, zoals de lac repressor, de drie bekende lac operators, het enzym β-galactosidase en het eiwit lac permease, hebben zelf de ontwikkeling van de moleculaire biologie beïnvloed.

3.1 De lac-repressor

Een jaar nadat Jacob en Monod de Nobelprijs ontvingen voor hun bijdragen aan genregulatie, isoleerden Müller-Hill en Gilbert de lac repressor. Dit is een eiwit van 360 aminozuren dat associeert met een homotetrameer met een molecuulmassa van 154 520 Da (Lewis 2005).

Het moleculaire mechanisme van het onderdrukken van de lac operon vereist dat de repressor in staat is om zowel operator-DNA als allolactose (of vergelijkbare inductoren) te binden. De mogelijkheid van competitieve binding door deze liganden werd geëlimineerd door de demonstratie dat proteasedigestie de repressor selectief in twee fragmenten splitst: een tetramere 'kern' (residuen 60-360 van het monomeer) die inductorbindende eigenschappen behoudt, en een monomeer N- terminale zendspoel (aminozuren 1-59) die DNA kunnen binden. Om de inactivatie van de repressor door allolactose te verklaren, stelden Monod, Changeux en Jacob voor dat de repressor een conformationele overgang ondergaat als reactie op gebonden liganden, en dat dit zijn vermogen om DNA te binden verandert. Ze noemden dit fenomeen allotery (Monod et al. 1963).

Begin jaren zeventig werden enkele honderden milligrammen van de repressor gezuiverd en gebruikt voor kristallisatie. Toch bleef de driedimensionale architectuur ervan tot het begin van de jaren negentig ongrijpbaar (Lewis 2005). De driedimensionale structuur van de lac repressor gaf inzicht in hoe de repressor kan functioneren, evenals het driedimensionale raamwerk voor het interpreteren van een enorme hoeveelheid biochemische en genetische informatie. Het belangrijkste is dat wanneer de biochemische en genetische gegevens in de context van de structuur worden bekeken, een gedetailleerd moleculair model kan worden geconstrueerd om een ​​fysieke basis te bieden voor de allosterische respons, evenals een meer gedetailleerd begrip van de genetische omschakeling in de lac operon.

De allosterische respons die in de lactose-repressor werd ontdekt, opende een heel nieuw onderzoeksgebied. Allosterie is gevonden in veel andere eiwitten en is ook uitgebreid tot een verscheidenheid aan cellulaire signaalroutes in alle organismen. Desondanks houdt de transcendentie van de lactose-repressor daar niet op. Het monomeer ervan is bijvoorbeeld onlangs gebruikt als een modelsysteem voor experimentele en theoretische verkenningen van mechanismen voor het vouwen van eiwitten (Wilson et al. 2005).

Degenen die meer willen weten over de lactose-repressor kunnen verwijzen naar de review papers van Lewis (2005) en Wilson et al. (2007).

3.2 De drie lac-operators

De primaire operator site (O1) voor de lac operon werd gesequenced door Gilbert & Maxam (1973) bijna een decennium nadat Jacob en Monod hun model hadden gepubliceerd. Naast O1 werden twee hulpoperatoren (O2 en O3) geïdentificeerd met sequenties die vergelijkbaar waren met die van de primaire operator (Reznikoff et al. 1974). We weten nu dat tetrameer lac repressor is bij uitstek geschikt om twee operators tegelijkertijd te binden, waardoor de zogenaamde 'repressielussen' worden gecreëerd (Reznikoff 1992). DNA-looping verbetert de affiniteit van de repressor voor multi-operatorsequenties, en supercoiling van deze DNA's levert complexen op met opmerkelijke stabiliteit. Er zijn ook een aantal synthetische operatorvarianten geconstrueerd die zeer nuttig zijn gebleken voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen van repressie (Wilson et al. 2007).

Decennia lang werd gedacht dat alle signalen die de initiatie van bacteriële gentranscriptie regelen, geclusterd zijn aan de 5'-uiteinden van operons, zoals oorspronkelijk voorgesteld in de modellen van Jacob, Monod en collega's. Dit aspect van hun pionierswerk is nu bekend als een te grote vereenvoudiging, aangezien initiatiecontrolesignalen sindsdien zijn gevonden binnen, stroomafwaarts en stroomopwaarts van de genen die door hen worden gereguleerd. Hoewel het fenomeen niet zo wijdverbreid is als in hogere cellen, kan de studie ervan in bacteriën vooral verhelderend zijn. Samen met faag lambda-schakelaar, het drie-operator systeem van de lac operon is in dit opzicht buitengewoon nuttig geweest (Gralla 1989). Bovendien hebben niet alleen de lac operators waren nuttig om de moleculaire mechanismen van genregulatie te begrijpen, maar ze zijn ook gebruikt voor andere praktische doeleinden. Bijvoorbeeld een techniek voor in vivo chromosoomdynamiek visualiseren met behulp van lac operator-repressor binding is voorgesteld (Belmont & Straight 1998).

3.3 Het -galactosidase-enzym

Weinig genen hebben een studiegeschiedenis die zo lang en onderscheidend is als lacZ. De lacZ gen codeert voor een open leesraam van 1024 aminozuren en is een van de eerste grote genen waarvan de sequentie volledig is bepaald. In E coli, het biologisch actieve β-galactosidase-eiwit bestaat als een tetrameer van vier identieke subeenheden en heeft een molecuulgewicht van ongeveer 480-500 kDa. De primaire enzymatische functie van β-galactosidase die relevant is voor zijn rol als biotechnologisch hulpmiddel, is het splitsen van de chemische binding tussen de anomere koolstof en glycosylzuurstof van geschikte substraten (Serebriiskii & Golemis 2000).

Inductie van de synthese van β-galactosidase vindt plaats over een groot dynamisch bereik (tot 10.000 keer hoger dan de basislijnniveaus bij sommige inductoren). Dit grote bereik is deels haalbaar omdat het β-galactosidase-eiwit in extreem hoge concentraties kan worden getolereerd. E coli, evenals in vele andere organismen zoals gisten, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster en zoogdieren. Verder wordt het β-galactosidase-eiwit gemakkelijk gezuiverd door een aantal relatief eenvoudige technieken, wat de in vitro analyse van zijn activiteit.

Een aantal substraten (inductoren) voor β-galactosidase zijn van nature beschikbaar of zeer gemakkelijk chemisch te synthetiseren. Deze verbeteren de ontwikkeling van modellen voor enzymatische activiteit van β-galactosidase en bieden ook een praktisch hulpmiddel om de expressie of katalytische activiteit van het eiwitproduct van β-galactosidase fijn te moduleren.

