Informatie

Waarom heeft T5-exonuclease geen endonuclease-activiteit in Gibson-assemblage?

Waarom heeft T5-exonuclease geen endonuclease-activiteit in Gibson-assemblage?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Gibson-assemblage gebruikt T5-exonuclease om het 5'-uiteinde van dsDNA terug te kauwen om overhangen te genereren. Er is echter gemeld dat T5-exonuclease, in tegenstelling tot lambda-exonuclease, ssDNA-endonuclease-activiteit heeft (//www.neb.com/products/m0363-t5-exonuclease#tabselect0). Waarom veroorzaakt hij geen problemen tijdens de montage van gibsons? Is het alleen omdat deze geen levensvatbare assemblages opleveren? Of is het omdat deze activiteit op de een of andere manier wordt geremd, zoals de T5-concentratie te laag is?


De bufferomstandigheden die bij de reactie worden gebruikt, verminderen ook de endonucleasereactie, dus het zou geen probleem moeten zijn als u zich precies aan de protocollen houdt. Ik heb sinds 1988 aan dit enzym gewerkt en was de oorspronkelijke "kloner" van de overproducer zie http://www.sayers.staff.shef.ac.uk/fen/ voor meer informatie over deze enzymen Jon Sayers, University of Sheffield .


Ik heb nog nooit een Gibson-assemblage gedaan, maar als ik de protocollen op de website van New England Biolabs bekijk, denk ik dat het antwoord moet zijn dat het ssDNA dat wordt blootgesteld door het T5-exonuclease snel wordt beschermd tegen de ssDNA-endonuclease-activiteit omdat het (de blootgestelde DNA) hybridiseert met de complementaire sequentie op de andere component van de assemblagereactie. Daarna worden eventuele gaten gerepareerd en verzegeld door DNA-polymerase en DNA-ligase. Al deze enzymen zijn natuurlijk tegelijkertijd aanwezig in de eenstaps-assemblagereactie.

Samengevat, onder de omstandigheden van de assemblagereactie, wordt de lage ssDNA-endonuclease-activiteit van het T5-exonuclease eenvoudigweg overtroffen door de andere reacties die plaatsvinden.


SRSF3 en SRSF7 moduleren 3′UTR-lengte door onderdrukking of activering van proximale polyadenylatieplaatsen en regulering van CFIm-niveaus

Alternatieve polyadenylatie (APA) verwijst naar de gereguleerde selectie van polyadenylatieplaatsen (PAS's) in transcripten, die de lengte van hun 3 'niet-vertaalde regio's (3'UTR's) bepaalt. We hebben onlangs aangetoond dat SRSF3 en SRSF7, twee nauw verwante SR-eiwitten, APA verbinden met mRNA-export. Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan APA-regulering door SRSF3 en SRSF7 bleef onbekend.

Resultaten

Hier combineren we iCLIP en 3'-end sequencing en ontdekken dat SRSF3 en SRSF7 stroomopwaarts van proximale PAS's (pPAS's) binden, maar ze oefenen tegengestelde effecten uit op de 3'UTR-lengte. SRSF7 verbetert het pPAS-gebruik op een concentratieafhankelijke maar splicing-onafhankelijke manier door de splitsingsfactor FIP1 te rekruteren, waardoor korte 3'UTR's worden gegenereerd. Eiwitdomeinen die uniek zijn voor SRSF7, die afwezig zijn in SRSF3, dragen bij aan FIP1-rekrutering. Daarentegen bevordert SRSF3 distaal PAS (dPAS) gebruik en dus lange 3'UTR's direct door SRSF7 tegen te gaan, maar ook indirect door hoge niveaus van splitsingsfactor Im (CFIm) te handhaven via alternatieve splicing. Bij uitputting van SRSF3 nemen de CFIm-niveaus af en worden 3'UTR's verkort. De indirecte SRSF3-doelen zijn bijzonder gevoelig voor lage CFIm-niveaus, omdat CFIm hier een dubbele functie heeft, het dPAS verbetert en pPAS-gebruik remt door onmiddellijk stroomafwaarts te binden en onproductieve splitsingscomplexen samen te stellen, die samen lange 3'UTR's bevorderen.

Conclusies

We laten zien dat SRSF3 en SRSF7 directe modulatoren zijn van pPAS-gebruik en laten zien hoe kleine verschillen in de domeinarchitectuur van SR-eiwitten tegengestelde effecten kunnen hebben op pPAS-regulatie.


MATERIALEN EN METHODES

Oligonucleotiden

Alle DNA-oligonucleotiden werden gekocht bij Integrated DNA Technologies met HPLC-zuivering. Oligonucleotiden werden opgelost in water van PCR-kwaliteit en DNA-concentraties werden gemeten met een NanoDrop 2000-spectrometer. De sequenties van de oligonucleotiden die in dit werk worden gebruikt, worden vermeld in de aanvullende informatie (aanvullende tabel S1).

Experimentele voorwaarden

Enzymdigestie-experimenten werden uitgevoerd bij 25°C. SELEX werd uitgevoerd bij kamertemperatuur (-20°C). Isotherme titratiecalorimetrie (ITC) experimenten werden uitgevoerd bij 23°C. Experimenten met elk aptameer maakten gebruik van de volgende reactiebuffers: ATP-aptameren (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2), MA-aptameren (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 20 mM NaCl, 5 mM MgCl2), MMC-aptameren (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 20 mM NaCl, 0,5 mM MgCl2), SCA2.1-aptameer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 20 mM NaCl, 0,5 mM MgCl2) en dopamine-aptameer (10 mM fosfaatbuffer, pH 7,4, 140 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM MgCl2). Voor experimenten met exonucleasen werd 0,1 mg/ml runderserumalbumine in de reactiebuffer opgenomen. Voor aptameerisolatie werd de volgende buffer gebruikt: 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 20 mM NaCl, 0,5 mM MgCl2.

Exonuclease-digestie-assays en gelelektroforese-analyse

Voor alle digestie-assays werd 1 l 50 M aptameer gemengd met 44 l reactiebuffer die de juiste concentratie van het doelwit bevatte. Na een uur incubatie werd 5 l 2 U/μl T5 Exo of 5 l van een mengsel van 2 U/μl T5 Exo en 0,15 U/μl Exo I aan de oplossing toegevoegd. Een hoeveelheid van 5 l van het reactiemengsel werd op verschillende tijdstippen verzameld en gemengd met 15 μl formamide-laadbuffer (75% formamide, 10% glycerol, 0,125% SDS, 10 mM EDTA en 0,15% (w/v) xyleencyaan ) om de reactie te blussen. Digestieproducten werden vervolgens geanalyseerd met 15% denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (PAGE). Scheiding werd uitgevoerd bij 20 V / cm gedurende 2, 5 - 3,5 uur in 0, 5 x TBE-buffer. De gel werd gekleurd met 1 x SYBR Gold gedurende 25 minuten en afgebeeld met behulp van een ChemiDoc MP Image-systeem (BioRad).

Op exonuclease gebaseerde analyses van fluorescentiemicrotiterplaten voor profilering

Een hoeveelheid van 1 l van 50 M MA-46 of 50 M MMC1, 25 M SCA2.1 of 25 M dopamine-aptameer werd gemengd met 44 l van hun respectieve reactiebuffer die een geschikte concentratie ligand bevatte. Voor de MA-46-kalibratiecurve werd 0, 25, 50, 100, 200, 400 en 800 M MDPV gebruikt (eindconcentratie). Voor aptameer-ligandprofileringsexperimenten werd 400, 200, 50 of 200 μM ligand gebruikt voor respectievelijk MA-46, MMC1, SCA2.1 of dopamine-aptamer (eindconcentratie) ligandvrije controles werden ook opgenomen. Voor screening van MMC-aptameren die mefedron binden, werd 0 of 200 μM mefedron gebruikt (eindconcentratie). Het aptamer en ligand werden 1 uur geïncubeerd. Vervolgens werd 5 l van een mengsel dat 2 U/μl T5 Exo en 0,15 U/μl Exo I bevatte aan de oplossing toegevoegd. Een tijdsverloop van fluorescentie werd geregistreerd gedurende 1,5 uur voor MA-46, 4 uur voor MMC1, 3 uur voor SCA2.1 of 2,5 uur voor dopamine-aptameer door 5 l van het op verschillende tijdstippen verzamelde reactiemengsel te mengen met 25 μl een afschrikoplossing (1,2 × SYBR Gold, 12 mM Tris-HCl (pH 7,4), 3,75 mM EDTA en 48% (v/v) formamide) vooraf geladen in de putjes van een zwarte 384 putjes microplaat. Fluorescentie-emissiespectra van 500 tot 800 nm en emissie bij 545 nm werden verkregen met behulp van een Tecan M1000 Pro-microplaatlezer met 495 nm-excitatie. De weerstand van een aptamer tegen vertering (weerstandswaarde) werd gekwantificeerd met behulp van de vergelijking (AUC1 – AUC0)/AUC0 waar AUC1 en AUC0 zijn de gebieden onder de curve van de fluorescentie tijdsverloop plots met en zonder ligand, respectievelijk. Kruisreactiviteit werd berekend met behulp van de vergelijking (AUCL – AUC0)/(AUCt – AUC0) × 100, waarbij AUCL en AUCt is de weerstand van aptameerdigestie in aanwezigheid van een bepaalde ligand en het belangrijkste doelwit van de aptamer (MDPV voor MA-46, mefedron voor MMC1, MDPV voor SCA2.1 en dopamine voor het dopaminebindende aptameer), respectievelijk.

Bepaling van kruisreactiviteit via strengverplaatsingsfluorescentietest

Ten eerste, om de concentratie van de complementaire DNA-streng te optimaliseren om aptameerfluorescentie met >90% te doven, 40 μl van verschillende concentraties (eindconcentraties: 0, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 nM) van een complementair DNA van 15 nt streng gelabeld met 3'-dabcyl (genaamd dab-15) werd gedurende 5 minuten bij 95°C geïncubeerd met 40 ul 5'-fluoresceïne-gelabeld MA-46 (MA-FAM) in reactiebuffer. Daarna werd de oplossing in 30 min afgekoeld tot kamertemperatuur. Een hoeveelheid van 75 l van deze oplossing werd in de putjes van een zwarte microtiterplaat met 384 putjes geladen. Fluorescentie-emissiespectra van 510 tot 800 nm werden opgenomen met excitatie bij 495 nm. Onder de geoptimaliseerde omstandigheden werd een 75 l-oplossing met MA-FAM en dab-15 (eindconcentraties van respectievelijk 50 en 100 nM) opgelost in reactiebuffer gedurende 5 minuten bij 95 ° C geïncubeerd en vervolgens gedurende 30 minuten afgekoeld tot kamertemperatuur . Vervolgens werd 5 l ligand (eindconcentratie: 400 M) aan de oplossing toegevoegd en 30 minuten geïncubeerd. Als controle werd een ligandvrije oplossing bereid. Daarna werd 75 l van de oplossing in de putjes van een zwarte microtiterplaat met 384 putjes geladen. De fluorescentie-emissiespectra werden opgenomen van 510 tot 800 nm met excitatie van 495 nm. Signaalversterking werd berekend met behulp van de vergelijking (FF0)/F0, waar F en F0 vertegenwoordigen fluorescentie-intensiteit in aanwezigheid en afwezigheid van ligand, respectievelijk. Kruisreactiviteit werd berekend met behulp van de vergelijking (SL/St) × 100, waar St is de signaalversterking geproduceerd door het hoofddoel van de aptamer (MDPV) en SL is de signaalversterking geproduceerd door een gegeven ligand.


Ontdek onze wetenschappelijke onderzoeksoplossing voor de studie van COVID-19

Soorten producten

Wij bieden geoptimaliseerde oplossingen voor life science-onderzoek

DNA-synthese is een technologie die deoxynucleïnezuren (adenine, thymine, cytosine en guanine) aan elkaar koppelt om DNA te vormen. Als hoeksteen van de moderne moleculaire biologie speelt DNA-synthese een centrale rol op het gebied van synthetische biologie. Naast de standaard synthese van oligo's, bieden we ook wetenschappelijke onderzoeksdiensten zoals synthese van lange oligo's, synthese van fosforthioaat-oligo's (S-Oligo), synthese van gemodificeerde oligo's, synthese van fluorescente oligo's en realtime kwantitatieve PCR-sondes om aan uw verschillende behoeften te voldoen.

Peptiden worden gesynthetiseerd door condensatiereactie van een carboxylgroep van een aminozuur met een aminogroep van een ander aminozuur en worden veel gebruikt op verschillende gebieden, zoals de bereiding van antilichamen, de ontwikkeling van geneesmiddelen en de ontwikkeling van polypeptidevaccins. Elk van onze polypeptiden gaat vergezeld van betrouwbare HPLC- en massaspectrometriegegevens, er worden gedetailleerde syntheserapporten verstrekt en de producten worden in gevriesdroogde staat verzonden. Ervaren medewerkers kunnen gebruikers helpen bij het ontwerpen van peptideketens en passende aanbevelingen doen voor verschillende behoeften van gebruikers, zoals antilichamen, speciale markers, grootschalige synthese, enz. Daarnaast bieden we ook aangepaste PNA-synthese met hoge kwaliteit.

Een peptidebibliotheek is een nieuwe techniek voor het bestuderen van de structuur-functierelatie voor een eiwit. Een peptidebibliotheek bevat een groot aantal peptiden die een systematische combinatie van aminozuren hebben. De peptidebibliotheek biedt een krachtig hulpmiddel voor het ontwerpen van geneesmiddelen, eiwit-eiwitinteracties en andere biochemische en farmaceutische toepassingen. Het heeft ook brede toepassingen in het screenen van geneesmiddelen, doelvalidatie, epitoopkartering en vaccinontwikkeling.

Gensynthese is een technologie die genen synthetiseert met kunstmatige methoden, wat een van de manieren is om genen te verwerven. Vergeleken met de verwerving van genen van bestaande organismen, heeft gensynthese geen sjablonen nodig en wordt daarom niet beperkt door de bron van genen. We gebruiken unieke ontwerpsoftware voor gensynthese, die een volledige set hulpmiddelen bevat om ideale structurele eenheden te ontwerpen, waardoor snelle en efficiënte genconstructie en synthese in één enkele reactie mogelijk is. Laat u niet beperken door restrictieplaatsen en polylinkers, we zullen de verschillende gensequenties die u nodig heeft synthetiseren.

Polymerasekettingreactie (PCR) is een veelgebruikte methode in de moleculaire biologie, die snel miljoenen tot miljarden specifieke DNA-monsters kan repliceren, waardoor wetenschappers slechts een kleine hoeveelheid DNA-monsters kunnen extraheren voor gedetailleerd onderzoek. We bieden een verscheidenheid aan DNA-polymerasen (Taq, Bst, Pfu) en bijbehorende PCR-premixen, die een breed scala aan scenario's dekken, zoals hoge betrouwbaarheid, hoge specificiteit en snelle amplificatie. Kits uit de Scarlet™-serie bieden een perfecte oplossing voor directe PCR in bloed, en PrimeSNP™ Genotyperingskit maakt gebruik van een competitieve allelspecifieke PCR-methode voor genotypering van gezuiverde DNA-monsters. Ook dNTP's en NTP's (set, mix) van hoge kwaliteit worden geleverd.

Ribonucleïnezuur (RNA), als een sleutelmateriaal voor genetische informatieoverdracht en celregulatie, is uitgebreid bestudeerd in de moleculaire biologie. Net als DNA wordt RNA geassembleerd in de vorm van nucleotideketens, maar in tegenstelling tot DNA bestaat RNA in de natuur in de vorm van enkelstrengs vouwen in plaats van gepaarde dubbele strengen. We bieden RNasin (RNase-remmer) en M-MLV reverse transcriptase om een ​​complete grondstofoplossing voor RNA-onderzoek te bieden. miAnalysis™-series zijn ontworpen voor kwantitatief microRNA-onderzoek. En de VirusMag™-serie is ontworpen voor de isolatie van viraal RNA/DNA of bacterieel DNA.

Bij SBS Genetech lopen we voorop in het aanbieden van oplossingen voor isotherme versterking op basis van ons platform van wereldklasse. Ons Bst DNA/RNA-polymerase vormt de kern van dit platform, dat een mengsel is van Bst-polymerase en extreem thermostabiele reverse transcriptase. Op basis van dit speciale enzym hebben we PrimeIamp TM gevriesdroogde isotherme amplificatie-microbeads-series ontwikkeld. Deze serie zijn kant-en-klare mastermixen, die de isotherme amplificatie direct kunnen uitvoeren wanneer de sjablonen en primers worden toegevoegd. Met vriesdroogtechnologie worden deze mastermixen gevriesdroogd tot vaste microbeads, die met groot gemak bij kamertemperatuur kunnen worden vervoerd en bewaard.

RNA-uitschakelingstechnologie is een krachtig hulpmiddel geworden om de functie van genen te bestuderen. Het succes van elk RNA-experiment hangt af van siRNA van hoge kwaliteit en een effectief transfectiereagens. Met chemische modificatie heeft ons chemisch gemodificeerde siRNA een veel hogere stabiliteit dan het gewone siRNA. De chemische modificatie verbetert niet alleen de levensduur van siRNA in serum en celcultuur, maar verbetert ook de activiteit ervan in vitro. Wat betreft transfectiereagens, ons gebruiksklare siRNA-transfectiereagens, Sirnafectamine, kan worden gebruikt voor een breed scala aan cellijnen, met minimale cytotoxiciteit en de beste celtoestand na transfectie. Aangezien Sirnafectamine RNA gedurende het hele proces zal beschermen, kan een zeer lage concentratie siRNA een hoge efficiëntie van genuitschakeling produceren.

Nucleïnezuurzuivering is een belangrijk onderdeel van de moleculaire biologie en heeft een breed scala aan toepassingen in de geneeskunde en biologische wetenschappen. Onze nucleïnezuurzuiveringskit maakt gebruik van eersteklas silicagelkolomtechnologie (SiMax™ Spin Column, SiMax™ Genomic DNA Extraction, SiMax™ PCR Products/Agarose Gel Purification, SiMax™ Plasmid DNA Miniprep) en magnetische kralentechnologie (VirusMag™ Magnetic Beads, VSep™ magnetische scheiders, VirusMag™ eenstaps DNA/RNA-isolatiekit, VirusMag™ DNA/RNA-isolatiekit), die snel en betrouwbaar DNA uit verschillende bronnen kunnen zuiveren. De zuiverheid van het door onze kit gezuiverde DNA is zeer hoog en het is geschikt voor vele downstream-toepassingen zoals sequentiebepaling, klonering en splitsing.

DNA-merkers worden gebruikt om de geschatte grootte van moleculen op de gel tijdens elektroforese te bepalen, gebaseerd op het principe dat het molecuulgewicht omgekeerd evenredig is met de mobiliteit door de gelmatrix. We bieden overvloedige DNA-molecuulgewichtstandaarden die kunnen worden gebruikt voor verschillende fragmentlengtes. Onze fragmenten van DNA-markers zijn afzonderlijk gezuiverd door gepatenteerde technologie, dus hun kwaliteit is superieur aan de industriestandaarden.

CRISPR (Cglanzend Rregelmatig linterspaced Short Palindroom Repeats) is een familie van DNA-sequenties die worden aangetroffen in de genomen van prokaryotische organismen zoals bacteriën en archaea. De op dit systeem gebaseerde genbewerkingstechnologie kent een breed scala aan toepassingen. Hier bieden we verschillende Cas-nucleasen, synthetische sgRNA's en T7-endonuclease I van hoge kwaliteit om de nauwkeurigheid en efficiëntie van uw experimenten te verbeteren.


Resultaten

Verwijdering en vervanging van restrictiesites met behulp van "Gibson Deletion"

Gibson-assemblage is een krachtige kloontechniek die littekenloze assemblage van stukjes DNA met homologe sequenties mogelijk maakt [4]. Hier hebben we deze kloneringsmethode uitgedaagd om DNA-stukken te assembleren met de homologe sequenties die aanwezig zijn op een bepaald aantal basen verwijderd van het DNA-uiteinde (Fig. 1). Met deze benadering zal een flap van niet-homologe sequentie worden gecreëerd en hoogstwaarschijnlijk verwijderd door de 3'- > 5'-exonuclease-activiteit van het Phusion-polymerase dat aanwezig is in de Gibson-mix (Fig. 1g en h). De opening wordt vervolgens opgevuld en geligeerd, wat resulteert in verlies van het DNA tussen de homologe sequenties en het uiteinde van het DNA. We hebben deze aanpak getest met behulp van een klein plasmide met een lage complexiteit (pUC19) en hebben geprobeerd een restrictieplaats te verwijderen (KpnL/acc65I) en vervang deze door een andere (AflII) (afb. 2). Om te testen of Gibson Deletion een duidelijke voorkeur voor een specifieke overhang vertoont, gebruikten we twee enzymen die dezelfde DNA-sequentie herkennen maar tegengestelde overhangen produceren (neoschizomeren): een 5'-overhang met acc65I en een 3′ overhang met KpnI. Deze enzymen knippen het plasmide in het 5'-uiteinde van het gecodeerde β-galactosidase-enzym, dat we gebruikten voor het screenen van de kloneringsproducten. We hebben de . vervangen KpnL/acc65Ik site met een AflII-site met Gibson Deletion. In het bijzonder gebruikten we dubbelstrengs DNA-stukken (gegloeide oligo's) evenals enkelstrengs oligo's als donor-DNA voor de assemblage. Het donor-DNA bevat een AflII-restrictieplaats geflankeerd door 20 nucleotiden aan elke kant, homoloog aan pUC19-DNA, dat de KpnL/acc65I-site (Fig. 2a, rode en gele vakken). Zowel voorwaartse als achterwaartse oriëntaties werden getest toen we enkelstrengs donor-DNA gebruikten (Fig.2b).

Vergelijking van klassieke Gibson en Gibson Deletion montage. Tijdens de Gibson-reactie kunnen twee stukken lineair DNA met homologe sequenties aan hun uiteinde recombineren tot een geassembleerd DNA (linkerpaneel). Een 5'- > 3'-exonuclease (T5) kauwt de DNA-uiteinden terug en legt de homologe sequenties (oranje en gele lijnen) bloot en kan vervolgens uitgloeien (een-B). Een Phusion DNA-polymerase verlengt het DNA vanaf de 3'-uiteinden (C) en een Taq-ligase zal de inkepingen (NS). Gibson-deletie (rechterpaneel) is een alternatieve toepassing van de klassieke Gibson-assemblagemethode die profiteert van de homologe sequenties die meerdere basen verwijderd zijn van de DNA-uiteinden (e rood en geel = homoloog DNA blauw en bruin = niet-homoloog DNA). Dit maakt het verwijderen van de niet-homologe sequenties en assemblage van de twee lineaire stukken mogelijk (F-H). Het gecreëerde flap-DNA (G, bruine lijn) wordt hoogstwaarschijnlijk verwijderd door de 3'- > 5'-exonuclease-activiteit van de Phusion-polymerase in de Gibson-mix en de inkeping ingevuld en geligeerd

Gibson-verwijdering testen. een pUC19-plasmide werd geknipt met Kpnik of ik acc65I en deze restrictieplaatsen aanwezig aan het 5'-uiteinde van het β-galactosidase-gen werden vervangen door een AflII restrictieplaats met behulp van Gibson Deletion. De rode en gele vakken vertegenwoordigen de homologe sequenties van elk 20 nucleotiden. Een afbeelding van blauwe (waarschijnlijk succesvolle Gibson Deletion) en witte (mislukte Gibson Deletion) bacteriekolonies getransformeerd met Gibson Deletion-producten wordt getoond. B In de linkerschema's wordt het DNA weergegeven dat aan elke Gibson-deletiereactie is toegevoegd. De tabel vermeldt het aantal witte of blauwe kolonies na transformatie en uitplaten van elke Gibson-deletiereactie. Het aantal correcte klonen na diagnostisch knippen en Sanger-sequencing wordt vermeld in de laatste kolommen. De resultaten van twee onafhankelijke experimenten worden getoond

Om te bepalen of de Gibson-deletie correct plaatsvond, voerden we eerst een kwalitatieve observatie uit van de kolonies die waren uitgeplaat op media aangevuld met X-gal, een substraat van -galactosidase-enzym. Omdat we een restrictieplaats van 6 nucleotiden hebben vervangen (KpnL/acc65I) met een andere restrictieplaats van 6 nucleotiden (AflII), bleef het β-galactosidase-enzym actief ondanks de kleine verandering in de nucleotidesequentie. Bijgevolg zouden kolonies die een plasmide met correcte Gibson-deletie tot expressie brengen, blauw moeten lijken, aangezien het -galactosidase-enzym het X-gal-substraat verwerkt (Fig. 2a). Vervolgens hebben we een diagnostische snede van het DNA uitgevoerd met Kpnik en AflII. Om de directe observatie van correcte DNA-banden op een gel te vereenvoudigen, hebben we uitgevoerd AflII of KpnIk verteer samen met XmnI (Extra bestand 2: Figuur S1). Een subset van succesvolle producten werd ook door Sanger gesequenced om de juiste montage te verifiëren.

Gibson Deletion werd uitgevoerd door de vector te knippen met KpnI (Fig. 2b, behandeling 1, 3, 5, 7) of acc65I (Fig. 2b, behandeling 2, 4, 6, 8) in aanwezigheid van alkalische fosfatase (CIP) uit de darm. Complementaire gegloeide oligo's (Fig. 2b, behandeling 3 en 4) of enkelstrengs DNA-oligo's (Fig. 2b, behandeling 5-8) werden gebruikt als donor-DNA. Als controles werden de geknipte vectoren gebruikt voor Gibson-deletie in afwezigheid van donor-DNA (Fig. 2b, behandeling 3, 5, 7), of dezelfde geknipte vectoren werden direct getransformeerd in competente cellen zonder Gibson-reactie. Deze laatste behandeling is een betere controle omdat het de meting mogelijk maakt van het ongeknipte plasmide dat aanwezig is in de Gibson-reactie.

De resultaten laten zien dat Gibson-deletie een zeer efficiënte kloneringsmethode is, aangezien de kolonies overweldigend blauw waren (meer dan 94% voor alle omstandigheden, Fig. 2) en de achtergrond van het ongeknipte plasmide (directe transformatie van gesneden plasmide) erg laag was. Bovendien vertonen de meeste geanalyseerde kolonies een correcte substitutie van Kpnik plaats met een AflII-site (afb. 2b-tabel en aanvullend bestand 2: figuur S1). Verder zagen we geen voorkeur van 5' boven 3' overhang voor de Gibson-deletie (Fig. 2b, behandelingen 3, 5, 7 versus 4, 6, 8). Interessant is dat enkelstrengs oligo's, zonder voorkeur voor de voorwaartse of achterwaartse streng, even efficiënt zijn als dubbelstrengs gegloeide oligo's wanneer ze worden gebruikt als donor-DNA (Fig. 2b, behandeling 3,4 versus 5-8).

Het omzetten van een restrictieplaats in een andere is soms nodig om een ​​restrictieplaats uniek te maken of om een ​​nieuwe unieke restrictieplaats te creëren die geschikt is voor het volgen van kloneringsstappen. Deze schijnbaar gemakkelijke taken vereisen vaak een moeizame procedure met behulp van standaard kloonprocedures. We hebben daarom onze Gibson Deletion-aanpak voor deze toepassingen getest met behulp van het pUC19-plasmide dat twee bevat PvuII-sites en drie Nspik plaatsen. Gibson-verwijdering werd uitgevoerd met behulp van enkelstrengige oligo's die er één zouden behouden PvuII site en muteren de tweede in an AflII-site (Fig. 3a, bovenpaneel). De vector werd 's nachts gesneden met PvuII in aanwezigheid van kalverdarmfosfatase (CIP) en het digestieproduct werd eenvoudig gezuiverd op een PCR-zuiverings- en concentratiekolom. Gibson-deletie werd uitgevoerd in een enkele reactie waarbij de gezuiverde knipvector en de twee enkelstrengs DNA-oligonucleotiden werden gemengd met het Gibson-reactiemengsel (Fig. 3b en aanvullend bestand 3: Figuur S2).

Gebruik van Gibson Deletion om een ​​restrictiesite te wijzigen, te verwijderen of te onderhouden. een Schematische weergave van de twee groepen wijzigingen die zijn geïntroduceerd in pUC19 met behulp van Gibson Deletion: top = maken PvuII site uniek verandert een site in een AflII site en onderhoud de andere PvuII site onderaan = maken NspI site uniek een site verwijderen, een tweede site onderhouden en een derde wijzigen Nspik site in een AflII plaats. B Resultaten van het klonen afgebeeld in een

Een vergelijkbare procedure werd geïmplementeerd met behulp van een gezuiverde kolom NspI pUC19-vector en enkelstrengige oligo's die één zouden behouden NspIk plaats, elimineer een seconde NspIk plaats, en muteer de derde Nspik site in een AflII site (Fig. 3a bodempanelen). Om de juiste assemblage te verifiëren, isoleerden we het DNA en sneden het met PvuII en Xmnik of ik AflII en XmnIk voor de pUC19 met gewijzigd PvuII sites (groep 1), en met Nspik en Ndeik of ik AflII en XmnIk voor de pUC19 met gewijzigd NspI-sites (groep 2). Van de 19 geanalyseerde kolonies vertoonden 4 correcte assemblage voor groep 1 van de 13 geanalyseerde kolonies, vertoonden 9 correcte verteringspatronen voor groep 2. We hebben de assemblages ook geverifieerd door middel van Sanger-sequencing die meestal correcte assemblages liet zien (Fig. 3b en aanvullend bestand 3: Figuur S2).

Over het algemeen hebben we aangetoond dat Gibson-assemblage ook kan worden toegepast op DNA dat homologe sequenties bevat die niet direct het DNA-uiteinde flankeren. Deze benadering, genaamd "Gibson Deletion", produceert efficiënt geassembleerd DNA dat is uitgeput van de niet-homologe regio's tussen de homologe sequenties en het DNA-uiteinde. Gibson Deletion kan daarom worden gebruikt om restrictiesites eenvoudig en efficiënt te wijzigen, te onderhouden of te verwijderen.

Deletie van toenemende hoeveelheid DNA met Gibson-deletie

We hebben aangetoond dat Gibson Deletion de verwijdering/substitutie van een restrictieplaats mogelijk maakt. Vervolgens wilden we testen hoeveel DNA kan worden verwijderd met Gibson Deletion. Hiertoe werden negen enkelstrengs donor-DNA-oligo's ontworpen, met elk homologe sequenties met de ontvangende vector op een toenemend aantal nucleotiden verwijderd van het DNA-uiteinde (Fig. 4a). Deze oligo's zijn ontworpen om 0 te verwijderen (exacte complementariteit met de sequenties die de KpnIk heb de site zojuist vervangen door een AflII-site), 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 en 100 nucleotiden van elk uiteinde van een KpnIk heb gesneden (Fig. 4a). Elke oligo vervangt ook de Kpnik plaats met een AflII-plaats (Fig. 4a). Als controle werd de geknipte vector in afwezigheid van donor-DNA gebruikt voor de Gibson-reactie. Om een ​​eerste kwalitatieve test uit te voeren van het succes van de assemblage, telden we het aantal kolonies dat groeide op mediaplaten aangevuld met de juiste selectie-antibiotica (Carbenicilline). Een groot aantal kolonies op de plaat duidt op een grotere kans op een succesvolle Gibson-reactie, omdat dit betekent dat het insert en de vector zijn geassembleerd (Fig. 4b en c). Deze veronderstelling wordt bevestigd door het beperkte aantal kolonies dat aanwezig is op de controleplaat na transformatie van alleen de gesneden vector (achtergrond van ongeknipt plasmide). Voor een meer uitgebreide analyse van de juiste assemblage werden 8 kolonies uit elke plaat geplukt en het DNA werd geïsoleerd en met beide geknipt Kpnik en AflII om te bepalen of de AflII-site correct is vervangen door de KpnIk plaats na succesvolle Gibson-reactie (Fig. 4d, e en aanvullend bestand 4: Figuur S3). Van de succesvolle assemblages werden er twee tot vijf door Sanger gesequenced om de correcte montage verder te bevestigen.

Het verhogen van deleties met behulp van Gibson-reactie. een pUC19-plasmide werd geknipt met KpnIk en deze restrictiesite zijn vervangen door een AflII-site met Gibson Deletion. Enkelstrengs oligo's werden gebruikt als AflII site donor-DNA voor Gibson-reactie. De gebruikte oligonucleotiden waren ontworpen om 0, 10 (5 aan elke kant), 20 (10 aan elke kant), 30 (15 aan elke kant), 40 (20 aan elke kant), 50 (25 aan elke kant), 60 (30 aan elke kant), 80 (40 aan elke kant), 100 (50 aan elke kant) en 200 (100 aan elke kant) nucleotiden die de KpnL/AflII plaatsen. De rode en gele lijnen en vakken vertegenwoordigen homologe sequenties van 20 nt op de enkelstrengs oligonucleotiden (gele en rode lijnen) en op de vector (gele en rode vakken). B-C Na Gibson-reactie werd elk monster getransformeerd en 1/10 of 9/10 van de getransformeerde bacteriën werd uitgeplaat op LB-platen die waren aangevuld met carbenicilline. De tabel vermeldt het aantal groeiende kolonies voor elke reactie, ook weergegeven in de staafgrafiek in C. d-e Aantal juiste klonen na diagnostisch knippen met Kpnik en Aflik (NS) of na Sanger-sequentie van een subset van monsters (e)

De resultaten van de diagnostische snede (aanvullend bestand 4: figuur S3) laten zien dat, naarmate een groter aantal nucleotiden wordt verwijderd uit beide DNA-uiteinden van de vector, de Gibson-deletiereactie, zoals verwacht, in efficiëntie afneemt, zelfs als een goede hoeveelheid (66 kolonies) kolonies kon nog steeds worden gevonden om op platen te groeien met selectie na verwijdering van 200 nucleotiden (100 van elke kant van de nieuwe AflII restrictieplaats) (Fig. 4b en c). Na diagnostisch knippen en kwantificering van KpnL-AflII-substitutie, verwijdering van maximaal 100 nucleotiden (50 aan elke kant) toonde een succespercentage van meer dan 75% (behalve de verwijdering van 60 nucleotiden die in het gepresenteerde experiment slechts een succespercentage van 37,5% laat zien, hoogstwaarschijnlijk vanwege de kleine steekproefomvang ) (Fig. 4d). Toen werd geprobeerd 200 nucleotiden te verwijderen, vertoonden slechts 2 van de 8 klonen KpnL-AflII substitutie (25% slagingspercentage). Dit geeft aan dat deletie van meer dan 100 nucleotiden (50 van elke kant) door Gibson Deletion een lagere efficiëntie heeft.

DNA dat liet zien KpnL-AflII-substitutie werd gesequenced door Sanger om te bevestigen dat een correcte Gibson-assemblage plaatsvond. Sanger-sequencing toonde aan dat het niet per se waar was dat hoe meer DNA werd verwijderd, hoe minder fouten er door de assemblage werden geïntroduceerd. Voor de 10 (5 aan elke kant), 20 (10 aan elke kant), 60 (30 aan elke kant) en 100 (50 aan elke kant) nucleotide-deleties, bleken ten minste twee van de klonen waarvan de sequentie was bepaald de juiste sequentie te hebben . De onjuiste samenstellingen waren vaak onjuist vanwege een extra verwijderde nucleotide voor of na de ingevoegde AflII plaats. Beide klonen waarvan de sequentie werd bepaald voor de meer uitgebreide deletie (200 nucleotiden rond de restrictiesnede) vertoonden echter de juiste assemblage (figuur 4e).

Over het algemeen laten deze resultaten zien dat honderden nucleotiden gemakkelijk kunnen worden verwijderd rond een restrictieplaats met behulp van enkelstrengs DNA in een Gibson-deletiereactie. Zoals verwacht wordt een afname in efficiëntie waargenomen bij reacties die gericht zijn op het verwijderen van meer dan 100 nucleotiden.

Deletie van toenemende hoeveelheid DNA en gelijktijdige insertie van complex DNA

Om de efficiëntie van Gibson-deletie te testen met behulp van complexer DNA als donor-DNA in plaats van korte oligonucleotiden, hebben we Gibson-assemblage uitgevoerd met behulp van een cassette voor RFP-expressie (rood fluorescerend eiwit). PCR van de RFP-cassette werd uitgevoerd met behulp van een plasmide-sjabloon en primers die homologiearmen bevatten die complementair zijn aan DNA dat de flankeert KpnI-plaats op het pUC19-plasmide. Er zijn verschillende primers ontworpen om toenemende hoeveelheden DNA aan de flanken van de te verwijderen KpnIk plaats op Gibson-deletiereactie (Fig. 5a en aanvullend bestand 1). Bacteriële kolonies die grote hoeveelheden RFP-eiwit tot expressie brengen (zoals voor de expressie van plasmiden met een hoog aantal kopieën als pUC19) kunnen gemakkelijk worden gescreend als rode kolonies op platen. Daarom is de RFP-cassette gekozen als een eenvoudige manier om kolonies te screenen die plasmiden tot expressie brengen die zijn samengesteld met een correcte Gibson-reactie (Fig. 5b). Inbrengen van de RFP-cassette en gelijktijdige deletie van maximaal 60 nucleotiden die de flankeren KpnI restrictieplaats (30 nucleotiden aan elke kant van de KpnI-site) met Gibson Deletion produceerde meer dan 90% rode kolonies (Fig. 5c). Voor een deletie van 200 nucleotiden (100 aan elke kant) groeiden er echter weinig getransformeerde kolonies op selectieplaten en slechts 8,3% van de kolonies was rood (Fig. 5c).