De activiteit van β-galactosidase is gemakkelijk te bepalen, zowel in vivo en in vitro. Assays die bekendheid hebben bereikt, omvatten het gebruik van colorimetrische substraten waarin de splitsing van specifieke a-d-galactopyranoside-gekoppelde aglycondelen gekleurde kleurstoffen vrijgeeft. Meer recentelijk is het panel van beschikbare colorimetrische substraten uitgebreid met fluorescerende of chemiluminescente alternatieve substraten, die de gevoeligheid en toepassingen verder uitbreiden.

Het β-galactosidase-eiwit is structureel kneedbaar. Het bestaat uit drie scheidbare functionele domeinen: alfa (α, amino-terminaal), beta (β, centraal) en omega (ω, carboxy-terminaal). Onafhankelijke co-expressie van de gescheiden domeinen van het β-galactosidase-eiwit reconstrueert met succes de activiteit van het volledige enzym. Dit vermogen, evenals het extra vermogen van β-galactosidase om enzymatisch te functioneren wanneer het tot expressie wordt gebracht als een translationele fusie met een gevarieerde groep van eiwit- of peptidedelen, maakt verdere toepassingen mogelijk.

Deze kenmerken hebben het gebruik van lacZ en zijn product (β-galactosidase) in veel wetenschappelijke en technologische toepassingen. Het valt buiten het bestek van dit artikel om ze allemaal te bespreken, maar de uitstekende recensie van Silhavy & Beckwith (1985) kan worden geraadpleegd. Verder, degenen die meer willen weten over de toepassingen van het gen lacZ en het eiwit β-galactosidase kunnen Silhavy & Beckwith (1985), Josephy (1996), Serebriiskii & Golemis (2000) en Shuman & Silhavy (2003) raadplegen.

3.4 Het lac-permease-eiwit

Actieve transporters (pompen) hebben een cellulaire energiebron nodig (d.w.z. ATP-hydrolyse) om het transport van geladen componenten tegen een elektrochemische gradiënt te katalyseren. Afhankelijk van hun energiebron worden actieve transporters geclassificeerd als primair of secundair. Vooral secundaire transporters gebruiken de vrije energie die is opgeslagen in een bepaalde elektrochemische ionengradiënt (Abramson et al. 2004). LacY is een secundaire transporter die vrije energie koppelt die vrijkomt bij de bergafwaartse translocatie van protonen om de bergopwaartse translocatie van galactosiden tegen een concentratiegradiënt in te drijven.

Lactosepermease van E coli (LacY) is samengesteld uit 417 aminozuurresiduen en heeft 12 helices die het membraan op zigzagwijze doorkruisen, verbonden door relatief hydrofiele lussen met zowel N- als C-uiteinden aan de cytoplasmazijde. Dit eiwit wordt gecodeerd door kanten, het tweede structurele gen in de lac operon. kanten was het eerste gen dat codeert voor een membraantransporteiwit dat in een recombinant plasmide werd gekloneerd, tot overexpressie werd gebracht en waarvan de sequentie werd bepaald (zie Kaback 2005 en referenties daarin). Dit succes in de begindagen van de moleculaire biologie opende de studie van secundair actief transport op moleculair niveau. Zo was LacY het eerste eiwit in zijn klasse dat oplosbaar werd gemaakt en gezuiverd in een volledig functionele staat, wat aantoont dat dit enkelvoudige genproduct als enige verantwoordelijk is voor alle translocatiereacties die worden gekatalyseerd door het galactosidetransportsysteem in E coli. Er is ook aangetoond dat LacY zowel structureel als functioneel een monomeer in het membraan is (Kaback 2005).

Sinds de ontdekking van lactosepermease zijn een aantal moleculair biologische, biochemische en biofysische benaderingen gebruikt om dit eiwit te bestuderen. Analyse van deze uitgebreide gegevens, en in het bijzonder van recente ontdekkingen met betrekking tot de LacY-structuur en de eigenschappen van mutanten in de onvervangbare residuen (Kaback 2005), heeft geleid tot de formulering van een model voor dit eiwittransportmechanisme (Abramson et al. 2004). Bovendien, vergelijking van de structuren van LacY en andere MFS-transporters (zoals de Pl/glycerol-3-fosfaat antiporter (GlpT)) heeft waardevolle informatie opgeleverd over het functioneren van secundaire actieve transporters in het algemeen.

Abramson et al. (2004) en Kaback (2005) beoordelen de stand van de kennis over secundaire actieve transporters, waarvan de lactosepermease een paradigma is.

Samenvattend kunnen we uit de bovenstaande overwegingen zien dat de lac systeem is uiterst belangrijk geweest en blijft ons moleculaire begrip van genetische controle en de relatie tussen sequentie, structuur en functie bevorderen.

4. Kwantitatieve experimentele en theoretische benaderingen

Twee verschillende interpretaties van de lac operon dynamische prestaties bestonden in het begin. Monod betoogde dat de concentratie van de inductoren in de groeiomgeving het inductieniveau van het operon volledig bepaalt. Aan de andere kant stelden Cohn & Horibata (1959) een meer subtiele interpretatie van hun experimenten voor. Ze suggereerden dat de lac systeem biedt een ‘experimenteel voorbeeld van het Delbrück-model’ (Delbrück 1949). Volgens Delbrück kunnen biologische systemen met identieke genotypen onder bepaalde externe omstandigheden verschillend gedrag vertonen, vanwege 'epigenetische' verschillen die kunnen worden overgedragen in de cellijn in afwezigheid van genetische modificatie. Deze hypothese komt overeen met een zeer vroege formulering van het algemene principe van fenotypische overerving.

Novick & Weiner (1957) en Cohn & Horibata (1959) ontdekten het zogenaamde 'onderhoudseffect', volgens welke een enkele cel twee alternatieve toestanden kan hebben: geïnduceerd, waarin het lactose kan metaboliseren, of niet-geïnduceerd, waarbij de overeenkomstige genen zijn uitgeschakeld en lactosemetabolisme vindt niet plaats. Hun experimentele protocol was als volgt. Eerst werd een grote hoeveelheid inductor toegevoegd aan het extracellulaire medium van een kweek van niet-geïnduceerde E coli vervolgens werd de kweek in twee delen gesplitst: U en I. Deel U werd onmiddellijk verdund, en dus bleven de cellen niet-geïnduceerd, deel I werd na enkele minuten verdund, waardoor de cellen in deze subcultuur konden worden geïnduceerd. Ze merkten verder op dat, wanneer geïnduceerde cellen werden overgebracht naar een medium met een tussenliggende 'onderhoudsconcentratie' van inductor, zij en hun nageslacht geïnduceerd bleven. Evenzo, wanneer niet-geïnduceerde cellen werden overgebracht naar een medium met een 'onderhouds'-concentratie, bleven zij en hun nageslacht niet-geïnduceerd.