Deletie van toenemende hoeveelheid DNA en gelijktijdige insertie van complex DNA. een Schema van de assemblagebenadering gevolgd voor de gepresenteerde experimenten. Een pUC19-plasmide werd geknipt met KpnI, en een RFP-cassette werd geïntroduceerd in de gesneden vector met behulp van Gibson-assemblage. De verschillende inserts werden geproduceerd met behulp van PCR, elk met verschillende primers met verschillende homologe schade om toenemende hoeveelheden nucleotiden rond de KpnIk plaats op Gibson Deletion-reactie. De RFP-cassettes waren ontworpen om 20 nucleotiden homologie te hebben met het plasmide (weergegeven door de rode en gele lijnen en vakken). De RFP-primers zijn ontworpen om 0, 10 (5 aan elke kant), 20 (10 aan elke kant), 30 (15 aan elke kant), 40 (20 aan elke kant), 50 (25 aan elke kant), 60 (30 aan elke kant) en 200 (100 aan elke kant) nucleotiden rond de Kpnik plaats. B De Gibson-reacties werden getransformeerd en uitgeplaat op carbenicillineplaten (1/10 of 9/10 van het transformatiemengsel). Kolonies die DNA uitdrukken en die waarschijnlijk een succesvolle assemblage hebben ondergaan, lijken rood vanwege de expressie van de ingevoegde RFP. Een verkeerde montage zou resulteren in een witte kolonie. C Het aantal rode versus witte kolonies werd geteld en geregistreerd. NS Aantal correcte klonen na Sanger-sequencing. Gibson-verwijderingsreacties werden uitgevoerd met een incubatie van 50 ° C gedurende 30 minuten of met een pre-incubatie bij 37 ° C gedurende 30 minuten vóór een incubatie van 50 ° C gedurende nog eens 30 minuten

Sequentiebepaling van de plasmiden die uit de rode kolonies waren teruggewonnen, toonde aan dat na Gibson-deletie het grootste deel van het DNA correct werd geassembleerd (figuur 5d). Deletie van 200 nucleotiden rond de KpnI-sites leverden geen correcte integratie van de RFP-cassette op. Hoewel we in staat waren om rode kolonies te verkrijgen van deze meer uitdagende assemblage, onthulde Sanger-sequencing van de RFP-flankerende sequenties alleen correcte deleties aan één kant (5'-uiteinde of 3'-uiteinde) van de RFP en gedeeltelijke of geen deletie aan de andere kant van de RFP-cassette. Sommige klonen vertoonden ook nieuwe inserties tussen de RFP-cassette en de verwijderde sequenties (aanvullend bestand 5: figuur S4). Op basis van deze resultaten hebben we ook getest of een incubatie van de Gibson-reactie bij 37 ° C voorafgaand aan incubatie bij 50 ° C (zie methoden) de efficiëntie van Gibson Deletion verhoogde. De optimale temperatuur van de T5-exonuclease, die nodig is om de homologe sequenties bloot te leggen voordat ze worden uitgegloeid, is 37 ° C en daarom veronderstelden we dat een pre-incubatie bij 37 ° C het terugkauwen zou verhogen, waardoor mogelijk het succes van Gibson Deletion-assemblages zou toenemen, vooral voor de reactie met langere sequenties moet worden verwijderd. Gibson-deletiereacties werden daarom 30 minuten bij 37 ° C geïncubeerd voordat ze gedurende 30 minuten bij 50 ° C werden geïncubeerd. De pre-incubatie bij 37 ° C verbeterde de Gibson Deletion-reactie niet en het verminderde zelfs het aantal correcte assemblages zoals bepaald door DNA-sequencing van de verkregen plasmiden nadat de Gibson Deletion-reactie parallel was uitgevoerd met of zonder de 37 ° C pre-incubatie ( Afb. 5d).

Over het algemeen laten onze resultaten zien dat Gibson-deletie kan worden toegepast voor de gelijktijdige deletie van DNA en de assemblage van complex DNA, waarbij de efficiëntie van de assemblage afneemt met toenemende hoeveelheden verwijderd DNA.


Gepubliceerd door de Royal Society onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, die onbeperkt gebruik toestaat, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en bron worden vermeld.

Referenties

. 2006 High-throughput biologie in het postgenomische tijdperk. J. Vasc. interv. Radiol . 17, 1077-1085. (doi:10.1097/01.rvi.0000228840.12260.ff) Crossref, PubMed, Google Scholar

Cameron DE, Bashor CJ, Collins JJ

. 2014 Een korte geschiedenis van synthetische biologie. nat. Rev. Microbiol . 12, 381-390. (doi:10.1038/nrmicro3239) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2006 High-throughput fluorescentiemicroscopie voor systeembiologie. nat. ds. Mol. cel bio . 7, 690-696. (doi:10.1038/nrm1979) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2012 Strategieën voor de productie van actieve eukaryote eiwitten in het bacteriële expressiesysteem. Aziatische Pac. J. Trop. biomed. 2, 159-162. (doi:10.1016/S2221-1691(11)60213-X) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2014 Recombinante eiwitexpressie in Escherichia coli: vooruitgang en uitdagingen . Voorkant. microbiologisch . 5, 172. (doi:10.3389/fmicb.2014.00172) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2001 High-throughput proteomics: eiwitexpressie en -zuivering in de postgenomische wereld. Eiwit Expr. Purif . 22, 159-164.(doi:10.1006/prep.2001.1465) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2000 Ontwerp van high-throughput methoden voor eiwitproductie voor structurele biologie. Structuur 8, R177–R185. (doi:10.1016/S0969-2126(00)00193-3) Crossref, PubMed, Google Scholar

Vincentelli R, Cimino A, Geerlof A, Kubo A, Satou Y, Cambillau C

. 2011 High-throughput eiwitexpressie screening en zuivering in Escherichia coli . Methoden: 55, 65-72. (doi:10.1016/j.ymeth.2011.08.010) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2011 High-throughput constructie en kleinschalige expressie screening van multi-tag vectoren in Escherichia coli . Methoden: 55, 29–37. (doi:10.1016/j.ymeth.2011.08.002) Crossref, PubMed, Google Scholar

Mlynek G, Lehner A, Neuhold J, Leeb S, Kostan J, Charnagalov A, Stolt-Bergner P, Djinovic-Carugo K, Pinotsis N

. 2014 Het centrum voor geoptimaliseerde structurele studies (COSS) platform voor automatisering bij het klonen, expressie en zuivering van afzonderlijke eiwitten en eiwit-eiwitcomplexen. Aminozuren 46, 1565-1582. (doi:10.1007/s00726-014-1699-x) Crossref, PubMed, Google Scholar

Dieckman L, Gu M, Stols L, Donnelly MI, Collart FR

. 2002 High-throughput-methoden voor genklonering en -expressie. Eiwit Expr. zuiver. 25, 1-7. (doi:10.1006/prep.2001.1602) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2013 De RNA-polymerasefabriek en archaeale transcriptie. Chem. Rev . 113, 8350-8376. (doi:10.1021/cr400148k) Crossref, PubMed, Google Scholar

Jia B, Li Z, Liu J, Zon Y, Jia X, Xuan YH, Zhang J, Jeon CO

. 2015 Een zinkafhankelijk protease AMZ-tk van een thermofiele archaeon is een nieuw lid van de archaemetzincine-eiwitfamilie. Voorkant. microbiologisch. 6, 1380. (doi:10.3389/fmicb.2015.01380) Crossref, PubMed, Google Scholar

Jia B, Liu J, Van Duyet L, Sun Y, Xuan YH, Cheong GW

. 2015 Proteoomprofilering van hitte-, oxidatieve en zoutstressreacties in Thermococcus kodakarensis KOD1 . Voorkant. microbiologisch. 6, 605. (doi:10.3389/fmicb.2015.0605) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2013 Multifunctionele enzymen in archaea: promiscuïteit en maanlicht. Extremofielen 17, 193-203. (doi:10.1007/s00792-012-0509-1) Crossref, PubMed, Google Scholar

Holz C, Lueking A, Bovekamp L, Gutjahr C, Bolotina N, Lehrach H, Cahill DJ

. 2001 Een menselijke cDNA-expressiebibliotheek in gist verrijkt voor open leeskaders. Genoom Res . 11, 1730-1735. (doi:10.1101/gr.181501) Crossref, PubMed, Google Scholar

Büssow K, Nordhoff E, Lubbert C, Lehrach H, Walter G

. 2000 Een menselijke cDNA-bibliotheek voor screening op eiwitexpressie met hoge doorvoer. genomica 65, 1–8. (doi:10.1006/geno.2000.6141) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2004 Vele paden naar veel klonen: een vergelijkende kijk op kloonmethoden met hoge doorvoer. Genoom Res . 14, 2020-2028. (doi:10.1101/gr.2528804) Crossref, PubMed, Google Scholar

Cao Y, Sun J, Zhu J, Li L, Liu G

. 2010 PrimerCE: ontwerpen van primers voor klonen en genexpressie. Mol. Biotechnologie . 46, 113-117. (doi:10.1007/s12033-010-9276-3) Crossref, PubMed, Google Scholar

Camilo CM, Lima GM, Maluf FV, Guido RV, Polikarpov I

. 2015 HTP-OligoDesigner: een online tool voor het ontwerpen van primers voor het klonen van genen met hoge doorvoer en plaatsgerichte mutagenese. J. Computer. Biol . 23, 27-29. (doi:10.1089/cmb.2015.0148) Crossref, PubMed, Google Scholar

Otto P, Larson B, Krueger S

. 2002 Geautomatiseerde high-throughput zuivering van PCR-producten met behulp van Wizard® MagneSil™ paramagnetische deeltjes. J. Lab. automatisch . 7, 120-124. (doi:10.1016/s1535-5535-04-00232-1) Google Scholar

Xiong AS, Yao QH, Peng RH, Duan H, Li X, Fan HQ, Cheng ZM, Li Y

. 2006 PCR-gebaseerde nauwkeurige synthese van lange DNA-sequenties. nat. protocol . 1, 791-797. (doi:10.1038/nprot.2006.103) Crossref, PubMed, Google Scholar

Yehezkel TB, Linshiz G, Buaron H, Kaplan S, Shabi U, Shapiro E

. 2008 nieuw DNA-synthese met behulp van PCR met één molecuul. Nucleïnezuren Res. 36, e107. (doi:10.1093/nar/gkn457) Crossref, PubMed, Google Scholar

Klein JC, Lajoie MJ, Schwartz JJ, Strauch EM, Nelson J, Baker D, Shendure J

. 2016 Multiplex paarsgewijze assemblage van array-afgeleide DNA-oligonucleotiden. Nucleïnezuren Res . 44, e43. (doi:10.1093/nar/gkv1177) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2014 Grootschalig de novo DNA-synthese: technologieën en toepassingen. nat. Methoden: 11, 499-507. (doi:10.1038/nmeth.2918) Crossref, PubMed, Google Scholar

Quan J, Saaem I, Tang N, Ma S, Negre N, Gong H, Witte KP, Tian J

. 2011 Parallelle on-chip gensynthese en toepassing op optimalisatie van eiwitexpressie. nat. Biotechnologie . 29, 449–452. (doi:10.1038/nbt.1847) Crossref, PubMed, Google Scholar

2015 Codonoptimalisatie is een belangrijke determinant van mRNA-stabiliteit. Cel 160, 1111-1124. (doi:10.1016/j.cell.2015.02.029) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Festa F, Steel J, Bian X, Labaer J

. 2013 High-throughput klonen en creatie van expressiebibliotheken voor functionele proteomics. Proteomics 13, 1381-1399. (doi:10.1002/pmic.201200456) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2009 High-throughput eiwitproductie (HTPP): een overzicht van ondersteunende technologieën om de eiwitproductie te versnellen. Methoden Mol. Biol. 498, 1-18. (doi:10.1007/978-1-59745-196-3_1) Crossref, PubMed, Google Scholar

Blommel PG, Martin PA, Wrobel RL, Steffen E, Fox BG

. 2006 Zeer efficiënte productie in een enkele stap van expressieplasmiden uit cDNA-klonen met behulp van het Flexi Vector-kloneringssysteem. Eiwit Expr. Purif . 47, 562-570. (doi:10.1016/j.pep.2005.11.007) Crossref, PubMed, Google Scholar

2008 Exploratie van humaan ORFeome: high-throughput voorbereiding van ORF-klonen en efficiënte karakterisering van hun eiwitproducten. DNA-onderzoek . 15, 137-149. (doi:10.1093/dnares/dsn004) Crossref, PubMed, Google Scholar

Engler C, Kandzia R, Marillonnet S

. 2008 Een één-pot, één stap, nauwkeurige kloonmethode met hoge doorvoercapaciteit. PLoS ONE 3, e3647. (doi:10.1371/journal.pone.0003647) Crossref, PubMed, Google Scholar

Whitman L, Gore M, Ness J, Theodorou E, Gustafsson C, Minshull J

. 2013 Snelle, littekenloze klonering van genfragmenten met behulp van het electr-vectorsysteem. Genet. Ing. Biotechnologie . 33, 42. (doi:10.1089/gen.33.11.20) Google Scholar

Chen WH, Qin ZJ, Wang J, Zhao GP

. 2013 De MASTER (methylation-assisted tailorable ends rational) ligatiemethode voor naadloze DNA-assemblage. Nucleïnezuren Res. 41, e93. (doi:10.1093/nar/gkt122) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2015 Recente ontwikkelingen in DNA-assemblagetechnologieën. FEMS Gist Res . 15, 1–9. (doi:10.1111/1567-1364.12171) PubMed, Google Scholar

Esposito D, Garvey LA, Chakiath CS

. 2009 Gateway-klonering voor eiwitexpressie. Methoden Mol. Biol. 498, 31-54. (doi:10.1007/978-1-59745-196-3_3) Crossref, PubMed, Google Scholar

Cheo DL, Titus SA, Byrd DRN, Hartley JL, Temple GF, Brasch MA

. 2004 Gecoördineerde assemblage en klonering van meerdere DNA-segmenten met behulp van in vitro plaatsspecifieke recombinatie: functionele analyse van expressieklonen met meerdere segmenten. Genoom Res . 14, 2111-2120. (doi:10.1101/gr.2512204) Crossref, PubMed, Google Scholar

Zhang Y, Werling U, Edelmann W

. 2012 SLiCE: een nieuwe op bacteriële celextracten gebaseerde DNA-kloneringsmethode. Nucleïnezuren Res. 40, e55. (doi:10.1093/nar/gkr1288) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2015 Een eenvoudige en efficiënte naadloze DNA-kloneringsmethode met SLiCE van Escherichia coli laboratoriumstammen en de toepassing ervan op SLiP-plaatsgerichte mutagenese. BMC Biotechnologie . 15, 47. (doi:10.1186/s12896-015-0162-8) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2015 Evaluatie van bereidingsmethoden voor extracten van naadloze ligatieklonen van een Escherichia coli laboratorium stam. Anaal. biochemisch . 486, 51-53. (doi:10.1016/j.ab.2015.06.031) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2015 Een eenvoudig en ultra-goedkoop zelfgemaakt naadloos ligatiekloneringsextract (SLiCE) als alternatief voor een commercieel verkrijgbare naadloze DNA-kloneringskit. Biochem. Biofysica. Rep. 4, 148-151. (doi:10.1016/j.bbrep.2015.09.005) PubMed, Google Scholar

. 1990 Ligatie-onafhankelijke klonering van PCR-producten (LIC-PCR). Nucleïnezuren Res. 18, 6069-6074. (doi:10.1093/nar/18.20.6069) Crossref, PubMed, Google Scholar

Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO

. 2009 Enzymatische assemblage van DNA-moleculen tot enkele honderden kilobasen. nat. Methoden: 6, 343-345. (doi:10.1038/nmeth.1318) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Irwin CR, Farmer A, Willer DO, Evans DH

. 2012 In-fusion®-klonering met vacciniavirus-DNA-polymerase . Methoden Mol. Biol . 890, 23-35. (doi:10.1007/978-1-61779-876-4_2) Crossref, PubMed, Google Scholar

Klock HE, Koesema EJ, Knuth MW, Lesley SA

. 2008 Combinatie van de polymerase incomplete primer extension-methode voor klonen en mutagenese met microscreening om structurele genomics-inspanningen te versnellen. Eiwitten 71, 982-994. (doi:10.1002/prot.21786) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2007 Gebruik maken van homologe recombinatie in vitro om recombinant DNA te genereren via SLIC. nat. Methoden: 4, 251-256. (doi:10.1038/nmeth1010) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2010 Overlap extension PCR cloning: een eenvoudige en betrouwbare manier om recombinante plasmiden te maken. BioTechnieken 48, 463-465. (doi:10.2144/000113418) Crossref, PubMed, Google Scholar

Stevenson J, Krycer JR, Phan L, Brown AJ

. 2013 Een praktische vergelijking van ligatie-onafhankelijke kloneringstechnieken. PLoS ONE 8, e83888. (doi:10.1371/journal.pone.0083888) Crossref, PubMed, Google Scholar

Thomas S, Maynard ND, Gill J

. DNA-bibliotheekconstructie uit 2015 met Gibson Assembly® . nat. Methoden: 12, 11. (doi:10.1038/nmeth.f.384) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2014 High-throughput klonering, expressie en zuivering van glycosidehydrolasen met behulp van Ligation-Independent Cloning (LIC). Eiwit Expr. zuiver. 99, 35–42. (doi:10.1016/j.pep.2014.03.008) Crossref, PubMed, Google Scholar

Schmid-Burgk JL, Schmidt T, Kaiser V, Honing K, Hornung V

. 2013 Een ligatie-onafhankelijke kloneringstechniek voor high-throughput assemblage van transcriptie-activator-achtige effectorgenen. nat. Biotechnologie . 31, 76-81. (doi:10.1038/nbt.2460) Crossref, PubMed, Google Scholar

Yuan H, Peng L, Han Z, Xie JJ, Liu XP

. 2015 Recombinante expressiebibliotheek van Pyrococcus furiosus geconstrueerd door klonen met hoge doorvoer: een handig hulpmiddel voor functionele en structurele genomica. Voorkant. microbiologisch. 6, 943. (doi:10.3389/fmicb.2015.0943) Crossref, PubMed, Google Scholar

Lee N, Francklyn C, Hamilton EP

. 1987 Door Arabinose geïnduceerde binding van AraC-eiwit aan araI2 activeert de araBAD-operonpromoter. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 84, 8814-8818. (doi:10.1073/pnas.84.24.8814) Crossref, PubMed, Google Scholar

Guzman LM, Belin D, Carson MJ, Beckwith J

. 1995 Strakke regulatie, modulatie en expressie op hoog niveau door vectoren die de arabinose-PBAD-promoter bevatten. J. Bacteriol . 177, 4121-4130. Crossref, PubMed, Google Scholar

Otto CM, Niagro F, Su X, Rawlings CA

. 1995 Expressie van recombinante kattentumornecrosefactor is toxisch voor Escherichia coli . clin. Diagnose Laboratorium. Immunol . 2, 740-746. PubMed, Google Scholar

. 2010 Strategieën om eiwitexpressie te optimaliseren in E coli . Curr. Protoc. Eiwit Sc. 5, 21–29. (doi:10.1002/0471140864.ps0524s61) Google Scholar

2008 Eiwitproductie en -zuivering. nat. Methoden: 5, 135-146. (doi:10.1038/nmeth.f.202) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 1986 Gebruik van bacteriofaag T7 RNA-polymerase om selectieve expressie op hoog niveau van gekloonde genen te sturen. J. Mol. Biol . 189, 113-130. (doi:10.1016/0022-2836(86)90385-2) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2000 Verminderde achtergrondexpressie en verbeterde plasmidestabiliteit met pET-vectoren in BL21(DE3). BioTechnieken 29, 1234-1238. Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2004 T7-lysozym onderdrukt de transcriptie van T7-RNA-polymerase door het open complex tijdens de initiatie te destabiliseren. J. Biol. Chemo . 279, 16 136–16 143. (doi:10.1074/jbc.M400139200) Crossref, Google Scholar