Het 'onderhoudseffect' werd geïnterpreteerd als het gevolg van een hoge permeaseconcentratie in geïnduceerde cellen, die ook een hoge pompefficiëntie van de inducer zou hebben. Dit zou deze cellen in staat stellen om de geïnduceerde toestand te behouden en deze door te geven aan hun nageslacht, zelfs als ze in een medium met een lage concentratie aan inductor worden geplaatst. Deze interpretatie verklaart het bestaan ​​van twee verschillende fenotypen en geeft een verklaring waarom geïnduceerde cellen die in media met lage inductorconcentraties zijn geplaatst, voor onbepaalde tijd geïnduceerd blijven, terwijl cellen die nooit zijn geïnduceerd ongeïnduceerd blijven. Het verklaart echter niet waarom de cellen tussen alternatieve toestanden schakelen. Deze omschakeling bleef lange tijd een mysterie en het moest wachten tot de introductie van het begrip multistabiliteit volledig werd uitgelegd.

Griffith (1968) ontwikkelde een wiskundig model (met behulp van gewone differentiaalvergelijkingen, ODE's) voor een enkel gen gecontroleerd door een positieve feedbacklus. Hij ontdekte dat, onder bepaalde voorwaarden, twee stabiele toestanden tegelijkertijd voor het systeem toegankelijk kunnen zijn. Griffith heeft zijn model echter niet gebruikt om het onderhoudseffect van de lac operon. De eerste modellen die rekening hielden met alle relevante processen om de dynamiek van de lac operon werden door Babloyantz & Sanglier (1972) en Nicolis & Prigogine (1977). Met behulp van een wiskundige modelleringsbenadering interpreteerden ze het onderhoudseffect als het biologische facet van het fysieke proces van multistabiliteit. Dit model, met een niet-lineaire feedbacklus, was verantwoordelijk voor de belangrijkste gedragskenmerken van de bistabiele overgang van lactose naar operon. Hoewel de wiskundige beschrijving van het model vijf differentiaalvergelijkingen vereiste (plus één behoudsvergelijking), hield het model geen rekening met de gedetailleerde informatie die beschikbaar was over moleculaire interacties tussen de operoncomponenten.

4.1 De Ozbudak et al. experimenten

In de afgelopen jaren is de interesse in het bistabiele gedrag van het lactose-operon hernieuwd, en dit is deels te danken aan een paper dat onlangs is gepubliceerd door Ozbudak et al. (2004). Daarin rapporteren de auteurs de resultaten van een reeks ingenieuze experimenten die zijn ontworpen om de bistabiele lac operon-respons wanneer geïnduceerd met lactose en de kunstmatige niet-metaboliseerbare inductor thiomethylgalactoside (TMG). Ozbudak et al. bevatte een enkele kopie van het groene fluorescerende eiwitgen (gfp) onder de controle van de lac promotor in het chromosoom van E coli. De cellen bevatten ook een plasmide dat codeert voor een rode fluorescerende reporter (HcRed) onder controle van de galactitol (gat) promotor. Deze promotor omvat een CRP-bindingsplaats, evenals een bindingsplaats voor de galactitolrepressor GatR. GatR is echter afwezig in E coli. Daarom transcriptie op de gat promotor, gemeten door rode fluorescentie, is een directe maat voor CRP-cAMP-niveaus. Ze maten verder de respons van afzonderlijke cellen, aanvankelijk in een bepaalde staat van lac expressie, aan blootstelling aan verschillende combinaties van glucose- en TMG-spiegels.

Ozbudak et al. melden dat, voor een gegeven concentratie extracellulaire glucose, de lac operon wordt niet geïnduceerd bij lage TMG-concentraties en volledig geïnduceerd bij hoge TMG-concentraties, ongeacht de geschiedenis van de cel. Tussen deze schakeldrempels is de systeemrespons echter hysterisch (geschiedenisafhankelijk). Door de fluorescentie van afzonderlijke cellen te meten, kan Ozbudak et al. verkregen bimodale verdelingen tussen de schakeldrempels, wat het bestaan ​​van bistabiliteit bevestigt. Toen de experimenten werden herhaald met lactose, in plaats van TMG, werden geen aanwijzingen voor bistabiliteit gevonden. De resultaten in dit artikel bevestigden niet alleen bistabiliteit in de lac operon wanneer geïnduceerd met TMG, maar leverde ook nieuwe en nieuwe kwantitatieve gegevens op die vragen oproepen die via een modelleringsaanpak kunnen worden beantwoord.

4.2 Een minimaal model

Er zijn een aantal wiskundige modellen ontwikkeld om het dynamische gedrag van lac operon. In §4.3 zullen de kenmerken van sommige van deze modellen worden geanalyseerd door ze te vergelijken met het hieronder geïntroduceerde minimale model.

Laten m, E en Lgeven respectievelijk de intracellulaire concentraties van mRNA, LacZ-polypeptide en lactose aan. De differentiaalvergelijkingen die de dynamiek van deze variabelen bepalen, zijn:

De processen die de dynamiek van alle andere chemische soorten beheersen dan m, E en L worden verondersteld snel genoeg te zijn om quasi-stationaire benaderingen te maken voor de overeenkomstige dynamische vergelijkingen.

Aangezien de helft van de opgenomen lactose direct wordt omgezet in glucose en galactose door -galactosidase, terwijl de rest wordt omgezet in allolactose (dat ook later wordt omgezet in glucose en galactose), kan worden aangenomen dat de intracellulaire concentraties van lactose en allolactose lijken erg op elkaar (zie Santillán et al. 2007 voor meer details).

De translatie- en afbraaksnelheden van genen lacZ en kanten worden verondersteld identiek te zijn. Dus aangezien β-galactosidase (lac permease) een tetrameer (monomeer) is, wordt aangenomen dat de concentratie ervan een kwart is van (gelijk aan) E.