. 1996 Overproductie van eiwitten in Escherichia coli: mutante gastheren die de synthese van sommige membraaneiwitten en bolvormige eiwitten op hoge niveaus mogelijk maken. J. Mol. Biol . 260, 289-298. (doi:10.1006/jmbi.1996.0399) Crossref, PubMed, Google Scholar

2008 Tuning Escherichia coli voor overexpressie van membraaneiwitten. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 105, 14 371–14 376. (doi:10.1073/pnas.0804090105) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 1983 Vergelijking van de initiatie van eiwitsynthese in prokaryoten, eukaryoten en organellen. microbiologisch. Rev . 47, 1-45. PubMed, Google Scholar

Cheong DE, Ko KC, Han Y, Jeon HG, Sung BH, Kim GJ, Choi JH, Song JJ

. 2015 Verbetering van de functionele expressie van heterologe eiwitten door willekeurige substitutie van genetische codes in het 5'-coderende gebied. Biotechnologie. Bioeng . 112, 822-826. (doi:10.1002/bit.25478) Crossref, PubMed, Google Scholar

2013 Nauwkeurige en betrouwbare genexpressie via standaard transcriptie- en translatie-initiatie-elementen. nat. Methoden: 10, 354-360. (doi:10.1038/nmeth.2404) Crossref, PubMed, Google Scholar

Liebeton K, Lengefeld J, Eck J

. 2014 De nucleotidesamenstelling van de spacersequentie beïnvloedt de expressieopbrengst van heteroloog tot expressie gebrachte genen in Bacillus subtilis . J. Biotechnologie . 191, 214-220. (doi:10.1016/j.jbiotec.2014.06.027) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2012 Fijnafstemming van gennetwerken met behulp van eenvoudige sequentieherhalingen. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 109, 16 817–16 822. (doi:10.1073/pnas.1205693109) Crossref, Google Scholar

Mirzadeh K, Martinez V, Toddo S, Guntur S, Herrgard MJ, Elofsson A, Norholm MH, Daley DO

. 2015 Verbeterde eiwitproductie in Escherichia coli door optimalisatie van kloneringslittekens op de vectorcoderende sequentieverbinding. ACS-synth. Biol . 4, 959-965. (doi:10.1021/acssynbio.5b00033) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2005 Regulatie van translatie via mRNA-structuur in prokaryoten en eukaryoten. Gen 361, 13–37. (doi:10.1016/j.gene.2005.06.037) Crossref, PubMed, Google Scholar

Goltermann L, Borch Jensen M, Bentin T

. 2011 Afstemming van eiwitexpressie met behulp van synonieme codonbibliotheken gericht op het 5'-mRNA-coderende gebied. Eiwit Eng. des. Sel . 24, 123-129. (doi:10.1093/proteïne/gzq086) Crossref, PubMed, Google Scholar

Bentele K, Saffert P, Rauscher R, Ignatova Z, Bluthgen N

. 2013 Efficiënte translatie-initiatie dicteert codongebruik bij het starten van een gen. Mol. Syst. Biol . 9, 675. (doi:10.1038/msb.2013.32) Crossref, PubMed, Google Scholar

Goodman DB, Church GM, Kosuri S

. 2013 Oorzaken en effecten van N-terminale codonbias in bacteriële genen. Wetenschap 342, 475-479. (doi: 10.1126/science.1241934) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2010 Een evolutionair geconserveerd mechanisme voor het regelen van de efficiëntie van eiwittranslatie. Cel 141, 344-354. (doi:10.1016/j.cell.2010.03.031) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2016 Codon-invloed op eiwitexpressie in E coli correleert met mRNA-niveaus. Natuur 529, 358-363. (doi:10.1038/nature16509) Crossref, PubMed, Google Scholar

Castillo-Mendez MA, Jacinto-Loeza E, Olivares-Trejo JJ, Guarneros-Pena G, Hernandez-Sanchez J

. 2012 Adenine-bevattende codons verbeteren de eiwitsynthese door mRNA-binding aan ribosomale 30S-subeenheden te bevorderen, op voorwaarde dat specifieke tRNA's niet worden uitgeput. Biochimie 94, 662-672. (doi:10.1016/j.biochi.2011.09.019) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2014 Methode voor het verbeteren van plant-redox-gerelateerde eiwitexpressie en de toepassing ervan voor: in vitro vermindering van chloroplastische thioredoxines. Eiwit Expr. Purif . 101, 152-156. (doi:10.1016/j.pep.2014.07.001) Crossref, PubMed, Google Scholar

Krishna Rao DV, Rao JV, Narasu ML, Bhujanga Rao AK

. 2008 Optimalisatie van het AT-gehalte van codons onmiddellijk stroomafwaarts van het startcodon en evaluatie van kweekomstandigheden voor expressie op hoog niveau van recombinant humaan G-CSF in Escherichia coli . Mol. Biotechnologie . 38, 221-232. (doi:10.1007/s12033-007-9018-3) Crossref, PubMed, Google Scholar

Care S, Bignon C, Pelissier MC, Blanc E, Canard B, Coutard B

. 2008 De vertaling van recombinante eiwitten in E coli kan worden verbeterd door in silico het genereren en screenen van willekeurige bibliotheken van een A70/+96 mRNA-gebied met betrekking tot het translatie-initiatiecodon. Nucleïnezuren Res . 36, e6. (doi:10.1093/nar/gkm1097) Crossref, PubMed, Google Scholar

Salis HM, Mirsky EA, Voigt CA

. 2009 Geautomatiseerd ontwerp van synthetische ribosoombindingsplaatsen om eiwitexpressie te controleren. nat. Biotechnologie . 27, 946-950. (doi:10.1038/nbt.1568) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2010 RBSDesigner: software voor het ontwerpen van synthetische ribosoombindingsplaatsen die een gewenst niveau van eiwitexpressie opleveren. Bio-informatica 26, 2633-2634. (doi:10.1093/bioinformatics/btq458) Crossref, PubMed, Google Scholar

Seo SW, Yang JS, Kim I, Yang J, Min BE, Kim S, Jung GY

. 2013 Voorspellend ontwerp van het mRNA-translatie-initiatiegebied om de prokaryotische translatie-efficiëntie te beheersen. Metab. Eng . 15, 67-74. (doi:10.1016/j.ymben.2012.10.006) Crossref, PubMed, Google Scholar

Bonde MT, Pedersen M, Klausen MS, Jensen SI, Wulff T, Harrison S, Nielsen AT, Herrgard MJ, Sommer MOA

. 2016 Voorspelbare afstemming van eiwitexpressie in bacteriën. nat. Methoden: 13, 233-236. (doi:10.1038/nmeth.3727) Crossref, PubMed, Google Scholar

Reeve B, Hargest T, Gilbert C, Ellis T

. 2014 Initiatiepercentages voor vertalingen voorspellen voor het ontwerpen van synthetische biologie. Voorkant. Bioeng. Biotechnologie . 2, 1. (doi:10.3389/fbioe.2014.00001) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 1989 Moleculair klonen: een laboratoriumhandleiding , 2e ed. New York, NY: Cold Spring Laboratory Press. Google geleerde

. 2004 Overzicht van affiniteitstags voor eiwitzuivering. Curr. Protoc. Eiwit Sc. 9, 9. (doi:10.1002/0471140864.ps0909s36) PubMed, Google Scholar

Costa S, Almeida A, Castro A, Domingues L

. 2014 Fusion-tags voor eiwitoplosbaarheid, zuivering en immunogeniciteit in Escherichia coli: het nieuwe Fh8-systeem. Voorkant. microbiologisch. 5, 63. (doi:10.3389/fmicb.2014.00063) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2013 Verschillende affiniteitstags die vaak worden gebruikt bij chromatografische zuivering. J. Anaal. Methoden Chem . 2013, 581093. (doi: 10.1155/2013/581093) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2001 Perspectieven van geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie. J. Biochem. Biofysica. Methoden: 49, 335-360. (doi:10.1016/S0165-022X(01)00207-X) Crossref, PubMed, Google Scholar

Schmidt PM, Sparrow LG, Attwood RM, Xiao X, Adams TE, McKimm-Breschkin JL

. 2012 Neerhalen van de VLAG! Hoe expressie van insectencellen een gevestigd tag-systeem uitdaagt PLoS ONE 7, e37779. (doi:10.1371/journal.pone.0037779) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2007 Het Strep-tag-systeem voor eenstapszuivering en detectie of afvanging van eiwitten met hoge affiniteit. nat. protocol . 2, 1528-1535. (doi:10.1038/nprot.2007.209) Crossref, PubMed, Google Scholar

Dyson MR, Shadbolt SP, Vincent KJ, Perera RL, McCafferty J

. 2004 Productie van oplosbare zoogdiereiwitten in Escherichia coli: identificatie van eiwitkenmerken die correleren met succesvolle expressie . BMC Biotechnologie . 4, 32. (doi:10.1186/1472-6750-4-32) Crossref, PubMed, Google Scholar

Zuo X, Li S, Hall J, Mattern MR, Tran H, Shoo J, Tan R, Weiss SR, Butt TR

. 2005 Verbeterde expressie en zuivering van membraaneiwitten door SUMO-fusie in Escherichia coli . J. Struct. Functie genomica 6, 103-111. (doi:10.1007/s10969-005-2664-4) Crossref, PubMed, Google Scholar

Hammon J, Palanivelu DV, Chen J, Patel C, Minor DL

. 2009 Een groen fluorescerend eiwitscherm voor identificatie van goed tot expressie gebrachte membraaneiwitten van een cohort van extremofiele organismen. Proteïne wetenschap . 18, 121-133. (doi:10.1002/pro.18) PubMed, Google Scholar

Lilius G, Persson M, Bulow L, Mosbach K

. 1991 Metaalaffiniteitsprecipitatie van eiwitten die genetisch gehechte polyhistidine-affiniteitsstaarten dragen. EUR. J. Biochem . 198, 499-504. (doi:10.1111/j.1432-1033.1991.tb16042.x) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2003 Expressie op hoog niveau en snelle zuivering van genen met zeldzame codons uit hyperthermofiele archaea door het GST-genfusiesysteem. J. Chromatogr. B Analist. technologie. biomed. Levenswetenschappen . 786, 177-185. (doi:10.1016/S1570-0232(02)00810-3) Crossref, PubMed, Google Scholar

Coleman MA, Lao VH, Segelke BW, Beernink PT

. 2004 High-throughput, op fluorescentie gebaseerde screening voor oplosbare eiwitexpressie. J. Proteoomonderzoek . 3, 1024-1032. (doi:10.1021/pr049912g) Crossref, PubMed, Google Scholar

Hewitt SN, Choi R, Kelley A, Crowther GJ, Napuli AJ, Van Voorhis WC

. 2011 Expressie van eiwitten in Escherichia coli als fusies met maltose-bindend eiwit om niet tot expressie gebrachte doelen te redden in een pijplijn voor eiwitexpressie en zuivering met hoge doorvoer. Acta Crystallogr. Sekte. F-structuur. Biol. kristal. gemeenschappelijk . 67, 1006-1009. (doi:10.1107/s1744309111022159) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2006 Verbetering van oplosbare eiwitexpressie door het gebruik van fusietags. Curr. Opin. Biotechnologie . 17, 353-358. (doi:10.1016/j.copbio.2006.06.03) Crossref, PubMed, Google Scholar

Costa SJ, Coelho E, Franco L, Almeida A, Castro A, Domingues L

. 2013 De Fh8-tag: een fusiepartner voor eenvoudige en kosteneffectieve eiwitzuivering in Escherichia coli . Eiwit Expr. zuiver. 92, 163-170. (doi:10.1016/j.pep.2013.09.013) Crossref, PubMed, Google Scholar

McCluskey AJ, Poon GM, Gariepy J

. 2007 Een snelle en universele tandemzuiveringsstrategie voor recombinante eiwitten. Proteïne wetenschap . 16, 2726-2732. (doi: 10.1110/ps.072894407) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2010 Veelgebruikte tagcombinaties voor tandem-affiniteitszuivering. Biotechnologie. toepassing biochemisch . 55, 73-83. (doi:10.1042/ba20090273) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2000 Membraantopologie en insertie van membraaneiwitten: zoeken naar topogene signalen. microbiologisch. Mol. Biol. Rev . 64, 13-33. (doi:10.1128/mmbr.64.1.13-33.2000) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2005 Een schaalbare, op GFP gebaseerde pijplijn voor screening en zuivering van overexpressie van membraaneiwitten. Eiwit Sc. 14, 2011-2017. (doi: 10.1110/ps.051466205) Crossref, PubMed, Google Scholar

Drew D, Lerch M, Kunji E, Slotboom DJ, de Gier JW

. 2006 Optimalisatie van overexpressie en zuivering van membraaneiwit met behulp van GFP-fusies. nat. Methoden: 3, 303-313. (doi:10.1038/nmeth0406-303) Crossref, PubMed, Google Scholar

Drew D, Newstead S, Sonoda Y, Kim H, von Heijne G, Iwata S

. 2008 Op GFP gebaseerd optimalisatieschema voor de overexpressie en zuivering van eukaryote membraaneiwitten in Saccharomyces cerevisiae . nat. Protoc. 3, 784-798. (doi:10.1038/nprot.2008.44) Crossref, PubMed, Google Scholar

Backmark AE, Olivier N, Snijder A, Gordon E, Dekker N, Ferguson AD

. 2013 Fluorescerende sonde voor screening met hoge doorvoer van membraaneiwitexpressie. Proteïne wetenschap . 22, 1124-1132. (doi:10.1002/pro.2297) Crossref, PubMed, Google Scholar

Zhang YB, Howitt J, McCorkle S, Lawrence P, Springer K, Freimuth P

. 2004 Eiwitaggregatie tijdens overexpressie beperkt door peptide-extensies met grote netto negatieve lading. Eiwit Expr. zuiver. 36, 207-216. (doi:10.1016/j.pep.2004.04.020) Crossref, PubMed, Google Scholar

Roosild TP, Greenwald J, Vega M, Castronovo S, Riek R, Choe S

. 2005 NMR-structuur van Mistic, een membraanintegrerend eiwit voor membraaneiwitexpressie. Wetenschap 307, 1317-1321. (doi: 10.1126/science.1106392) Crossref, PubMed, Google Scholar

Leviatan S, Sawada K, Moriyama Y, Nelson N

. 2010 Combinatorische methode voor overexpressie van membraaneiwitten in Escherichia coli . J. Biol. Chemo . 285, 23 548–23 556. (doi:10.1074/jbc.M110.125492) Crossref, Google Scholar

. 2001 Screening op oplosbare expressie van recombinante eiwitten in een formaat met 96 putjes. Anaal. biochemisch . 297, 79-85. (doi:10.1006/abio.2001.5331) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2013 High-throughput onmiddellijke kwantificering van eiwitexpressie en zuiverheid op basis van fotoactief geel eiwit turn off/on label. Eiwit Sc. 22, 1109-1117. (doi:10.1002/pro.2286) Crossref, PubMed, Google Scholar

2016 Geautomatiseerd op structuur en sequentie gebaseerd ontwerp van eiwitten voor hoge bacteriële expressie en stabiliteit. Mol. Cel 63, 337-346. (doi:10.1016/j.molcel.2016.06.012) Crossref, PubMed, Google Scholar

2015 Shear-stress-gemedieerde hervouwing van eiwitten uit aggregaten en inclusielichamen. Chembiochemisch 16, 393-396. (doi:10.1002/cbic.201402427) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2011 Een overzicht van enzymatische reagentia voor het verwijderen van affiniteitstags. Eiwit Expr. zuiver. 80, 283-293. (doi:10.1016/j.pep.2011.08.005) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2011 De variabele detergensgevoeligheid van proteasen die worden gebruikt voor het verwijderen van recombinante eiwitaffiniteitstags. Eiwit Expr. zuiver. 78, 139-142. (doi:10.1016/j.pep.2011.04.011) Crossref, PubMed, Google Scholar

Davis GJ, Wang QM, Cox GA, Johnson RB, Wakulchik M, Dotson CA, Villarreal EC

. 1997 Expressie en zuivering van recombinant rhinovirus 14 3CD-proteïnase en zijn vergelijking met het 3C-proteïnase. Boog. Biochem. biofysische . 346, 125-130. (doi:10.1006/abbi.1997.0291) Crossref, PubMed, Google Scholar

Joseph BC, Pichaimuthu S, Srimeenakshi S, Murthy M, Selvakumar K, Ganesan M, Manjunath SR

. 2015 Een overzicht van de parameters voor recombinante eiwitexpressie in Escherichia coli . J. Cel Wetenschap. daar . 6, 5. (doi: 10.4172/2157-7013.1000221) Crossref, Google Scholar

Wu X, Jörnvall H, Berndt KD, Oppermann U

. 2004 Codonoptimalisatie onthult kritische factoren voor expressie op hoog niveau van twee zeldzame codongenen in Escherichia coli: RNA-stabiliteit en secundaire structuur, maar geen overvloed aan tRNA. Biochem. Biofysica. Onderzoek gemeenschappelijk . 313, 89-96. (doi:10.1016/j.bbrc.2003.11.091) Crossref, PubMed, Google Scholar

Prinz WA, Aslund F, Holmgren A, Beckwith J

. 1997 De rol van de thioredoxine- en glutaredoxineroutes bij het verminderen van eiwitdisulfidebindingen in de Escherichia coli cytoplasma. J. Biol. Chem. 272, 15 661-15 667. (doi:10.1074/jbc.272.25.15661) Crossref, Google Scholar

Zhang HC, Cisneros RJ, Dunlap RB, Johnson LF

. 1989 Efficiënte synthese van muisthymidylaatsynthase in Escherichia coli . Gen 84, 487-491. (doi:10.1016/0378-1119(89)90525-8) Crossref, PubMed, Google Scholar

Weiner M, Anderson C, Jerpseth B, Wells S, Johnson-Browne B, Vaillancourt P

. 1994 Studier pET-systeemvectoren en gastheren. strategie. Mol. Biol . 7, 41–43. Google geleerde

2003 Expressie van een recombinant IRP-achtig Plasmodium falciparum eiwit dat specifiek vermeende plasmodiale IRE's bindt. Mol. Biochem. Parasitol . 126, 231-238. (doi:10.1016/S0166-6851(02)00278-5) Crossref, PubMed, Google Scholar

Schlegel S, Lofblom J, Lee C, Hjelm A, Klepsch M, Strous M, Drew D, Slotboom DJ, de Gier JW

. 2012 Optimalisatie van overexpressie van membraaneiwit in de Escherichia coli stam Lemo21(DE3). J. Mol. Biol . 423, 648-659. (doi:10.1016/j.jmb.2012.07.019) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Lopez PJ, Marchand I, Joyce SA, Dreyfus M

. 1999 De C-terminale helft van RNase E, die de Escherichia coli degradosoom, neemt deel aan mRNA-afbraak maar niet aan rRNA-verwerking in vivo . Mol. microbiologisch . 33, 188-199. (doi:10.1046/j.1365-2958.1999.01465.x) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2013 Uitbreiding van het landschap van de productie van recombinante eiwitten in Escherichia coli . Biotechnologie. Lett . 35, 1971-1981. (doi:10.1007/s10529-013-1396-y) Crossref, PubMed, Google Scholar

Murata T, Shinozuka Y, Obata Y, Yokoyama KK

. 2008 Fosforylering van twee eukaryote transcriptiefactoren, Jun-dimerisatie-eiwit 2 en activatietranscriptiefactor 2, in Escherichia coli door Jun N-terminaal kinase 1 . Anaal. biochemisch . 376, 115-121. (doi:10.1016/j.ab.2008.01.038) Crossref, PubMed, Google Scholar

2002 N-gebonden glycosylering in Campylobacter jejuni en de functionele overdracht ervan naar E coli . Wetenschap 298, 1790-1793. (doi: 10.1126/science.298.5599.1790) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Ihssen J, Kowarik M, Dilettoso S, Tanner C, Wacker M, Thony-Meyer L

. 2010 Productie van glycoproteïnevaccins in Escherichia coli . microb. Cel feit . 9, 61. (doi:10.1186/1475-2859-9-61) Crossref, PubMed, Google Scholar

Lizak C, Fan YY, Weber TC, Aebi M

. 2011 N-gebonden glycosylering van antilichaamfragmenten in Escherichia coli . Bioconjug. Chemo . 22, 488-496. (doi:10.1021/bc100511k) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2012 Functionele reconstitutie van een afstembare E3-afhankelijke sumoyleringsroute in Escherichia coli . PLoS ONE 7, e38671. (doi:10.1371/journal.pone.0038671) Crossref, PubMed, Google Scholar

Magnani R, Chaffin B, Dick E, Bricken ML, Houtz RL, Bradley LH

. 2012 Gebruik van een co-expressiesysteem van calmoduline-lysine-methyltransferase voor het genereren van een combinatorische bibliotheek van post-translationeel gemodificeerde eiwitten. Eiwit Expr. zuiver. 86, 83-88. (doi:10.1016/j.pep.2012.09.012) Crossref, PubMed, Google Scholar

Duronio RJ, Jackson-Machelski E, Heuckeroth RO, Olins PO, Devine CS, Yonemoto W, Slice LW, Taylor SS, Gordon JI

. 1990 Eiwit N-myristoylering in Escherichia coli: reconstitutie van een eukaryote eiwitmodificatie in bacteriën. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 87, 1506-1510. (doi:10.1073/pnas.87.4.1506) Crossref, PubMed, Google Scholar

Ren Y, Yao X, Dai H, Li S, Fang H, Chen H, Zhou C

. 2011 Productie van Nα-geacetyleerd thymosine α1 in Escherichia coli . microb. Cel feit . 10, 26. (doi:10.1186/1475-2859-10-26) Crossref, PubMed, Google Scholar

Gubellini F, Verdon G, Karpowich NK, Luff JD, Boel G, Gauthier N, Handelman SK, Ades SE, Hunt JF

. 2011 Fysiologische reactie op overexpressie van membraaneiwit in E. coli . Mol. Cel Proteomics 10, M111.007930. (doi:10.1074/mcp.M111.007930) Crossref, PubMed, Google Scholar

2011 Het overwinnen van barrières voor de bepaling van de membraaneiwitstructuur. nat. Biotechnologie . 29, 335-340. (doi:10.1038/nbt.1833) Crossref, PubMed, Google Scholar

Marreddy RKR, Geertsma ER, Poolman B

. 2011 Recombinante membraaneiwitproductie: verleden, heden en toekomst. In Supramoleculaire structuur en functie 10 (eds

Brnjas-Kraljević J, Pifat-Mrzljak G

), blz. 41-74. Dordrecht, Nederland : Springer . Crossref, Google Scholar

Luirink J, Yu Z, Wagner S, de Gier JW

. 2012 Biogenese van binnenmembraaneiwitten in Escherichia coli . Biochim. Biofysica. Acta . 1817, 965-976. (doi:10.1016/j.bbabio.2011.12.006) Crossref, PubMed, Google Scholar

Kwon SK, Kim SK, Lee DH, Kim JF

. 2015 Vergelijkende genomica en experimentele evolutie van Escherichia coli BL21(DE3)-stammen onthullen het landschap van ontsnapping van toxiciteit door overproductie van membraaneiwit. Wetenschap. vertegenwoordiger . 5, 16076. (doi:10.1038/srep16076) Crossref, PubMed, Google Scholar

Wagner S, Baars L, Ytterberg AJ, Klussmeier A, Wagner CS, Nord O, Nygren PÅ, van Wijk KJ, de Gier JW

. 2007 Gevolgen van overexpressie van membraaneiwit in Escherichia coli . Mol. Cel. Proteomics 6, 1527-1550. (doi:10.1074/mcp.M600431-MCP200) Crossref, Google Scholar

Chen Y, Song J, Sui SF, Wang DN

. 2003 DnaK en DnaJ faciliteerden het vouwproces en verminderden de vorming van inclusielichaampjes van magnesiumtransporter CorA, tot overexpressie gebracht in Escherichia coli . Eiwit Expr. zuiver. 32, 221-231. (doi:10.1016/S1046-5928(03)00233-X) Crossref, PubMed, Google Scholar

Link AJ, Skretas G, Strauch EM, Chari NS, Georgiou G

. 2008 Efficiënte productie van membraangeïntegreerde en in detergent oplosbare G-eiwitgekoppelde receptoren in Escherichia coli . Proteïne wetenschap . 17, 1857-1863. (doi: 10.1110/ps.035980.108) Crossref, PubMed, Google Scholar

Skretas G, Makino T, Varadarajan N, Pogson M, Georgiou G

. 2012 Multi-copy genen die de opbrengst van aan G-eiwit gekoppelde receptoren bij zoogdieren verhogen in Escherichia coli . Metab. Eng . 14, 591-602. (doi:10.1016/j.ymben.2012.05.001) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2009 Genetische analyse van G-eiwit-gekoppelde receptorexpressie in Escherichia coli: Remmende rol van DnaJ op de membraanintegratie van de menselijke centrale cannabinoïdereceptor . Biotechnologie. Bioeng . 102, 357-367. (doi:10.1002/bit.22097) Crossref, PubMed, Google Scholar

Schlegel S, Hjelm A, Baumgarten T, Vikstrom D, de Gier JW

. 2014 Op bacteriën gebaseerde productie van membraaneiwitten. Biochim. Biofysica. Acta . 1843, 1739-1749. (doi:10.1016/j.bbamcr.2013.10.023) Crossref, PubMed, Google Scholar

Sezonov G, Joseleau-Petit D, D'Ari R

. 2007 Escherichia coli fysiologie in Luria-Bertani-bouillon. J. Bacteriol . 189, 8746-8749. (doi:10.1128/jb.01368-07) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2005 Eiwitproductie door auto-inductie in schudculturen met hoge dichtheid. Eiwit Expr. zuiver. 41, 207-234. (doi:10.1016/j.pep.2005.01.016) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Losen M, Frölich B, Pohl M, Büchs J

. 2004 Effect van zuurstofbeperking en mediumsamenstelling op Escherichia coli fermentatie in schudflesculturen. Biotechnologie. Prog . 20, 1062-1068. (doi:10.1021/bp034282t) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2006 Productie van recombinante eiwitten door kweek met hoge celdichtheid Escherichia coli . Chem. Ing. technologie . 61, 876-885. (doi:10.1016/j.ces.2005.03.031) Crossref, Google Scholar

Lied JM, An YJ, Kang MH, Lee YH, Cha SS

. 2012 Teelt bij 6-10°C is een effectieve strategie om de onoplosbaarheid van recombinante eiwitten in Escherichia coli . Eiwit Expr. zuiver. 82, 297-301. (doi:10.1016/j.pep.2012.01.020) Crossref, PubMed, Google Scholar

Castellanos-Mendoza A, Castro-Acosta RM, Olvera A, Zavala G, Mendoza-Vera M, García-Hernández E, Alagón A, Trujillo-Roldán MA, Valdez-Cruz NA

. 2014 Invloed van pH-controle op de vorming van inclusielichaampjes tijdens de productie van recombinant sfingomyelinase-D in Escherichia coli . microb. Cel feit. 13, 1-14. (doi:10.1186/s12934-014-0137-9) Crossref, PubMed, Google Scholar

Yang Q, Xu J, Li M, Lei X, An L

. 2003 Expressie op hoog niveau van een oplosbaar slangengif-enzym, gloshedobin, in E coli in aanwezigheid van metaalionen. Biotechnologie. Lett . 25, 607-610. (doi:10.1023/A:1023067626846) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2005 Oplosbare expressie van recombinante eiwitten in het cytoplasma van Escherichia coli . microb. Cel feit. 4, 1–8. (doi:10.1186/1475-2859-4-1) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2015 Triton X-100 verbetert de oplosbaarheid en secretieverhouding van aggregatiegevoelige pullulanase geproduceerd in Escherichia coli . Bioresource. technologie . 194, 137-143. (doi:10.1016/j.biortech.2015.07.024) Crossref, PubMed, Google Scholar

Mondal S, Shet D, Prasanna C, Atreya HS

. 2013 Hoge opbrengst expressie van eiwitten in E coli voor NMR-onderzoeken. Adv. Biosc. Biotechnologie . 4, 751-767. (doi:10.4236/abb.2013.46099) Crossref, Google Scholar

. 2015 Het oplosbaarheidsprobleem overwinnen in E coli: beschikbare benaderingen voor de productie van recombinante eiwitten. Methoden Mol. Biol. 1258, 27-44. (doi:10.1007/978-1-4939-2205-5_2) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2011 Afstemming van verschillende expressieparameters om oplosbare recombinante eiwitten te verkrijgen in E coli: voordelen van high-throughput screening . Biotechnologie. J . 6, 715-730. (doi:10.1002/biot.201100025) Crossref, PubMed, Google Scholar

Ukkonen K, Mayer S, Vasala A, Neubauer P

. 2013 Gebruik van langzame glucosetoevoer als ondersteunende koolstofbron in auto-inductiemedium voor lactose verbetert de robuustheid van eiwitexpressie bij verschillende beluchtingsomstandigheden. Eiwit Expr. zuiver. 91, 147-154. (doi:10.1016/j.pep.2013.07.016) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2013 Uitdrukking in Escherichia coli: steeds sneller en complexer worden . Curr. Opin. structuur. Biol . 23, 326-334. (doi:10.1016/j.sbi.2013.01.006) Crossref, PubMed, Google Scholar

Rohe P, Venkanna D, Kleine B, Freudl R, Oldiges M

. 2012 Een geautomatiseerde workflow voor het verbeteren van microbiële bioprocesoptimalisatie op een nieuw microbioreactorplatform. microb. Cel feit. 11, 1-14. (doi:10.1186/1475-2859-11-144) Crossref, PubMed, Google Scholar

Lange Q, Liu X, Yang Y, Li L, Harvey L, McNeil B, Bai Z

. 2014 De ontwikkeling en toepassing van high-throughput teelttechnologie in de ontwikkeling van bioprocessen. J. Biotechnologie . 192, 323-338. (doi:10.1016/j.jbiotec.2014.03.028) Crossref, PubMed, Google Scholar

Grunzel P, Pilarek M, Steinbruck D, Neubauer A, Merk E, Kumke MU, Neubauer P, Krause M

. 2014 Mini-schaal kweekmethode maakt snelle plasmideproductie mogelijk in Escherichia coli . Biotechnologie. J . 9, 128-136. (doi:10.1002/biot.201300177) Crossref, PubMed, Google Scholar

Kong F, Yuan L, Zheng YF, Chen W

. 2012 Automatische vloeistofbehandeling voor life science: een kritische beoordeling van de huidige stand van de techniek. J. Lab. Auto . 17, 169-185. (doi:10.1177/2211068211435302) Crossref, PubMed, Google Scholar

Hughes SR, Butt TR, Bartolett S, Riedmuller SB, Farrelly P

. 2011 Ontwerp en bouw van een eerste-generatie high-throughput geïntegreerd robotisch moleculair biologieplatform voor bio-energietoepassingen. J. Lab. Auto . 16, 292-307. (doi:10.1016/j.jala.2011.04.004) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2015 Robotic high-throughput zuivering van affiniteit-gelabelde recombinante eiwitten. Methoden Mol. Biol. 1286, 97-106. (doi:10.1007/978-1-4939-2447-9_9) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2016 Geautomatiseerde monstervoorbereiding. Wetenschap 351, 300-302. (doi: 10.1126/science.351.6270.300) Crossref, Google Scholar

. 2013 Recombinant-polypeptideproductie in E coli: naar een rationele aanpak om de opbrengst van functionele eiwitten te verbeteren . microb. Cel feit . 12, 101. (doi:10.1186/1475-2859-12-101) Crossref, PubMed, Google Scholar


Gepubliceerd door de Royal Society onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, die onbeperkt gebruik toestaat, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en bron worden vermeld.

Referenties

. 2006 High-throughput biologie in het postgenomische tijdperk. J. Vasc. interv. Radiol . 17, 1077-1085. (doi:10.1097/01.rvi.0000228840.12260.ff) Crossref, PubMed, Google Scholar

Cameron DE, Bashor CJ, Collins JJ

. 2014 Een korte geschiedenis van synthetische biologie. nat. Rev. Microbiol . 12, 381-390. (doi:10.1038/nrmicro3239) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2006 High-throughput fluorescentiemicroscopie voor systeembiologie. nat. ds. Mol. cel bio . 7, 690-696. (doi:10.1038/nrm1979) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2012 Strategieën voor de productie van actieve eukaryote eiwitten in het bacteriële expressiesysteem. Aziatische Pac. J. Trop. biomed. 2, 159-162. (doi:10.1016/S2221-1691(11)60213-X) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2014 Recombinante eiwitexpressie in Escherichia coli: vooruitgang en uitdagingen . Voorkant. microbiologisch . 5, 172. (doi:10.3389/fmicb.2014.00172) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2001 High-throughput proteomics: eiwitexpressie en -zuivering in de postgenomische wereld. Eiwit Expr. Purif . 22, 159-164. (doi:10.1006/prep.2001.1465) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2000 Ontwerp van high-throughput methoden voor eiwitproductie voor structurele biologie. Structuur 8, R177–R185. (doi:10.1016/S0969-2126(00)00193-3) Crossref, PubMed, Google Scholar

Vincentelli R, Cimino A, Geerlof A, Kubo A, Satou Y, Cambillau C

. 2011 High-throughput eiwitexpressie screening en zuivering in Escherichia coli . Methoden: 55, 65-72. (doi:10.1016/j.ymeth.2011.08.010) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2011 High-throughput constructie en kleinschalige expressie screening van multi-tag vectoren in Escherichia coli . Methoden: 55, 29–37. (doi:10.1016/j.ymeth.2011.08.002) Crossref, PubMed, Google Scholar

Mlynek G, Lehner A, Neuhold J, Leeb S, Kostan J, Charnagalov A, Stolt-Bergner P, Djinovic-Carugo K, Pinotsis N

. 2014 Het centrum voor geoptimaliseerde structurele studies (COSS) platform voor automatisering bij het klonen, expressie en zuivering van afzonderlijke eiwitten en eiwit-eiwitcomplexen. Aminozuren 46, 1565-1582. (doi:10.1007/s00726-014-1699-x) Crossref, PubMed, Google Scholar

Dieckman L, Gu M, Stols L, Donnelly MI, Collart FR

. 2002 High-throughput-methoden voor genklonering en -expressie. Eiwit Expr. zuiver. 25, 1-7. (doi:10.1006/prep.2001.1602) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2013 De RNA-polymerasefabriek en archaeale transcriptie. Chem. Rev . 113, 8350-8376. (doi:10.1021/cr400148k) Crossref, PubMed, Google Scholar

Jia B, Li Z, Liu J, Zon Y, Jia X, Xuan YH, Zhang J, Jeon CO

. 2015 Een zinkafhankelijk protease AMZ-tk van een thermofiele archaeon is een nieuw lid van de archaemetzincine-eiwitfamilie. Voorkant. microbiologisch. 6, 1380. (doi:10.3389/fmicb.2015.01380) Crossref, PubMed, Google Scholar

Jia B, Liu J, Van Duyet L, Sun Y, Xuan YH, Cheong GW

. 2015 Proteoomprofilering van hitte-, oxidatieve en zoutstressreacties in Thermococcus kodakarensis KOD1 . Voorkant. microbiologisch. 6, 605. (doi:10.3389/fmicb.2015.0605) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2013 Multifunctionele enzymen in archaea: promiscuïteit en maanlicht. Extremofielen 17, 193-203. (doi:10.1007/s00792-012-0509-1) Crossref, PubMed, Google Scholar

Holz C, Lueking A, Bovekamp L, Gutjahr C, Bolotina N, Lehrach H, Cahill DJ

. 2001 Een menselijke cDNA-expressiebibliotheek in gist verrijkt voor open leeskaders. Genoom Res . 11, 1730-1735. (doi:10.1101/gr.181501) Crossref, PubMed, Google Scholar

Büssow K, Nordhoff E, Lubbert C, Lehrach H, Walter G

. 2000 Een menselijke cDNA-bibliotheek voor screening op eiwitexpressie met hoge doorvoer. genomica 65, 1–8. (doi:10.1006/geno.2000.6141) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2004 Vele paden naar veel klonen: een vergelijkende kijk op kloonmethoden met hoge doorvoer. Genoom Res . 14, 2020-2028. (doi:10.1101/gr.2528804) Crossref, PubMed, Google Scholar

Cao Y, Sun J, Zhu J, Li L, Liu G

. 2010 PrimerCE: ontwerpen van primers voor klonen en genexpressie. Mol. Biotechnologie . 46, 113-117. (doi:10.1007/s12033-010-9276-3) Crossref, PubMed, Google Scholar

Camilo CM, Lima GM, Maluf FV, Guido RV, Polikarpov I

. 2015 HTP-OligoDesigner: een online tool voor het ontwerpen van primers voor het klonen van genen met hoge doorvoer en plaatsgerichte mutagenese. J. Computer. Biol . 23, 27-29. (doi:10.1089/cmb.2015.0148) Crossref, PubMed, Google Scholar

Otto P, Larson B, Krueger S

. 2002 Geautomatiseerde high-throughput zuivering van PCR-producten met behulp van Wizard® MagneSil™ paramagnetische deeltjes. J. Lab. automatisch . 7, 120-124. (doi:10.1016/s1535-5535-04-00232-1) Google Scholar

Xiong AS, Yao QH, Peng RH, Duan H, Li X, Fan HQ, Cheng ZM, Li Y

. 2006 PCR-gebaseerde nauwkeurige synthese van lange DNA-sequenties. nat. protocol . 1, 791-797. (doi:10.1038/nprot.2006.103) Crossref, PubMed, Google Scholar

Yehezkel TB, Linshiz G, Buaron H, Kaplan S, Shabi U, Shapiro E

. 2008 nieuw DNA-synthese met behulp van PCR met één molecuul. Nucleïnezuren Res. 36, e107. (doi:10.1093/nar/gkn457) Crossref, PubMed, Google Scholar

Klein JC, Lajoie MJ, Schwartz JJ, Strauch EM, Nelson J, Baker D, Shendure J

. 2016 Multiplex paarsgewijze assemblage van array-afgeleide DNA-oligonucleotiden. Nucleïnezuren Res . 44, e43. (doi:10.1093/nar/gkv1177) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2014 Grootschalig de novo DNA-synthese: technologieën en toepassingen. nat. Methoden: 11, 499-507. (doi:10.1038/nmeth.2918) Crossref, PubMed, Google Scholar