Het is belangrijk op te merken dat de gepubliceerde lac operon-modellen verschillen in de manier waarop de functie R(L,Ge) is geformuleerd. In sommige gevallen wordt heuristisch redeneren gebruikt om Hill-type vergelijkingen voor te stellen voor: R(L,Ge). Sommige andere modellen houden, met verschillende detailniveaus, rekening met de interacties tussen het mRNA-polymerase en de repressormoleculen met de DNA-keten om deze functie te modelleren. We bespreken deze verschillen in onze review van verschillende modellen in §4.3.

4.3 Recente modelleringsbenaderingen

Wong et al. (1997) ontwikkelden een 13-dimensionaal model voor de lac operon. Naast het mRNA van de structurele genen en de intracellulaire lactoseconcentraties, zijn de variabelen die ze beschouwen repressor-mRNA- en eiwitconcentraties β-galactosidase- en permeaseconcentraties (elk bepaald door een andere differentiaalvergelijking), de interne concentraties van allolactose, cAMP, glucose en gefosforyleerde glucose en de externe concentraties van glucose en lactose. Hun model omvat onderdrukking van katabolieten, uitsluiting van inductoren, hydrolyse van lactose tot glucose en galactose, synthese en afbraak van allolactose en een variabele groeisnelheid. Wong et al. gebruikten hun model om de diauxische groei van E coli op glucose en lactose. Hiervoor testten ze verschillende modellen voor katabolietrepressie en de fosforylering van de glucose geproduceerd door lactosehydrolyse, en analyseerden ze de invloed van de modelparameters op de twee diauxische fasen. Behalve dat het behoorlijk gedetailleerd is, heeft dit model de verdienste dat de meeste parameters erin zijn geschat op basis van experimentele gegevens. Hoewel, hoewel Wong et al. het bestaan ​​van de drie bekende operator-sites beschouwden, negeerden ze hun coöperatieve gedrag en namen ze ten onrechte aan dat een repressor die aan een operator is gebonden, de transcriptie-initiatie remt. Verder, Wong et al. hield ook rekening met het effect van de CAP-activator door aan te nemen dat het aan zijn specifieke plaats in het DNA-regulerende gebied moet worden gebonden opdat het polymerase aan de promoter kan binden.

Vilar et al. (2003) introduceerde een eenvoudig model van de lac operon om de toepasbaarheid en beperkingen van wiskundige modellering van de dynamiek van cellulaire netwerken te illustreren. In het bijzonder bestuderen ze de lac operon inductie dynamiek en de relatie met bistabiliteit. Vilar et al. gericht op het integreren van drie verschillende niveaus van beschrijving (moleculair, cellulair en die van celpopulatie) in een enkel model, en gebruikte het om de systeemdynamiek te onderzoeken wanneer een kunstmatige (niet-metaboliseerbare) inductor wordt gebruikt om het te activeren. In tegenstelling tot het minimale model, dat van Vilar et al. brokken (via een quasi-steady-state aanname) de mRNA-dynamiek in de vergelijkingen die de overeenkomstige eiwitconcentraties regelen. Het verklaart verder de LacZ- en LacY-dynamica door middel van twee differentiaalvergelijkingen, neemt aan dat LacY in een niet-functionele of een functionele toestand kan zijn en bevat nog een vergelijking voor deze laatste chemische soort. Ten slotte houdt dit model geen rekening met katabolietrepressie of uitsluiting van inductoren en verklaart het het repressiemechanisme door middel van een Hill-type vergelijking.

Yildirim & Mackey (2003) onderzochten het bistabiele gedrag van de lac operon. Hiervoor introduceerden ze een vijfdimensionaal wiskundig model. Het model van Yildirim en Mackey verklaart de dynamiek van β-galactosidase en lac permease door middel van twee verschillende differentiaalvergelijkingen, evenals voor de dynamiek van intracellulaire lactose en allolactose. Dit model houdt ook rekening met de vertragingen als gevolg van transcriptie- en vertaalprocessen. De auteurs hebben bijzondere aandacht besteed aan de schatting van de parameters in het model. Ze testten hun model verder tegen twee sets van β-galactosidase-activiteit versus tijdgegevens, en tegen een set gegevens over β-galactosidase-activiteit tijdens periodieke fosfaatvoeding. Hun analytische en numerieke studies geven aan dat er voor fysiologisch realistische waarden van externe lactose en de bacteriële groeisnelheid een regime bestaat waarin bistabiliteit kan optreden, en dat dit overeenkomt met een cusp-bifurcatie in de modeldynamiek. De tekortkomingen van het model van Yildirim & Mackey zijn dat het geen rekening houdt met de repressie van katabolieten of de regulerende mechanismen voor uitsluiting van inductoren. Bovendien, hoewel ze de repressieregulerende functie bouwden door rekening te houden met de repressor-operator en de polymerase-promoter-interacties, negeerden ze het bestaan ​​van drie operators en beschouwden ze alleen operator O1.

In een later artikel, Yildirim et al. (2004) probeerden als de oorsprong van bistabiliteit een van de mechanismen te identificeren die betrokken zijn bij de regulatie van de lac operon. Om dit te doen, vereenvoudigden ze het model gepresenteerd in Yildirim & Mackey (2003) door de permeasedynamiek te negeren en een constante permeaseconcentratie aan te nemen. Ze analyseerden numeriek en analytisch de stationaire toestanden van het gereduceerde model en toonden aan dat het inderdaad bistabiliteit kan vertonen, afhankelijk van de extracellulaire lactoseconcentratie en groeisnelheid.

Santillán & Mackey (2004) ontwikkelden een wiskundig model van de lac operon, dat verantwoordelijk is voor alle bekende regulerende mechanismen, waaronder katabolietrepressie en uitsluiting van inductoren (die beide afhankelijk zijn van externe glucoseconcentraties), evenals de tijdsvertragingen die inherent zijn aan transcriptie en translatie. Met dit model onderzochten ze de invloed van katabolietrepressie en uitsluiting van inductoren op het bistabiele gedrag van de lac operon. Het model van Santillán & Mackey is zesdimensionaal en de vrije variabelen zijn de lacZ en kanten mRNA-concentraties, de -galactosidase en lac permeaseconcentraties en de allolactose- en cAMP-concentraties. Het is belangrijk op te merken dat het model van Santillán & Mackey rekening houdt met alle drie de bekende operatoren en de onderlinge samenwerking, en dat alle parameters erin werden geschat op basis van experimentele gegevens. Ze gebruikten in het bijzonder een thermodynamische benadering om de interacties tussen de CAP-activator, de repressor en het polymerase met hun respectieve bindingsplaatsen langs de DNA-keten te modelleren, evenals het coöperatieve gedrag van de drie bekende operatoren.