Quan J, Saaem I, Tang N, Ma S, Negre N, Gong H, Witte KP, Tian J

. 2011 Parallelle on-chip gensynthese en toepassing op optimalisatie van eiwitexpressie. nat. Biotechnologie . 29, 449–452. (doi:10.1038/nbt.1847) Crossref, PubMed, Google Scholar

2015 Codonoptimalisatie is een belangrijke determinant van mRNA-stabiliteit. Cel 160, 1111-1124. (doi:10.1016/j.cell.2015.02.029) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Festa F, Steel J, Bian X, Labaer J

. 2013 High-throughput klonen en creatie van expressiebibliotheken voor functionele proteomics. Proteomics 13, 1381-1399. (doi:10.1002/pmic.201200456) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2009 High-throughput eiwitproductie (HTPP): een overzicht van ondersteunende technologieën om de eiwitproductie te versnellen. Methoden Mol. Biol. 498, 1-18. (doi:10.1007/978-1-59745-196-3_1) Crossref, PubMed, Google Scholar

Blommel PG, Martin PA, Wrobel RL, Steffen E, Fox BG

. 2006 Zeer efficiënte productie in een enkele stap van expressieplasmiden uit cDNA-klonen met behulp van het Flexi Vector-kloneringssysteem. Eiwit Expr. Purif . 47, 562-570. (doi:10.1016/j.pep.2005.11.007) Crossref, PubMed, Google Scholar

2008 Exploratie van humaan ORFeome: high-throughput voorbereiding van ORF-klonen en efficiënte karakterisering van hun eiwitproducten. DNA-onderzoek . 15, 137-149. (doi:10.1093/dnares/dsn004) Crossref, PubMed, Google Scholar

Engler C, Kandzia R, Marillonnet S

. 2008 Een één-pot, één stap, nauwkeurige kloonmethode met hoge doorvoercapaciteit. PLoS ONE 3, e3647. (doi:10.1371/journal.pone.0003647) Crossref, PubMed, Google Scholar

Whitman L, Gore M, Ness J, Theodorou E, Gustafsson C, Minshull J

. 2013 Snelle, littekenloze klonering van genfragmenten met behulp van het electr-vectorsysteem. Genet. Ing. Biotechnologie . 33, 42. (doi:10.1089/gen.33.11.20) Google Scholar

Chen WH, Qin ZJ, Wang J, Zhao GP

. 2013 De MASTER (methylation-assisted tailorable ends rational) ligatiemethode voor naadloze DNA-assemblage. Nucleïnezuren Res. 41, e93. (doi:10.1093/nar/gkt122) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2015 Recente ontwikkelingen in DNA-assemblagetechnologieën. FEMS Gist Res . 15, 1–9. (doi:10.1111/1567-1364.12171) PubMed, Google Scholar

Esposito D, Garvey LA, Chakiath CS

. 2009 Gateway-klonering voor eiwitexpressie. Methoden Mol. Biol. 498, 31-54. (doi:10.1007/978-1-59745-196-3_3) Crossref, PubMed, Google Scholar

Cheo DL, Titus SA, Byrd DRN, Hartley JL, Temple GF, Brasch MA

. 2004 Gecoördineerde assemblage en klonering van meerdere DNA-segmenten met behulp van in vitro plaatsspecifieke recombinatie: functionele analyse van expressieklonen met meerdere segmenten. Genoom Res . 14, 2111-2120. (doi:10.1101/gr.2512204) Crossref, PubMed, Google Scholar

Zhang Y, Werling U, Edelmann W

. 2012 SLiCE: een nieuwe op bacteriële celextracten gebaseerde DNA-kloneringsmethode. Nucleïnezuren Res. 40, e55. (doi:10.1093/nar/gkr1288) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2015 Een eenvoudige en efficiënte naadloze DNA-kloneringsmethode met SLiCE van Escherichia coli laboratoriumstammen en de toepassing ervan op SLiP-plaatsgerichte mutagenese. BMC Biotechnologie . 15, 47. (doi:10.1186/s12896-015-0162-8) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2015 Evaluatie van bereidingsmethoden voor extracten van naadloze ligatieklonen van een Escherichia coli laboratorium stam. Anaal. biochemisch . 486, 51-53. (doi:10.1016/j.ab.2015.06.031) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2015 Een eenvoudig en ultra-goedkoop zelfgemaakt naadloos ligatiekloneringsextract (SLiCE) als alternatief voor een commercieel verkrijgbare naadloze DNA-kloneringskit. Biochem. Biofysica. Rep. 4, 148-151. (doi:10.1016/j.bbrep.2015.09.005) PubMed, Google Scholar

. 1990 Ligatie-onafhankelijke klonering van PCR-producten (LIC-PCR). Nucleïnezuren Res. 18, 6069-6074. (doi:10.1093/nar/18.20.6069) Crossref, PubMed, Google Scholar

Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO

. 2009 Enzymatische assemblage van DNA-moleculen tot enkele honderden kilobasen. nat. Methoden: 6, 343-345. (doi:10.1038/nmeth.1318) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Irwin CR, Farmer A, Willer DO, Evans DH

. 2012 In-fusion®-klonering met vacciniavirus-DNA-polymerase . Methoden Mol. Biol . 890, 23-35. (doi:10.1007/978-1-61779-876-4_2) Crossref, PubMed, Google Scholar

Klock HE, Koesema EJ, Knuth MW, Lesley SA

. 2008 Combinatie van de polymerase incomplete primer extension-methode voor klonen en mutagenese met microscreening om structurele genomics-inspanningen te versnellen. Eiwitten 71, 982-994. (doi:10.1002/prot.21786) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2007 Gebruik maken van homologe recombinatie in vitro om recombinant DNA te genereren via SLIC. nat. Methoden: 4, 251-256. (doi:10.1038/nmeth1010) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2010 Overlap extension PCR cloning: een eenvoudige en betrouwbare manier om recombinante plasmiden te maken. BioTechnieken 48, 463-465. (doi:10.2144/000113418) Crossref, PubMed, Google Scholar

Stevenson J, Krycer JR, Phan L, Brown AJ

. 2013 Een praktische vergelijking van ligatie-onafhankelijke kloneringstechnieken. PLoS ONE 8, e83888. (doi:10.1371/journal.pone.0083888) Crossref, PubMed, Google Scholar

Thomas S, Maynard ND, Gill J

. DNA-bibliotheekconstructie uit 2015 met Gibson Assembly® . nat. Methoden: 12, 11. (doi:10.1038/nmeth.f.384) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2014 High-throughput klonering, expressie en zuivering van glycosidehydrolasen met behulp van Ligation-Independent Cloning (LIC). Eiwit Expr. zuiver. 99, 35–42. (doi:10.1016/j.pep.2014.03.008) Crossref, PubMed, Google Scholar

Schmid-Burgk JL, Schmidt T, Kaiser V, Honing K, Hornung V

. 2013 Een ligatie-onafhankelijke kloneringstechniek voor high-throughput assemblage van transcriptie-activator-achtige effectorgenen. nat. Biotechnologie . 31, 76-81. (doi:10.1038/nbt.2460) Crossref, PubMed, Google Scholar

Yuan H, Peng L, Han Z, Xie JJ, Liu XP

. 2015 Recombinante expressiebibliotheek van Pyrococcus furiosus geconstrueerd door klonen met hoge doorvoer: een handig hulpmiddel voor functionele en structurele genomica. Voorkant. microbiologisch. 6, 943. (doi:10.3389/fmicb.2015.0943) Crossref, PubMed, Google Scholar

Lee N, Francklyn C, Hamilton EP

. 1987 Door Arabinose geïnduceerde binding van AraC-eiwit aan araI2 activeert de araBAD-operonpromoter. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 84, 8814-8818. (doi:10.1073/pnas.84.24.8814) Crossref, PubMed, Google Scholar

Guzman LM, Belin D, Carson MJ, Beckwith J

. 1995 Strakke regulatie, modulatie en expressie op hoog niveau door vectoren die de arabinose-PBAD-promoter bevatten. J. Bacteriol . 177, 4121-4130. Crossref, PubMed, Google Scholar

Otto CM, Niagro F, Su X, Rawlings CA

. 1995 Expressie van recombinante kattentumornecrosefactor is toxisch voor Escherichia coli . clin. Diagnose Laboratorium. Immunol . 2, 740-746. PubMed, Google Scholar

. 2010 Strategieën om eiwitexpressie te optimaliseren in E coli . Curr. Protoc. Eiwit Sc. 5, 21–29. (doi:10.1002/0471140864.ps0524s61) Google Scholar

2008 Eiwitproductie en -zuivering. nat. Methoden: 5, 135-146. (doi:10.1038/nmeth.f.202) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 1986 Gebruik van bacteriofaag T7 RNA-polymerase om selectieve expressie op hoog niveau van gekloonde genen te sturen. J. Mol. Biol . 189, 113-130. (doi:10.1016/0022-2836(86)90385-2) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2000 Verminderde achtergrondexpressie en verbeterde plasmidestabiliteit met pET-vectoren in BL21(DE3). BioTechnieken 29, 1234-1238. Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2004 T7-lysozym onderdrukt de transcriptie van T7-RNA-polymerase door het open complex tijdens de initiatie te destabiliseren. J. Biol. Chemo . 279, 16 136–16 143. (doi:10.1074/jbc.M400139200) Crossref, Google Scholar

. 1996 Overproductie van eiwitten in Escherichia coli: mutante gastheren die de synthese van sommige membraaneiwitten en bolvormige eiwitten op hoge niveaus mogelijk maken. J. Mol. Biol . 260, 289-298. (doi:10.1006/jmbi.1996.0399) Crossref, PubMed, Google Scholar

2008 Tuning Escherichia coli voor overexpressie van membraaneiwitten. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 105, 14 371–14 376. (doi:10.1073/pnas.0804090105) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 1983 Vergelijking van de initiatie van eiwitsynthese in prokaryoten, eukaryoten en organellen. microbiologisch. Rev . 47, 1-45. PubMed, Google Scholar

Cheong DE, Ko KC, Han Y, Jeon HG, Sung BH, Kim GJ, Choi JH, Song JJ

. 2015 Verbetering van de functionele expressie van heterologe eiwitten door willekeurige substitutie van genetische codes in het 5'-coderende gebied. Biotechnologie. Bioeng . 112, 822-826. (doi:10.1002/bit.25478) Crossref, PubMed, Google Scholar

2013 Nauwkeurige en betrouwbare genexpressie via standaard transcriptie- en translatie-initiatie-elementen. nat. Methoden: 10, 354-360. (doi:10.1038/nmeth.2404) Crossref, PubMed, Google Scholar

Liebeton K, Lengefeld J, Eck J

. 2014 De nucleotidesamenstelling van de spacersequentie beïnvloedt de expressieopbrengst van heteroloog tot expressie gebrachte genen in Bacillus subtilis . J. Biotechnologie . 191, 214-220. (doi:10.1016/j.jbiotec.2014.06.027) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2012 Fijnafstemming van gennetwerken met behulp van eenvoudige sequentieherhalingen. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 109, 16 817–16 822. (doi:10.1073/pnas.1205693109) Crossref, Google Scholar

Mirzadeh K, Martinez V, Toddo S, Guntur S, Herrgard MJ, Elofsson A, Norholm MH, Daley DO

. 2015 Verbeterde eiwitproductie in Escherichia coli door optimalisatie van kloneringslittekens op de vectorcoderende sequentieverbinding. ACS-synth. Biol . 4, 959-965. (doi:10.1021/acssynbio.5b00033) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2005 Regulatie van translatie via mRNA-structuur in prokaryoten en eukaryoten. Gen 361, 13–37. (doi:10.1016/j.gene.2005.06.037) Crossref, PubMed, Google Scholar

Goltermann L, Borch Jensen M, Bentin T

. 2011 Afstemming van eiwitexpressie met behulp van synonieme codonbibliotheken gericht op het 5'-mRNA-coderende gebied. Eiwit Eng. des. Sel . 24, 123-129. (doi:10.1093/proteïne/gzq086) Crossref, PubMed, Google Scholar

Bentele K, Saffert P, Rauscher R, Ignatova Z, Bluthgen N

. 2013 Efficiënte translatie-initiatie dicteert codongebruik bij het starten van een gen. Mol. Syst. Biol . 9, 675. (doi:10.1038/msb.2013.32) Crossref, PubMed, Google Scholar

Goodman DB, Church GM, Kosuri S

. 2013 Oorzaken en effecten van N-terminale codonbias in bacteriële genen. Wetenschap 342, 475-479. (doi: 10.1126/science.1241934) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2010 Een evolutionair geconserveerd mechanisme voor het regelen van de efficiëntie van eiwittranslatie. Cel 141, 344-354. (doi:10.1016/j.cell.2010.03.031) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2016 Codon-invloed op eiwitexpressie in E coli correleert met mRNA-niveaus. Natuur 529, 358-363. (doi:10.1038/nature16509) Crossref, PubMed, Google Scholar

Castillo-Mendez MA, Jacinto-Loeza E, Olivares-Trejo JJ, Guarneros-Pena G, Hernandez-Sanchez J

. 2012 Adenine-bevattende codons verbeteren de eiwitsynthese door mRNA-binding aan ribosomale 30S-subeenheden te bevorderen, op voorwaarde dat specifieke tRNA's niet worden uitgeput. Biochimie 94, 662-672. (doi:10.1016/j.biochi.2011.09.019) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2014 Methode voor het verbeteren van plant-redox-gerelateerde eiwitexpressie en de toepassing ervan voor: in vitro vermindering van chloroplastische thioredoxines. Eiwit Expr. Purif . 101, 152-156. (doi:10.1016/j.pep.2014.07.001) Crossref, PubMed, Google Scholar

Krishna Rao DV, Rao JV, Narasu ML, Bhujanga Rao AK

. 2008 Optimalisatie van het AT-gehalte van codons onmiddellijk stroomafwaarts van het startcodon en evaluatie van kweekomstandigheden voor expressie op hoog niveau van recombinant humaan G-CSF in Escherichia coli . Mol. Biotechnologie . 38, 221-232. (doi:10.1007/s12033-007-9018-3) Crossref, PubMed, Google Scholar

Care S, Bignon C, Pelissier MC, Blanc E, Canard B, Coutard B

. 2008 De vertaling van recombinante eiwitten in E coli kan worden verbeterd door in silico het genereren en screenen van willekeurige bibliotheken van een A70/+96 mRNA-gebied met betrekking tot het translatie-initiatiecodon. Nucleïnezuren Res . 36, e6. (doi:10.1093/nar/gkm1097) Crossref, PubMed, Google Scholar

Salis HM, Mirsky EA, Voigt CA

. 2009 Geautomatiseerd ontwerp van synthetische ribosoombindingsplaatsen om eiwitexpressie te controleren. nat. Biotechnologie . 27, 946-950. (doi:10.1038/nbt.1568) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2010 RBSDesigner: software voor het ontwerpen van synthetische ribosoombindingsplaatsen die een gewenst niveau van eiwitexpressie opleveren. Bio-informatica 26, 2633-2634. (doi:10.1093/bioinformatics/btq458) Crossref, PubMed, Google Scholar

Seo SW, Yang JS, Kim I, Yang J, Min BE, Kim S, Jung GY

. 2013 Voorspellend ontwerp van het mRNA-translatie-initiatiegebied om de prokaryotische translatie-efficiëntie te beheersen. Metab. Eng . 15, 67-74. (doi:10.1016/j.ymben.2012.10.006) Crossref, PubMed, Google Scholar

Bonde MT, Pedersen M, Klausen MS, Jensen SI, Wulff T, Harrison S, Nielsen AT, Herrgard MJ, Sommer MOA

. 2016 Voorspelbare afstemming van eiwitexpressie in bacteriën. nat. Methoden: 13, 233-236. (doi:10.1038/nmeth.3727) Crossref, PubMed, Google Scholar

Reeve B, Hargest T, Gilbert C, Ellis T

. 2014 Initiatiepercentages voor vertalingen voorspellen voor het ontwerpen van synthetische biologie. Voorkant. Bioeng. Biotechnologie . 2, 1. (doi:10.3389/fbioe.2014.00001) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 1989 Moleculair klonen: een laboratoriumhandleiding , 2e ed. New York, NY: Cold Spring Laboratory Press. Google geleerde

. 2004 Overzicht van affiniteitstags voor eiwitzuivering. Curr. Protoc. Eiwit Sc. 9, 9. (doi:10.1002/0471140864.ps0909s36) PubMed, Google Scholar

Costa S, Almeida A, Castro A, Domingues L

. 2014 Fusion-tags voor eiwitoplosbaarheid, zuivering en immunogeniciteit in Escherichia coli: het nieuwe Fh8-systeem. Voorkant. microbiologisch. 5, 63. (doi:10.3389/fmicb.2014.00063) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2013 Verschillende affiniteitstags die vaak worden gebruikt bij chromatografische zuivering. J. Anaal. Methoden Chem . 2013, 581093. (doi: 10.1155/2013/581093) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2001 Perspectieven van geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie. J. Biochem. Biofysica. Methoden: 49, 335-360. (doi:10.1016/S0165-022X(01)00207-X) Crossref, PubMed, Google Scholar

Schmidt PM, Sparrow LG, Attwood RM, Xiao X, Adams TE, McKimm-Breschkin JL

. 2012 Neerhalen van de VLAG! Hoe expressie van insectencellen een gevestigd tag-systeem uitdaagt PLoS ONE 7, e37779. (doi:10.1371/journal.pone.0037779) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2007 Het Strep-tag-systeem voor eenstapszuivering en detectie of afvanging van eiwitten met hoge affiniteit. nat. protocol . 2, 1528-1535. (doi:10.1038/nprot.2007.209) Crossref, PubMed, Google Scholar

Dyson MR, Shadbolt SP, Vincent KJ, Perera RL, McCafferty J

. 2004 Productie van oplosbare zoogdiereiwitten in Escherichia coli: identificatie van eiwitkenmerken die correleren met succesvolle expressie . BMC Biotechnologie . 4, 32. (doi:10.1186/1472-6750-4-32) Crossref, PubMed, Google Scholar

Zuo X, Li S, Hall J, Mattern MR, Tran H, Shoo J, Tan R, Weiss SR, Butt TR

. 2005 Verbeterde expressie en zuivering van membraaneiwitten door SUMO-fusie in Escherichia coli . J. Struct. Functie genomica 6, 103-111. (doi:10.1007/s10969-005-2664-4) Crossref, PubMed, Google Scholar

Hammon J, Palanivelu DV, Chen J, Patel C, Minor DL

. 2009 Een groen fluorescerend eiwitscherm voor identificatie van goed tot expressie gebrachte membraaneiwitten van een cohort van extremofiele organismen. Proteïne wetenschap . 18, 121-133. (doi:10.1002/pro.18) PubMed, Google Scholar

Lilius G, Persson M, Bulow L, Mosbach K

. 1991 Metaalaffiniteitsprecipitatie van eiwitten die genetisch gehechte polyhistidine-affiniteitsstaarten dragen. EUR. J. Biochem . 198, 499-504. (doi:10.1111/j.1432-1033.1991.tb16042.x) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2003 Expressie op hoog niveau en snelle zuivering van genen met zeldzame codons uit hyperthermofiele archaea door het GST-genfusiesysteem. J. Chromatogr. B Analist. technologie. biomed. Levenswetenschappen . 786, 177-185. (doi:10.1016/S1570-0232(02)00810-3) Crossref, PubMed, Google Scholar