Van Hoek & Hogeweg (2006) uitgevoerd in silico simulatie van de lac operon evolutie in bacteriële populaties. Uit hun resultaten blijkt dat de parameters die de expressie van de lac operongenen evolueren op een zodanige manier dat het systeem bistabiliteit vermijdt met betrekking tot lactose, maar vertoont bistabiliteit met betrekking tot kunstmatige inductoren. Zo argumenteren ze op basis van hun computationele experimenten dat het wildtype lac operon, dat het lactosemetabolisme reguleert, is onder natuurlijke omstandigheden geen bistabiele omschakeling. Het model van van Hoek & Hogeweg bevat 10 onafhankelijke differentiaalvergelijkingen en is gebaseerd op het model van Wong et al. (1997). Dit model houdt rekening met alle bekende regulerende mechanismen. In plaats van de chemische details in overweging te nemen, modelleerden Van Hoek & Hogeweg echter de repressor-DNA en de CAP activator-DNA-interacties door middel van Hill-type vergelijkingen.

In een later artikel wijzigden Van Hoek & Hogeweg (2007) de lac operon-model in Van Hoek & Hogeweg (2006) om stochasticiteit op te nemen en de effecten ervan vanuit een evolutionair oogpunt te bestuderen. Door een mutatie-selectieproces ontwikkelden ze de vorm van de promotorfunctie, en dus de effectieve hoeveelheid stochasticiteit. Van Hoek en Hogeweg concludeerden uit hun resultaten dat ruiswaarden voor lactose, de natuurlijke inductor, veel lager zijn dan die voor kunstmatige, niet-metaboliseerbare inductoren, omdat deze kunstmatige inductoren een sterkere positieve feedback ervaren. Ze toonden verder aan dat een hoge mate van repressie en dus een hoge stochasticiteit de vertraging in de opname van lactose in een variabele omgeving vergroten. Hieruit concludeerden de auteurs dat de lac operon is zo geëvolueerd dat de impact van stochastische genexpressie klein is in zijn natuurlijke omgeving, maar reageert met een veel sterkere stochasticiteit wanneer het wordt geconfronteerd met kunstmatige inductoren.

Santillan et al. (2007) onderzochten de oorsprong van bistabiliteit in de lac operon. Hiervoor ontwikkelden ze een wiskundig model voor de regulerende route in dit systeem en vergeleken de modelvoorspellingen met de experimentele resultaten van Ozbudak et al. (2004). Santillan et al. onderzocht het effect van lactosemetabolisme met behulp van dit model en toonde aan dat het het bistabiele gebied in de externe lactose- versus externe glucoseparameterruimte aanzienlijk wijzigt. Het model voorspelt ook dat het lactosemetabolisme de bistabiliteit kan doen verdwijnen bij zeer lage externe glucoseconcentraties. De auteurs voerden verder stochastische numerieke simulaties uit voor verschillende niveaus van externe glucose en lactose en concludeerden uit hun resultaten dat bistabiliteit kan helpen garanderen dat E coli verbruikt glucose en lactose op de meest efficiënte manier. namelijk de lac operon wordt alleen geïnduceerd als er bijna geen glucose in het groeimedium is, maar als de externe lactose hoog is, neemt het operon-inductieniveau abrupt toe wanneer de glucoseniveaus in de omgeving tot zeer lage waarden dalen. Ten slotte toonden ze aan dat dit gedrag niet kan worden verkregen zonder bistabiliteit als de stabiliteit van de geïnduceerde en niet-geïnduceerde toestanden moet worden behouden.

Als vervolg op het werk in Santillán et al. (2007), Santillán (2008) verbeterden het wiskundige model om op een meer gedetailleerde manier rekening te houden met de interactie van de repressormoleculen met de drie lac exploitanten. Bovendien neemt Santillán in het model een recent ontdekte coöperatieve interactie op tussen het CAP-molecuul (een activator van het lactose-operon) en operator 3, die de DNA-vouwing beïnvloedt. Ten slotte omvat dit nieuwe model ook de afhankelijkheid van de groeisnelheid van de bacteriële energie-invoersnelheid in de vorm van getransporteerde glucosemoleculen en van gemetaboliseerde lactosemoleculen. Met het verbeterde model is een groot aantal numerieke experimenten uitgevoerd en de resultaten worden langs dezelfde lijnen besproken als in Santillán et al. (2007), inclusief een gedetailleerd onderzoek naar het effect van een variabele groeisnelheid op de systeemdynamiek. De modellen in zowel Santillán et al. (2007) en Santillán (2008) hebben dezelfde structuur als het minimale model hierboven. Bovendien houden beide modellen rekening met de chemische details van de repressor-DNA- en CAP-activator-DNA-interacties, evenals met de waargenomen samenwerking tussen repressormoleculen die aan verschillende operators zijn gebonden.

De hier besproken modellen zijn samengevat in tabel 1. Ze hebben allemaal te maken met het bistabiele gedrag van de lac operon. De meeste die vóór Ozbudak . zijn gepubliceerd, et al. (2004) beschouwen alleen het gebruik van lactose als inductor, en ze voorspellen dat de lac operon vertoont bistabiliteit voor fysiologische lactoseconcentraties. In die zin is het experimentele werk van Ozbudak et al. leverde nieuwe gegevens en opende nieuwe vragen die geschikt waren voor een wiskundige modelleringsaanpak. Een van deze vragen is waarom bistabiliteit niet kan worden waargenomen wanneer de lac operon natuurlijke inductor wordt gebruikt. De meest recente kwantitatieve benaderingen hebben gebruik gemaakt van Ozbudak et al.'s resultaten om nauwkeurigere modellen te ontwikkelen, en er zijn twee verschillende antwoorden op de bovenstaande vraag voorgesteld. Van Hoek & Hogeweg (2006, 2007) stellen dat bistabiliteit helemaal verdwijnt als gevolg van de evolutionaire aanpassing van bacteriën aan een fluctuerende omgeving van glucose en lactose, terwijl Santillán et al. (2007) en Santillán (2008) stellen dat bistabiliteit niet verdwijnt, maar extreem moeilijk te identificeren is met de experimentele opzet van Ozbudak et al. Ze bespreken bovendien de betekenis ervan vanuit een evolutionair perspectief. Nieuwe experimenten zijn nodig om deze discrepantie op te lossen.

Tabel 1 Samenvatting van de wiskundige modellen van de lac operon dat we hier hebben besproken. (Het dimensienummer verwijst naar het aantal afhankelijke variabelen. Een modeltype kan deterministisch (D) of stochastisch (S) zijn. Ten slotte vermeldt de inductorkolom of modelinductie met lactose (L) of een kunstmatige inductor (A) is rekening mee gehouden).

De meeste modellen die in deze paragraaf worden besproken, hebben betrekking op ODE's. Aangezien chemische kinetiek het formalisme is achter ODE-modellen, zijn ze alleen geldig als het aantal moleculen (N) is zo klein dat het klein genoeg is. Echter, in de lac operon, de lacZ De snelheid van mRNA-afbraak is zo hoog dat het gemiddelde aantal mRNA-moleculen per bacterie ongeveer 0,75 is, wanneer het operon volledig is geïnduceerd (Santillán 2008). Verder is de lac repressor Lacl is aanwezig in slechts ongeveer 10 tetrameren per cel (Müller-Hill 1998). Hieruit volgt dat een essentieel aspect van het modelleren van de lac operon is zijn stochastische aard. Zoals te zien in tabel 1, alleen de meest recente modellen (Santillán et al. 2007 van Hoek & Hogeweg 2007 Santillán 2008) verklaren deze inherente systeemstochasticiteit. Van Hoek & Hogeweg beweren dat geluid een groot effect heeft op de evolutie van de lac operon: cellen evolueren zodanig dat ruis weinig effect heeft op het dynamische gedrag van het systeem. Santillán . daarentegen et al. Beweer wel dat ruis een groot effect heeft op het dynamische gedrag van het systeem. Wij zijn van mening dat er op dit punt nog veel werk moet worden verzet.

5. Conclusies

In dit artikel hebben we een beschrijving gegeven van de regulerende mechanismen in de lac operon, rekening houdend met de meest recente ontdekkingen. Ook de systeemgeschiedenis is in kaart gebracht, waarbij de nadruk ligt op de ontdekking van de belangrijkste elementen en de invloed die deze hebben gehad op de ontwikkeling van de moleculaire en systeembiologie. Het bistabiele gedrag van de operon is ook geanalyseerd, inclusief de ontdekking en oorsprong van dit complexe fenomeen.

Multistabiliteit (waarvan bistabiliteit het eenvoudigste voorbeeld is) komt overeen met een echte omschakeling tussen alternatieve en naast elkaar bestaande stabiele toestanden, en maakt het dus mogelijk dat een gradueel signaal wordt omgezet in een discontinue evolutie van het systeem langs verschillende mogelijke paden. Multistabiliteit heeft bepaalde unieke eigenschappen die niet worden gedeeld door andere mechanismen van integratieve controle. Deze eigenschappen kunnen een essentiële rol spelen in de dynamiek van levende cellen en organismen. Bovendien is multistabiliteit ingeroepen om catastrofale gebeurtenissen in de ecologie te verklaren (Rietkerk et al. 2004), mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK) cascades in dierlijke cellen (Ferrell & Machleder 1998 Bagowski & Ferrell 2001 Bhalla et al. 2002), celcyclusregulatiecircuits in Xenopus en Saccharomyces cerevisiae (Kruis et al. 2002 Pomerening et al. 2003), het genereren van switch-achtige biochemische reacties (Ferrell & Machleder 1998 Bagowski & Ferrell 2001 Bagowski et al. 2003), en het vaststellen van celcyclusoscillaties en elkaar uitsluitende celcyclusfasen (Pomerening et al. 2003 Sha et al. 2003), naast andere biologische verschijnselen.

Niet alleen was de lac operon het eerste systeem waarin bistabiliteit werd ontdekt, maar, zoals de literatuur die in dit artikel wordt besproken aantoont, was en is het nog steeds een van de ideale modelsystemen om dit complexe gedrag te analyseren. Volgens de kwantitatieve onderzoeken die we hebben beoordeeld, is de lac operon heeft geholpen om de oorsprong, biologische implicaties en subtiliteit van bistabiliteit te begrijpen, het kan ook helpen om soortgelijke vragen in andere systemen en organismen aan te pakken. Om deze en andere redenen die in dit artikel niet aan de orde komen, zijn wij van mening dat het lactose-operon net zo invloedrijk kan zijn in de ontwikkeling van het ontluikende veld van de systeembiologie als in de ontwikkeling van de moleculaire biologie.

De verschillende wiskundige modellen van de lac operon die hier wordt besproken, is een goed voorbeeld van wat de filosofie van het maken van modellen is en hoe wiskundige modellen de ontwikkeling van een bepaalde wetenschappelijke discipline kunnen beïnvloeden. Om deze kwestie te bespreken maken we uitgebreid gebruik van het uitstekende essay van Rosenblueth & Wiener (1945), dat we in de komende paragrafen een aantal keren zullen citeren.

Volgens Rosenblueth en Wiener zijn modellen een essentiële noodzaak voor wetenschappelijke procedures omdat geen enkel substantieel deel van het universum zo eenvoudig is dat het kan worden begrepen en gecontroleerd zonder abstractie, waarbij abstractie het deel van het universum vervangt door een model van vergelijkbare maar eenvoudigere structuur. Rosenblueth en Wiener classificeren wetenschappelijke modellen verder als materieel of formeel. In hun visie is een materieel model de representatie van een complex systeem door een systeem waarvan wordt aangenomen dat het eenvoudiger is en waarvan wordt aangenomen dat het enkele eigenschappen heeft die vergelijkbaar zijn met die geselecteerd voor studie in het oorspronkelijke complexe systeem.Daarentegen is een formeel model een symbolische bewering in logische termen van een geïdealiseerde relatief eenvoudige situatie die de structurele eigenschappen van het oorspronkelijke feitelijke systeem deelt. Hier houden we ons bezig met formele modellen waarvan de wiskundige een subset zijn.