Coleman MA, Lao VH, Segelke BW, Beernink PT

. 2004 High-throughput, op fluorescentie gebaseerde screening voor oplosbare eiwitexpressie. J. Proteoomonderzoek . 3, 1024-1032. (doi:10.1021/pr049912g) Crossref, PubMed, Google Scholar

Hewitt SN, Choi R, Kelley A, Crowther GJ, Napuli AJ, Van Voorhis WC

. 2011 Expressie van eiwitten in Escherichia coli als fusies met maltose-bindend eiwit om niet tot expressie gebrachte doelen te redden in een pijplijn voor eiwitexpressie en zuivering met hoge doorvoer. Acta Crystallogr. Sekte. F-structuur. Biol. kristal. gemeenschappelijk . 67, 1006-1009. (doi:10.1107/s1744309111022159) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2006 Verbetering van oplosbare eiwitexpressie door het gebruik van fusietags. Curr. Opin. Biotechnologie . 17, 353-358. (doi:10.1016/j.copbio.2006.06.03) Crossref, PubMed, Google Scholar

Costa SJ, Coelho E, Franco L, Almeida A, Castro A, Domingues L

. 2013 De Fh8-tag: een fusiepartner voor eenvoudige en kosteneffectieve eiwitzuivering in Escherichia coli . Eiwit Expr. zuiver. 92, 163-170. (doi:10.1016/j.pep.2013.09.013) Crossref, PubMed, Google Scholar

McCluskey AJ, Poon GM, Gariepy J

. 2007 Een snelle en universele tandemzuiveringsstrategie voor recombinante eiwitten. Proteïne wetenschap . 16, 2726-2732. (doi: 10.1110/ps.072894407) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2010 Veelgebruikte tagcombinaties voor tandem-affiniteitszuivering. Biotechnologie. toepassing biochemisch . 55, 73-83. (doi:10.1042/ba20090273) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2000 Membraantopologie en insertie van membraaneiwitten: zoeken naar topogene signalen. microbiologisch. Mol. Biol. Rev . 64, 13-33. (doi:10.1128/mmbr.64.1.13-33.2000) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2005 Een schaalbare, op GFP gebaseerde pijplijn voor screening en zuivering van overexpressie van membraaneiwitten. Eiwit Sc. 14, 2011-2017. (doi: 10.1110/ps.051466205) Crossref, PubMed, Google Scholar

Drew D, Lerch M, Kunji E, Slotboom DJ, de Gier JW

. 2006 Optimalisatie van overexpressie en zuivering van membraaneiwit met behulp van GFP-fusies. nat. Methoden: 3, 303-313. (doi:10.1038/nmeth0406-303) Crossref, PubMed, Google Scholar

Drew D, Newstead S, Sonoda Y, Kim H, von Heijne G, Iwata S

. 2008 Op GFP gebaseerd optimalisatieschema voor de overexpressie en zuivering van eukaryote membraaneiwitten in Saccharomyces cerevisiae . nat. Protoc. 3, 784-798. (doi:10.1038/nprot.2008.44) Crossref, PubMed, Google Scholar

Backmark AE, Olivier N, Snijder A, Gordon E, Dekker N, Ferguson AD

. 2013 Fluorescerende sonde voor screening met hoge doorvoer van membraaneiwitexpressie. Proteïne wetenschap . 22, 1124-1132. (doi:10.1002/pro.2297) Crossref, PubMed, Google Scholar

Zhang YB, Howitt J, McCorkle S, Lawrence P, Springer K, Freimuth P

. 2004 Eiwitaggregatie tijdens overexpressie beperkt door peptide-extensies met grote netto negatieve lading. Eiwit Expr. zuiver. 36, 207-216. (doi:10.1016/j.pep.2004.04.020) Crossref, PubMed, Google Scholar

Roosild TP, Greenwald J, Vega M, Castronovo S, Riek R, Choe S

. 2005 NMR-structuur van Mistic, een membraanintegrerend eiwit voor membraaneiwitexpressie. Wetenschap 307, 1317-1321. (doi: 10.1126/science.1106392) Crossref, PubMed, Google Scholar

Leviatan S, Sawada K, Moriyama Y, Nelson N

. 2010 Combinatorische methode voor overexpressie van membraaneiwitten in Escherichia coli . J. Biol. Chemo . 285, 23 548–23 556. (doi:10.1074/jbc.M110.125492) Crossref, Google Scholar

. 2001 Screening op oplosbare expressie van recombinante eiwitten in een formaat met 96 putjes. Anaal. biochemisch . 297, 79-85. (doi:10.1006/abio.2001.5331) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2013 High-throughput onmiddellijke kwantificering van eiwitexpressie en zuiverheid op basis van fotoactief geel eiwit turn off/on label. Eiwit Sc. 22, 1109-1117. (doi:10.1002/pro.2286) Crossref, PubMed, Google Scholar

2016 Geautomatiseerd op structuur en sequentie gebaseerd ontwerp van eiwitten voor hoge bacteriële expressie en stabiliteit. Mol. Cel 63, 337-346. (doi:10.1016/j.molcel.2016.06.012) Crossref, PubMed, Google Scholar

2015 Shear-stress-gemedieerde hervouwing van eiwitten uit aggregaten en inclusielichamen. Chembiochemisch 16, 393-396. (doi:10.1002/cbic.201402427) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2011 Een overzicht van enzymatische reagentia voor het verwijderen van affiniteitstags. Eiwit Expr. zuiver. 80, 283-293. (doi:10.1016/j.pep.2011.08.005) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2011 De variabele detergensgevoeligheid van proteasen die worden gebruikt voor het verwijderen van recombinante eiwitaffiniteitstags. Eiwit Expr. zuiver. 78, 139-142. (doi:10.1016/j.pep.2011.04.011) Crossref, PubMed, Google Scholar

Davis GJ, Wang QM, Cox GA, Johnson RB, Wakulchik M, Dotson CA, Villarreal EC

. 1997 Expressie en zuivering van recombinant rhinovirus 14 3CD-proteïnase en zijn vergelijking met het 3C-proteïnase. Boog. Biochem. biofysische . 346, 125-130. (doi:10.1006/abbi.1997.0291) Crossref, PubMed, Google Scholar

Joseph BC, Pichaimuthu S, Srimeenakshi S, Murthy M, Selvakumar K, Ganesan M, Manjunath SR

. 2015 Een overzicht van de parameters voor recombinante eiwitexpressie in Escherichia coli . J. Cel Wetenschap. daar . 6, 5. (doi: 10.4172/2157-7013.1000221) Crossref, Google Scholar

Wu X, Jörnvall H, Berndt KD, Oppermann U

. 2004 Codonoptimalisatie onthult kritische factoren voor expressie op hoog niveau van twee zeldzame codongenen in Escherichia coli: RNA-stabiliteit en secundaire structuur, maar geen overvloed aan tRNA. Biochem. Biofysica. Onderzoek gemeenschappelijk . 313, 89-96. (doi:10.1016/j.bbrc.2003.11.091) Crossref, PubMed, Google Scholar

Prinz WA, Aslund F, Holmgren A, Beckwith J

. 1997 De rol van de thioredoxine- en glutaredoxineroutes bij het verminderen van eiwitdisulfidebindingen in de Escherichia coli cytoplasma. J. Biol. Chem. 272, 15 661-15 667. (doi:10.1074/jbc.272.25.15661) Crossref, Google Scholar

Zhang HC, Cisneros RJ, Dunlap RB, Johnson LF

. 1989 Efficiënte synthese van muisthymidylaatsynthase in Escherichia coli . Gen 84, 487-491. (doi:10.1016/0378-1119(89)90525-8) Crossref, PubMed, Google Scholar

Weiner M, Anderson C, Jerpseth B, Wells S, Johnson-Browne B, Vaillancourt P

. 1994 Studier pET-systeemvectoren en gastheren. strategie. Mol. Biol . 7, 41–43. Google geleerde

2003 Expressie van een recombinant IRP-achtig Plasmodium falciparum eiwit dat specifiek vermeende plasmodiale IRE's bindt. Mol. Biochem. Parasitol . 126, 231-238. (doi:10.1016/S0166-6851(02)00278-5) Crossref, PubMed, Google Scholar

Schlegel S, Lofblom J, Lee C, Hjelm A, Klepsch M, Strous M, Drew D, Slotboom DJ, de Gier JW

. 2012 Optimalisatie van overexpressie van membraaneiwit in de Escherichia coli stam Lemo21(DE3). J. Mol. Biol . 423, 648-659. (doi:10.1016/j.jmb.2012.07.019) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Lopez PJ, Marchand I, Joyce SA, Dreyfus M

. 1999 De C-terminale helft van RNase E, die de Escherichia coli degradosoom, neemt deel aan mRNA-afbraak maar niet aan rRNA-verwerking in vivo . Mol. microbiologisch . 33, 188-199. (doi:10.1046/j.1365-2958.1999.01465.x) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2013 Uitbreiding van het landschap van de productie van recombinante eiwitten in Escherichia coli . Biotechnologie. Lett . 35, 1971-1981. (doi:10.1007/s10529-013-1396-y) Crossref, PubMed, Google Scholar

Murata T, Shinozuka Y, Obata Y, Yokoyama KK

. 2008 Fosforylering van twee eukaryote transcriptiefactoren, Jun-dimerisatie-eiwit 2 en activatietranscriptiefactor 2, in Escherichia coli door Jun N-terminaal kinase 1 . Anaal. biochemisch . 376, 115-121. (doi:10.1016/j.ab.2008.01.038) Crossref, PubMed, Google Scholar

2002 N-gebonden glycosylering in Campylobacter jejuni en de functionele overdracht ervan naar E coli . Wetenschap 298, 1790-1793. (doi: 10.1126/science.298.5599.1790) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Ihssen J, Kowarik M, Dilettoso S, Tanner C, Wacker M, Thony-Meyer L

. 2010 Productie van glycoproteïnevaccins in Escherichia coli . microb. Cel feit . 9, 61. (doi:10.1186/1475-2859-9-61) Crossref, PubMed, Google Scholar

Lizak C, Fan YY, Weber TC, Aebi M

. 2011 N-gebonden glycosylering van antilichaamfragmenten in Escherichia coli . Bioconjug. Chemo . 22, 488-496. (doi:10.1021/bc100511k) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2012 Functionele reconstitutie van een afstembare E3-afhankelijke sumoyleringsroute in Escherichia coli . PLoS ONE 7, e38671. (doi:10.1371/journal.pone.0038671) Crossref, PubMed, Google Scholar

Magnani R, Chaffin B, Dick E, Bricken ML, Houtz RL, Bradley LH

. 2012 Gebruik van een co-expressiesysteem van calmoduline-lysine-methyltransferase voor het genereren van een combinatorische bibliotheek van post-translationeel gemodificeerde eiwitten. Eiwit Expr. zuiver. 86, 83-88. (doi:10.1016/j.pep.2012.09.012) Crossref, PubMed, Google Scholar

Duronio RJ, Jackson-Machelski E, Heuckeroth RO, Olins PO, Devine CS, Yonemoto W, Slice LW, Taylor SS, Gordon JI

. 1990 Eiwit N-myristoylering in Escherichia coli: reconstitutie van een eukaryote eiwitmodificatie in bacteriën. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 87, 1506-1510. (doi:10.1073/pnas.87.4.1506) Crossref, PubMed, Google Scholar

Ren Y, Yao X, Dai H, Li S, Fang H, Chen H, Zhou C

. 2011 Productie van Nα-geacetyleerd thymosine α1 in Escherichia coli . microb. Cel feit . 10, 26. (doi:10.1186/1475-2859-10-26) Crossref, PubMed, Google Scholar

Gubellini F, Verdon G, Karpowich NK, Luff JD, Boel G, Gauthier N, Handelman SK, Ades SE, Hunt JF

. 2011 Fysiologische reactie op overexpressie van membraaneiwit in E. coli . Mol. Cel Proteomics 10, M111.007930. (doi:10.1074/mcp.M111.007930) Crossref, PubMed, Google Scholar

2011 Het overwinnen van barrières voor de bepaling van de membraaneiwitstructuur. nat. Biotechnologie . 29, 335-340. (doi:10.1038/nbt.1833) Crossref, PubMed, Google Scholar

Marreddy RKR, Geertsma ER, Poolman B

. 2011 Recombinante membraaneiwitproductie: verleden, heden en toekomst. In Supramoleculaire structuur en functie 10 (eds

Brnjas-Kraljević J, Pifat-Mrzljak G

), blz. 41-74. Dordrecht, Nederland : Springer . Crossref, Google Scholar

Luirink J, Yu Z, Wagner S, de Gier JW

. 2012 Biogenese van binnenmembraaneiwitten in Escherichia coli . Biochim. Biofysica. Acta . 1817, 965-976. (doi:10.1016/j.bbabio.2011.12.006) Crossref, PubMed, Google Scholar

Kwon SK, Kim SK, Lee DH, Kim JF

. 2015 Vergelijkende genomica en experimentele evolutie van Escherichia coli BL21(DE3)-stammen onthullen het landschap van ontsnapping van toxiciteit door overproductie van membraaneiwit. Wetenschap. vertegenwoordiger . 5, 16076. (doi:10.1038/srep16076) Crossref, PubMed, Google Scholar

Wagner S, Baars L, Ytterberg AJ, Klussmeier A, Wagner CS, Nord O, Nygren PÅ, van Wijk KJ, de Gier JW

. 2007 Gevolgen van overexpressie van membraaneiwit in Escherichia coli . Mol. Cel. Proteomics 6, 1527-1550. (doi:10.1074/mcp.M600431-MCP200) Crossref, Google Scholar

Chen Y, Song J, Sui SF, Wang DN

. 2003 DnaK en DnaJ faciliteerden het vouwproces en verminderden de vorming van inclusielichaampjes van magnesiumtransporter CorA, tot overexpressie gebracht in Escherichia coli . Eiwit Expr. zuiver. 32, 221-231. (doi:10.1016/S1046-5928(03)00233-X) Crossref, PubMed, Google Scholar

Link AJ, Skretas G, Strauch EM, Chari NS, Georgiou G

. 2008 Efficiënte productie van membraangeïntegreerde en in detergent oplosbare G-eiwitgekoppelde receptoren in Escherichia coli . Proteïne wetenschap . 17, 1857-1863. (doi: 10.1110/ps.035980.108) Crossref, PubMed, Google Scholar

Skretas G, Makino T, Varadarajan N, Pogson M, Georgiou G

. 2012 Multi-copy genen die de opbrengst van aan G-eiwit gekoppelde receptoren bij zoogdieren verhogen in Escherichia coli . Metab. Eng . 14, 591-602. (doi:10.1016/j.ymben.2012.05.001) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2009 Genetische analyse van G-eiwit-gekoppelde receptorexpressie in Escherichia coli: Remmende rol van DnaJ op de membraanintegratie van de menselijke centrale cannabinoïdereceptor . Biotechnologie. Bioeng . 102, 357-367. (doi:10.1002/bit.22097) Crossref, PubMed, Google Scholar

Schlegel S, Hjelm A, Baumgarten T, Vikstrom D, de Gier JW

. 2014 Op bacteriën gebaseerde productie van membraaneiwitten. Biochim. Biofysica. Acta . 1843, 1739-1749. (doi:10.1016/j.bbamcr.2013.10.023) Crossref, PubMed, Google Scholar

Sezonov G, Joseleau-Petit D, D'Ari R

. 2007 Escherichia coli fysiologie in Luria-Bertani-bouillon. J. Bacteriol . 189, 8746-8749. (doi:10.1128/jb.01368-07) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2005 Eiwitproductie door auto-inductie in schudculturen met hoge dichtheid. Eiwit Expr. zuiver. 41, 207-234. (doi:10.1016/j.pep.2005.01.016) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Losen M, Frölich B, Pohl M, Büchs J

. 2004 Effect van zuurstofbeperking en mediumsamenstelling op Escherichia coli fermentatie in schudflesculturen. Biotechnologie. Prog . 20, 1062-1068. (doi:10.1021/bp034282t) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2006 Productie van recombinante eiwitten door kweek met hoge celdichtheid Escherichia coli . Chem. Ing. technologie . 61, 876-885. (doi:10.1016/j.ces.2005.03.031) Crossref, Google Scholar

Lied JM, An YJ, Kang MH, Lee YH, Cha SS

. 2012 Teelt bij 6-10°C is een effectieve strategie om de onoplosbaarheid van recombinante eiwitten in Escherichia coli . Eiwit Expr. zuiver. 82, 297-301. (doi:10.1016/j.pep.2012.01.020) Crossref, PubMed, Google Scholar

Castellanos-Mendoza A, Castro-Acosta RM, Olvera A, Zavala G, Mendoza-Vera M, García-Hernández E, Alagón A, Trujillo-Roldán MA, Valdez-Cruz NA

. 2014 Invloed van pH-controle op de vorming van inclusielichaampjes tijdens de productie van recombinant sfingomyelinase-D in Escherichia coli . microb. Cel feit. 13, 1-14. (doi:10.1186/s12934-014-0137-9) Crossref, PubMed, Google Scholar

Yang Q, Xu J, Li M, Lei X, An L

. 2003 Expressie op hoog niveau van een oplosbaar slangengif-enzym, gloshedobin, in E coli in aanwezigheid van metaalionen. Biotechnologie. Lett . 25, 607-610. (doi:10.1023/A:1023067626846) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2005 Oplosbare expressie van recombinante eiwitten in het cytoplasma van Escherichia coli . microb. Cel feit. 4, 1–8. (doi:10.1186/1475-2859-4-1) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2015 Triton X-100 verbetert de oplosbaarheid en secretieverhouding van aggregatiegevoelige pullulanase geproduceerd in Escherichia coli . Bioresource. technologie . 194, 137-143. (doi:10.1016/j.biortech.2015.07.024) Crossref, PubMed, Google Scholar

Mondal S, Shet D, Prasanna C, Atreya HS

. 2013 Hoge opbrengst expressie van eiwitten in E coli voor NMR-onderzoeken. Adv. Biosc. Biotechnologie . 4, 751-767. (doi:10.4236/abb.2013.46099) Crossref, Google Scholar

. 2015 Het oplosbaarheidsprobleem overwinnen in E coli: beschikbare benaderingen voor de productie van recombinante eiwitten. Methoden Mol. Biol. 1258, 27-44. (doi:10.1007/978-1-4939-2205-5_2) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2011 Afstemming van verschillende expressieparameters om oplosbare recombinante eiwitten te verkrijgen in E coli: voordelen van high-throughput screening . Biotechnologie. J . 6, 715-730. (doi:10.1002/biot.201100025) Crossref, PubMed, Google Scholar

Ukkonen K, Mayer S, Vasala A, Neubauer P

. 2013 Gebruik van langzame glucosetoevoer als ondersteunende koolstofbron in auto-inductiemedium voor lactose verbetert de robuustheid van eiwitexpressie bij verschillende beluchtingsomstandigheden. Eiwit Expr. zuiver. 91, 147-154. (doi:10.1016/j.pep.2013.07.016) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2013 Uitdrukking in Escherichia coli: steeds sneller en complexer worden . Curr. Opin. structuur. Biol . 23, 326-334. (doi:10.1016/j.sbi.2013.01.006) Crossref, PubMed, Google Scholar