Gesloten dozen (waarin een eindig aantal outputvariabelen causaal gerelateerd is aan een eindig aantal inputvariabelen, zonder kennis van de gedetailleerde mechanismen in de box) worden vaak gebruikt in formele modellen. Inderdaad, volgens Rosenblueth en Wiener beginnen alle wetenschappelijke problemen als gesloten-box-problemen (d.w.z. dat slechts enkele van de significante variabelen worden erkend), en wetenschappelijke vooruitgang bestaat uit een geleidelijke opening van die dozen. De opeenvolgende toevoeging van variabelen leidt gaandeweg tot meer uitgewerkte theoretische modellen, dus tot een hiërarchie in deze modellen, van relatief eenvoudige, zeer abstracte modellen naar complexere, meer concrete theoretische structuren. Het opzetten van een eenvoudig model voor een gesloten doos is gebaseerd op de aanname dat een aantal variabelen slechts losjes gekoppeld zijn aan de rest van de variabelen die tot het systeem behoren. Naarmate de opeenvolgende modellen steeds geavanceerder worden, neemt het aantal gesloten gebieden gewoonlijk toe, omdat het proces kan worden vergeleken met de onderverdeling van een originele enkele doos in verschillende kleinere gesloten compartimenten. Veel van deze kleine compartimenten kunnen bewust gesloten worden gelaten, omdat ze alleen functioneel, maar niet structureel belangrijk worden geacht.

Vroege gesloten-boxmodellen, zoals die van Griffith (1968), erkenden dat een gen dat wordt onderworpen aan positieve feedbackregulatie bistabiliteit kan vertonen. Omdat positieve feedback echter geen bistabiliteit garandeert, konden deze modellen niet voorspellen of de lac operon zou dit gedrag laten zien en, zo ja, wat de verantwoordelijke mechanismen zijn. Er waren meer gedetailleerde modellen nodig om deze vragen te beantwoorden, en ze zijn ontwikkeld omdat de nodige experimentele informatie nu beschikbaar is. Zoals meer dan 60 jaar geleden door Rosenblueth en Wiener werd voorzien, zijn deze meer gedetailleerde modellen heterogene samenstellingen van elementen, waarvan sommige in detail worden behandeld (dat wil zeggen specifiek of structureel) en sommige alleen worden behandeld met betrekking tot hun algehele prestaties (dat wil zeggen, algemeen of functioneel). De modellen van Santillán et al. en van Hoek en Hogeweg zijn goede voorbeelden. Terwijl bijvoorbeeld de Santillán et al. modellen houden rekening met de details van de polymerase-DNA, de repressor-DNA en de activator-DNA-interacties, de modellen van Van Hoek en Hogeweg voegen ze samen in een gesloten doos. Aan de andere kant modelleren Van Hoek en Hogeweg met meer detail de dynamiek van de lactose, allolactose, glucose, cAMP en ATP intracellulaire concentraties, en dit wordt weerspiegeld in het aantal onafhankelijke vergelijkingen dat de van Hoek en Hogeweg en de Santillán et al. modellen hebben. Tot slot, terwijl Van Hoek en Hogeweg een evolutionaire modelleringsbenadering gebruiken om bistabiliteit in de lac operon, Santillán et al. gebruik een meer statische benadering en probeer de lac operon in detail. Om meer uitgebreide modellen te ontwikkelen, zijn nauwkeurigere kwantitatieve gegevens over de systeemcomponenten en hun interacties vereist. Idealiter zal een cyclus van modellering en experimentele inspanningen worden voortgezet, met als resultaat modellen die steeds geavanceerder worden en in staat zijn om meer specifieke vragen te beantwoorden. Het heeft echter geen zin om dit proces uit te voeren totdat het zijn voor de hand liggende limiet heeft bereikt. Om dit uit te leggen verwijzen we nogmaals naar Rosenblueth & Wiener (1945), die beweerden dat naarmate een model gedetailleerder en nauwkeuriger wordt, het de neiging zal hebben identiek te worden aan het oorspronkelijke systeem. Als limiet wordt het het systeem zelf. Het ideale model zou dan een model zijn dat in zijn volle complexiteit overeenkomt met het systeem en geen gesloten hokjes laat. Wie echter in staat is een dergelijk model in zijn geheel uit te werken en te begrijpen, zou het overbodig vinden, omdat hij/zij dan het volledige systeem als geheel direct zou kunnen vatten.

We hopen dat de lezers van dit artikel zullen begrijpen dat wiskundige modellering een proces is dat voortdurend evolueert naarmate de voorspellingen van de modellen worden herhaald aan de hand van laboratoriumgegevens. De resultaten van de afgelopen drie decennia bij het modelleren van de dynamiek van de lac operon illustreren dit. De lezer zal zich ongetwijfeld ook realiseren dat elk model zijn positieve en negatieve aspecten heeft. De mate van detaillering van het model hangt af van de beschikbaarheid en kwaliteit van de data en ook van de vragen die we willen beantwoorden. Hoe meer details, hoe ingewikkelder het model zal zijn. Een wiskundige analyse is dan misschien moeilijk uit te voeren en de conclusies zijn mogelijk alleen gebaseerd op numerieke experimenten die velen, waaronder wij, niet bevredigend vinden. Aan de andere kant kan een eenvoudig model gemakkelijker te analyseren zijn en kan een wiskundige analyse meer inzicht geven in de dynamische eigenschappen of het onderliggende systeem, maar het kan te eenvoudig zijn en enkele belangrijke kenmerken van de realiteit niet vastleggen.

De kwestie van modelcomplexiteit is nauw verbonden met de kwestie van de dimensionaliteit van de parameterruimte, en dit is direct verbonden met een van de dilemma's waarmee elke modelleur wordt geconfronteerd. Hoe complexer het model, hoe meer parameters geschat moeten worden. Het is een gemeenplaats in de wiskundige biologie dat het bijna nooit mogelijk is om alle parameters in een model uit dezelfde laboratoriumomgeving te verkrijgen met dezelfde procedures en technieken en onderwerpen. Dus, aangezien het construeren van wiskundige modellen een kunst op zich is, kan hetzelfde worden gezegd voor parameterschatting. De senior auteur (M.C.M.) met meer dan 45 jaar ervaring in wiskundige biologie suggereert dat het moeilijkste deel van de modelleringsoefening het verkrijgen van fatsoenlijke parameterschattingen is.


Probleem bij het begrijpen van Operon - Biologie

U heeft een machinevertaling aangevraagd van geselecteerde inhoud uit onze databases. Deze functionaliteit is uitsluitend bedoeld voor uw gemak en is op geen enkele manier bedoeld om menselijke vertaling te vervangen. Noch BioOne, noch de eigenaren en uitgevers van de inhoud doen, en wijzen uitdrukkelijk af, enige uitdrukkelijke of impliciete verklaringen of garanties van welke aard dan ook, inclusief, maar niet beperkt tot, verklaringen en garanties met betrekking tot de functionaliteit van de vertaalfunctie of de nauwkeurigheid of volledigheid van de vertalingen.

Vertalingen worden niet bewaard in ons systeem. Uw gebruik van deze functie en de vertalingen is onderworpen aan alle gebruiksbeperkingen die zijn opgenomen in de gebruiksvoorwaarden van de BioOne-website.

De grote ideeën van de biologie onderwijzen met operon-modellen

1 Robert A. Cooper is biologieleraar aan Pennsbury High School, Fairless Hills, PA 19030 e-mail: . [email protected]

Inclusief PDF & HTML, indien beschikbaar

Dit artikel is alleen beschikbaar voor: abonnees.
Het is niet beschikbaar voor individuele verkoop.

Dit artikel presenteert een activiteit die leerlingen betrekt bij modelgebaseerd redeneren, vereisen dat ze het gedrag van de trp en lac operons onder verschillende milieu voorwaarden. Studenten krijgen zes scenario's voor de trp operon en vijf voor de lac operon. In de meeste scenario's, specifieke mutaties hebben plaatsgevonden in genetisch elementen van het systeem die het gedrag veranderen van de norm. Studenten worden ook uitgedaagd om hun begrip te relateren van operongedrag naar de "grote ideeën" van homeostase, evolutie, informatie, interacties, en opkomende eigenschappen. Door gebruik makend van operons om studenten te leren redeneren met modellen van complexe systemen en brede thema's begrijpen, wij uitrusten hen met krachtige vaardigheden en ideeën die een solide basis vormen voor hun toekomst leren in de biologie.


Computermethoden, deel C

Necmettin Yildirim, Caner Kazanci, in Methoden in Enzymologie, 2011

4 Een voorbeeld: Lactose-operon in E coli

We gebruiken het lactose-operon (de lac operon) van E coli en een aangepaste versie van het Yildirim-Mackey-model ( Mackey et al., 2004 Yildirim en Mackey, 2003 Yildirim et al., 2004 ) ontwikkeld voor dit bacteriële regulerende circuit om de methoden en analyses te demonstreren die in eerdere secties zijn beschreven. De lac operon is het klassieke voorbeeld van een induceerbaar circuit dat de genen codeert voor het transport van externe lactose in de cel en de omzetting ervan in glucose en galactose. Een cartoon die de belangrijkste componenten van dit circuit toont, wordt getoond in Fig. 12.9. Het moleculaire mechanisme van de lac operon werkt als volgt: De lac operon heeft een kleine promotor/operator regio (P en O) en drie grotere structurele genen lacZ, lacY, en lacA. Er is een regulerend gen lacik voorafgaand aan de lac operon. lacI is verantwoordelijk voor het produceren van een repressor (R ) eiwit. In aanwezigheid van allolactose wordt een binair complex gevormd tussen allolactose en de repressor dat binding van de repressor aan het operatorgebied onmogelijk maakt. In dat geval is het RNA-polymerase gebonden aan de promotor in staat om transcriptie van de structurele genen te initiëren om mRNA te produceren ( m). Bij afwezigheid van allolactose (EEN) het repressoreiwit R bindt aan de operator regio O en voorkomt dat het RNA-polymerase de structurele genen overschrijft. Zodra het mRNA is geproduceerd, begint het translatieproces. De lacZ-gen codeert voor het deel van het mRNA dat verantwoordelijk is voor de productie van β-galactosidase (B) en vertaling van de lacY-gen produceert het deel van mRNA dat uiteindelijk verantwoordelijk is voor de productie van een enzympermease (P). Het laatste deel van mRNA geproduceerd door transcriptie van de lacEen gen codeert voor de productie van thiogalactoside-transacetylase waarvan wordt gedacht dat het geen rol speelt bij de regulatie van de lac operon (Beckwith, 1987). Dit positieve controlesysteem werkt als volgt: Als er geen glucose beschikbaar is voor het cellulaire metabolisme, maar als lactose (L) beschikbaar is in een medium, wordt de lactose door het permease de cel in getransporteerd. Deze intracellulaire lactose wordt vervolgens afgebroken tot glucose, galactose en allolactose door β-galactosidase. De allolactose wordt ook door hetzelfde enzym omgezet in glucose en galactose β-galactosidase. De allolactose feeds terug om te binden met de lactose-repressor en het transcriptieproces mogelijk te maken dat de positieve feedbacklus voltooit.

Figuur 12.9 . Schematische weergave van het lactose-operon-regulatiesysteem. Zie de tekst voor details.

Yildirim et. al. (Mackey et al., 2004 Yildirim en Mackey, 2003) bedachten een wiskundig model dat rekening houdt met de dynamiek van het permease, interne lactose, β-galactosidase, de allolactose-interacties met de lac repressor en mRNA. Het uiteindelijke model bestaat uit vijf niet-lineaire differentiële vertragingsvergelijkingen met vertragingen als gevolg van het transcriptie- en translatieproces. We hebben dit model in deze studie aangepast en de vertragingsvoorwaarden geëlimineerd. Deze verandering reduceerde het oorspronkelijke model tot een vijfdimensionaal systeem van ODE's. De vergelijking van dit model wordt gegeven in Vgl. (12.25)–(12.29) . De geschatte waarden voor de modelparameters uit de gepubliceerde gegevens staan ​​vermeld in tabel 12.1. De details over de ontwikkeling van dit model en de schatting van de parameters zijn te vinden in Mackey et al. (2004), Yildirim en Mackey (2003), Yildirim et al. (2004) (Tabel 12.2).

Tabel 12.1 . De modelparameters geschat op basis van experimentele gegevens (van Yildirim en Mackey, 2003)

N2μmax3,47 × 10 − 2 min − 1
γm0,411 min − 1 γB8,33 × 10 − 4 min − 1
γEEN0,52 min − 1 Γ07,25 × 10 − 7 mm/min
K7200αm9,97 × 10 − 4 mm/min
KL11,81 mmαEEN1,76 × 10 4 min − 1
KEEN1,95 mmαB1,66 × 10 − 2 min − 1
γL0,0 min − 1 βEEN2,15 × 10 4 min − 1
αL2880 min − 1 KL9.7 × 10 − 4 m
KLe0,26 mmγP0,65 min − 1
βL21,76 × 10 4 min − 1 αP10.0 min − 1
K12.52 × 10 − 2 (M) − 2 βL12,65 × 10 3 min − 1
KL29.7 × 10 − 4 m

Tabel 12.2 . De vergelijkingen die de evolutie van de variabelen beschrijven m, B, L, EEN, en P in het Yildirim-Mackey-model voor de lac operon


Bekijk de video: Gene Regulation (Februari 2023).