Rohe P, Venkanna D, Kleine B, Freudl R, Oldiges M

. 2012 Een geautomatiseerde workflow voor het verbeteren van microbiële bioprocesoptimalisatie op een nieuw microbioreactorplatform. microb. Cel feit. 11, 1-14. (doi:10.1186/1475-2859-11-144) Crossref, PubMed, Google Scholar

Lange Q, Liu X, Yang Y, Li L, Harvey L, McNeil B, Bai Z

. 2014 De ontwikkeling en toepassing van high-throughput teelttechnologie in de ontwikkeling van bioprocessen. J. Biotechnologie . 192, 323-338. (doi:10.1016/j.jbiotec.2014.03.028) Crossref, PubMed, Google Scholar

Grunzel P, Pilarek M, Steinbruck D, Neubauer A, Merk E, Kumke MU, Neubauer P, Krause M

. 2014 Mini-schaal kweekmethode maakt snelle plasmideproductie mogelijk in Escherichia coli . Biotechnologie. J . 9, 128-136. (doi:10.1002/biot.201300177) Crossref, PubMed, Google Scholar

Kong F, Yuan L, Zheng YF, Chen W

. 2012 Automatische vloeistofbehandeling voor life science: een kritische beoordeling van de huidige stand van de techniek. J. Lab. Auto . 17, 169-185. (doi:10.1177/2211068211435302) Crossref, PubMed, Google Scholar

Hughes SR, Butt TR, Bartolett S, Riedmuller SB, Farrelly P

. 2011 Ontwerp en bouw van een eerste-generatie high-throughput geïntegreerd robotisch moleculair biologieplatform voor bio-energietoepassingen. J. Lab. Auto . 16, 292-307. (doi:10.1016/j.jala.2011.04.004) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2015 Robotic high-throughput zuivering van affiniteit-gelabelde recombinante eiwitten. Methoden Mol. Biol. 1286, 97-106. (doi:10.1007/978-1-4939-2447-9_9) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2016 Geautomatiseerde monstervoorbereiding. Wetenschap 351, 300-302. (doi: 10.1126/science.351.6270.300) Crossref, Google Scholar

. 2013 Recombinant-polypeptideproductie in E coli: naar een rationele aanpak om de opbrengst van functionele eiwitten te verbeteren . microb. Cel feit . 12, 101. (doi:10.1186/1475-2859-12-101) Crossref, PubMed, Google Scholar


Waarom heeft T5-exonuclease geen endonuclease-activiteit in Gibson-assemblage? - Biologie

De opkomende plagen en fytopathogenen hebben de opbrengst en kwaliteit van gewassen verminderd, wat de wereldwijde voedselzekerheid in gevaar heeft gebracht. Traditionele veredelingsmethoden, op moleculaire merkers gebaseerde veredelingsbenaderingen en het gebruik van genetisch gemodificeerde gewassen hebben een cruciale rol gespeeld bij het versterken van de voedselzekerheid wereldwijd. Het gebruik ervan bij het verbeteren van gewassen is echter zeer beperkt gebleven vanwege meerdere kanttekeningen. Genoombewerkingstools zoals transcriptionele activator-achtige effector-nucleasen en geclusterde regelmatig interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-geassocieerde endonuclease Cas9 (CRISPR/Cas9) hebben de beperkingen van de conventionele veredelingsmethoden effectief overwonnen en worden algemeen aanvaard voor de verbetering van gewassen. Onder de tools voor genoombewerking is het CRISPR/Cas9-systeem naar voren gekomen als het krachtigste instrument voor genoombewerking vanwege zijn efficiëntie, vriendelijkheid, flexibiliteit, lage kosten en aanpassingsvermogen. Geaccumuleerde bewijzen geven aan dat genome editing een groot potentieel heeft bij het verbeteren van de ziekteresistentie in gewassen. In deze review hebben we een korte inleiding gegeven over de mechanismen van verschillende genoombewerkingssystemen en vervolgens recente ontwikkelingen in CRISPR / Cas9-systeemgebaseerde genoombewerking besproken om de weerstand tegen rijstziekte door verschillende strategieën te verbeteren. Deze review besprak ook de mogelijke toepassingen van recent ontwikkelde benaderingen voor genoombewerking, zoals CRISPR/Cas12a (voorheen bekend als Cpf1) en base-editors voor het verbeteren van de weerstand tegen rijstziekte.

Rijst (Oryza sativa L.) dient als de belangrijkste bron van koolhydraten voor meer dan twee derde van de wereldbevolking. De snelgroeiende bevolking in combinatie met klimaatverandering en de opkomst van nieuwe fytopathogenen hebben een drastisch effect op de wereldwijde rijstproductiviteit. In de afgelopen decennia hebben de traditionele veredelingsbenaderingen, waaronder mutatieveredeling en moleculaire veredeling, aanzienlijk bijgedragen aan de ontwikkeling van effectieve strategieën voor ziekteresistentie in rijst, zoals vereist voor het versterken van de wereldwijde voedselzekerheid. Deze methoden zijn echter tijdrovend en arbeidsintensief. Genoverdrachtstechnieken door middel van Agrobacterium-gebaseerde transformatie en andere benaderingen hebben de opbrengst, kwaliteit en ziekteresistentie bij planten aanzienlijk verbeterd. De bioveiligheidsvoorschriften en sociale en ethische kwesties met betrekking tot transgene gewassen zijn echter altijd een grote belemmering geweest voor de publieke acceptatie van deze genetisch gemodificeerde (GM) gewassen (Lusser et al, 2012). Daarna zijn betere strategieën voor hoogproductieve en stressbestendige rijstvariëteiten de behoefte van het uur om de rijstproductiviteit te verhogen en de wereldwijde voedselzekerheid te waarborgen.

Plantenziekten zijn de belangrijkste belemmeringen voor de ontwikkeling van de landbouw en de wereldwijde voedselzekerheid. Gewassen zijn vatbaar voor een breed scala aan pathogenen, waaronder bacteriën, virussen en schimmels, die aanzienlijke economische verliezen veroorzaken (FAO, 2017). De ziekteverwekkers beïnvloeden de groei en ontwikkeling van gewassen, wat resulteert in een enorm opbrengstverlies en hindernissen opwerpen voor duurzame landbouw. Meerdere strategieën voor ziektebeheer en risicobeoordelingsinstrumenten, waaronder het gebruik van protocollen voor het voorspellen van ziekten, combinatorisch gebruik van chemicaliën, fungiciden en biologische bestrijdingsmiddelen, vruchtwisseling en veredeling van gastheerresistentie, zijn al heel lang in de praktijk (Ul Haq en Ijaz, 2020) . De meeste van deze strategieën zijn echter ontoereikend om successen te behalen in veel pathosystemen als gevolg van diversiteit in gastheerbereik van de fytopathogenen, milieutoxiciteit, discrepantie in de beoordeling van ziekteresistentiereactie en inefficiënte ziektevoorspellingssystemen. Daarom is het begrijpen van het moleculaire mechanisme dat de interactie tussen gastheer en de ziekteverwekker bepaalt van cruciaal belang voor de ontwikkeling van een effectieve strategie voor ziekteresistentie.

Planten gebruiken meerdere resistentiereacties om de kolonisatie door pathogene micro-organismen te voorkomen. Aan de ene kant wordt de resistentie van planten tegen fytopathogenen typisch gereguleerd door de resistentie (R) genen die coderen voor nucleotide-bindende leucine-rich repeat (NB-LRR's) eiwitten, die de moleculaire activiteit van pathogene effector-eiwitten in de plantencel neutraliseren (Cui et al, 2015). Aan de andere kant, gerichte mutatie of knock-out van gevoeligheid (S) gen (en) dat fungeert als een gastheer-pathogeen compatibiliteitsfactor, induceert ook recessieve immuniteit tegen de aangepaste fytopathogenen (van Schie en Takken, 2014). Aangezien de meeste plantenziekten ontstaan ​​door een compatibele interactie tussen gastheer en ziekteverwekker, verandert de S-gen(en) die compatibiliteit bevorderen, kunnen van groot belang zijn bij de ontwikkeling van breedspectrum en duurzame moleculaire veredelingsstrategieën voor ziekteresistentie (van Schie en Takken, 2014).

Onlangs heeft de opkomst van meerdere nieuwe veredelingstechnieken, waaronder snelle kweekplatforms, genotypering met hoge doorvoer en nauwkeurige genoombewerking in combinatie met genetische manipulatie, met succes meerdere ziektevrije, hoogproductieve gewasvariëteiten gegenereerd (Li et al, 2020). Onder hen zijn de benaderingen voor genoombewerking naar voren gekomen als de revolutionaire hulpmiddelen voor gewasverbetering (Voytas en Gao, 2014). De hulpmiddelen voor het bewerken van het genoom worden weergegeven door sequentiespecifieke nucleasen (SSN's) die een dubbelstrengs DNA-breuk introduceren in een specifiek genoomgebied, waardoor de DNA-herstelroutes van de gastheer worden geïnduceerd, hetzij door homologe recombinatie (HR) of door niet-homologe end-joining (NHEJ) ( Sander en Joung, 2014). Hoewel NHEJ een foutgevoelige methode is die willekeurige mutaties creëert die leiden tot frameverschuiving en knock-out van het doelgen, is de HR-route veel nauwkeuriger, wat resulteert in genvervanging of gen-knock-in wanneer donor-DNA-sjablonen beschikbaar zijn (Baltes et al, 2015). Desalniettemin resulteren deze natuurlijke processen van DNA-herstel in mutaties die leiden tot wijziging van een specifieke eigenschap. Meerdere genoombewerkingstools, waaronder zinkvingernucleasen (ZFN's), transcriptionele activator-achtige effector-nucleasen (TALEN's) en meer recent ontwikkelde geclusterde, regelmatig interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-geassocieerde endonuclease Cas9 (CRISPR/Cas9) hebben de introductie van agronomisch belangrijke eigenschappen in veel plantensoorten (Zadi et al, 2018). Van deze platforms wordt het CRISPR / Cas9-systeem door de wetenschappelijke gemeenschap beter geaccepteerd vanwege zijn eenvoud, hoge specificiteit voor doelsplitsing, betrokkenheid van geen complexe eiwitchemie en universele toepasbaarheid (Zadi et al, 2018). Bovendien is door CRISPR/Cas-gemedieerde ziekteresistentie al gemeld tegen meerdere fytopathogenen, waaronder bacteriën (Peng et al, 2017), schimmels (Wang et al, 2016) en virussen (Chandrasekaran et al, 2016 Zaidi et al, 2016) in verschillende gewassen, waaronder rijst (Sun et al, 2017 Li SY et al, 2018 Tomlinson et al, 2019 He et al, 2020) hetzij door doelspecifieke modificatie van de gastheergenen of door precieze wijziging van de pathogene genomen. In deze review hebben we de verschillende strategieën samengevat die verband houden met genoombewerking en hun daaropvolgende toepassingen bij de verbetering van gewassen, met de nadruk op het benadrukken van de vorderingen van het CRISPR / Cas9-systeem en zijn rol bij het verlenen van ziekteresistentie in rijst.

Genoombewerking is een nieuwe benadering waarbij SSN's worden gebruikt om precieze wijzigingen aan te brengen in het genomische DNA. Het creëren van een dubbelstrengige breuk (DSB) activeert het DNA-herstelmechanisme van de cel, hetzij via de NHEJ- of HR-methode. NHEJ omvat insertie- en deletiemutaties (InDel), terwijl de HR-methode resulteert in geninsertie of -vervanging die veel nauwkeuriger is. Mega-nucleasen zoals de I-ScèneIk endonuclease-enzym uit gist vormde het vroegst bekende genome editing systeem (Paques en Duchateau, 2007). Deze zijn echter het minst efficiënt in de bewerkingstoolbox vanwege onduidelijke communicatie tussen mega-nuclease-eiwitresiduen en overeenkomstige specifieke doel-DNA-sequentie (Hsu et al, 2014). ZFN's zijn de SSN's die DNA binden via een geconstrueerde reeks zinkvingermotieven (Carroll, 2011). Een specifieke zinkvinger omvat ongeveer 30 aminozuren in een geconserveerde β β α configuratie. Het niet-specifieke splitsingsdomein FokI is dimeer van aard en als zodanig zijn een paar ZFN's ontworpen om de FokI-monomeren dicht bij het specifieke DNA-doel voor het maken van een DSB (Bogdanove en Voytas, 2011) (Fig. 1-A). ZFN's zijn met succes gebruikt als hulpmiddel voor het bewerken van het genoom in een breed scala aan gewassen en modelplanten, waaronder: Arabidopsis, tabak en maïs (Cai et al, 2009 Shukla et al, 2009 Osakabe et al, 2010). Toch is hun gebruik als bewerkingstool zeer beperkt vanwege verschillende beperkingen, waaronder off-target binding van de zinkvingermotieven en veelzijdige interacties tussen aminozuurresiduen en de doelsequentie (Carrol, 2011 Voytas, 2013).

In tegenstelling tot ZFN's worden TALEN's ontworpen door een FokI nuclease domein met een transcriptie activator-achtig effector (TALE) DNA-bindend domein (Fig. 1-A). TALE's zijn secretoire eiwitten van Xanthomonasbacteriën die worden gekenmerkt door de aanwezigheid van een C-terminaal zuur activeringsdomein en nucleaire lokalisatiesignaalsequentie, centraal DNA-bindingsdomein (DBD) en N-terminale translocatiesignaalsequentie (Bogdanove et al, 2010). TALE's zijn primair verantwoordelijk voor de transcriptionele activering van de ziektegevoeligheidsgenen in waardplanten. TALEN's zijn goed ingeburgerd in veel plantensoorten, waaronder rijst, tarwe, tabak en gerst (Wang et al, 2014 Li T et al, 2016 Blanvillain-Baufume et al, 2017). Hoewel TALEN's kwalitatief effectiever zijn dan ZFN's in termen van hoge doelspecificiteit en lage activiteit buiten het doel, worden de TALE DBD's weergegeven door een uitgebreide herhalingsstructuur die fungeert als een beperking voor hun uitgebreide gebruik bij het bewerken van meerdere genomen. Het type II CRISPR/Cas9-systeem is daarentegen de uiterst innovatieve methode voor het bewerken van genoom die ZFN's en TALEN's heeft vervangen vanwege zijn efficiëntie en robuustheid. CRISPR/Cas9 maakt gebruik van een DNA-endonuclease Cas9 samen met een klein RNA-molecuul genaamd single guide RNA (sgRNA) dat de door Cas9 gemedieerde plaatsspecifieke DSB op specifieke doelen reguleert (Fig. 1-A). De hechting van de Cas9-sgRNA-structuur aan het doelwit-DNA en de daaruit voortvloeiende splitsing hangt af van de aanwezigheid van een protospacer aangrenzende motief (PAM) sequentie (5′ -NGG-3′ ) aan het 3′-uiteinde van het doelwit plaats. Daarom maakt de vereiste van alleen verschillende spacer-sequenties CRISPR / Cas9 tot een zeer eenvoudige en zeer effectieve bewerkingstool die de afgelopen jaren enorm is gebruikt voor het verbeteren van modelplanten en belangrijke gewassen (Ma et al, 2015 Xu et al, 2016 Zhang Y et al, 2020).

Hoewel verbetering van eigenschappen zeer vruchtbaar is geweest met behulp van CRISPR/Cas9, heeft de vereiste van een NGG PAM-sequentie het gebruik ervan beperkt tot potentiële doelsites. De laatste tijd hebben verschillende Cas9-varianten en homologe eiwitten, zoals Cas9-VRER, Cas9-VQR, Cas9-EQR, Cpf1-RVR, Cpf1-RR en SaCas9, de haalbaarheid verbeterd van het engineeren van een breed scala aan Cas9's met verbeterde PAM-specificiteiten voor het genoom bewerking in eukaryote cellen (Kleinstiver et al, 2015 Gao et al, 2017). Hu et al (2018) gebruikten een door fagen ondersteund continu evolutieproces om een ​​SpCas9-variant te ontwikkelen, xCas9 genaamd, die een breder scala aan PAM-compatibiliteit heeft, waaronder NG, GAA en GAT, en tegelijkertijd een grotere DNA-specificiteit en een lager genoombreed off-target activiteit in vergelijking met SpCas9. Meer recentelijk hebben nieuwe cytosine- en adenine-base-editors met engineeredStaphylococcus aureus Cas9 (SaCas9-NG), SpCas9-NG-varianten, hebben de targetbare locaties in het rijstgenoom aanzienlijk uitgebreid (Hua et al, 2019). Bovendien hebben SpCas9-NG-varianten de reikwijdte van genoombewerking in aardappel en tomaat aanzienlijk uitgebreid door zich te richten op de niet-canonieke NGA- en NGT PAM's (Veillet et al, 2020). Alles bij elkaar genomen, zou een efficiënt gebruik van deze Cas9-varianten van cruciaal belang zijn om de rijstverbetering te versnellen door verbeterde resistentie tegen meerdere fytopathogenen.

De komst van een ander klasse II CRISPR-geassocieerd endonuclease, CRISPR/Cas12a of Cpf1, heeft de horizon voor genoombewerking met grotere nauwkeurigheid en competentie verbreed (Endo et al, 2016) (Fig. 1-A).Vergeleken met het CRISPR/Cas9-systeem herkent de CRISPR/Cas12a T-rijke (5′ -TTTN-3′ en 5′ -TTN-3′ ) PAM's aan het 5′ -uiteinde van de doelsite, wat resulteert in in hoge splitsingsefficiëntie (Zetsche et al, 2015). In tegenstelling tot CRISPR/Cas9, dat een sgRNA van 100 nt vereist, heeft het CRISPR/Cas12a-complex geen tracrRNA nodig en kan het daarom genbewerking vergemakkelijken met slechts een crRNA van 40-45 nt bestaande uit de herhaling en de spacer. En de RuvC- en nuclease-domeinen van Cas12a splitsen het doelwit en de secundaire streng van het DNA op respectievelijk 23 en 17 bp stroomafwaarts van de PAM-sequentie, wat resulteert in verspringende uiteinden met overhangen van 5 bp (Zetsche et al, 2015). Op zichzelf verhoogt de ontwikkeling van grotere mutaties met behulp van CRISPR/Cas12a de efficiëntie van HR-gemedieerde donorgeninsertie op de specifieke genomische locatie. Bovendien werkt Cas12a tegelijkertijd als een RNase om pre-crRNA om te zetten in crRNA en een nuclease om het dsDNA te splitsen, wat een dubbele enzymatische activiteit aantoont (Zetsche et al, 2015). Daarom heeft CRISPR/Cas12a het potentieel om meerdere crRNA's te genereren die worden aangestuurd door een enkele promotor, waardoor het eenvoudiger is dan het CRISPR/Cas9-systeem. Bovendien is de off-target splitsing door Cas12a relatief lager dan Cas9. Deze functies maken CRISPR/Cas12a geavanceerder dan Cas9, waardoor het in de toekomst een potentieel belangrijke tool voor genoombewerking wordt (Zadi et al, 2017). De Cas12a van Francisella novicida(FnCas12a) en zijn ortholoog van Lachnospiraceae-bacterie (LbCas12a) en Acedomonococcus sp. BV3L6 (AsCas12a) zijn gebruikt om gerichte mutaties in veel gewassen te introduceren (Endo et al, 2016). Opkomende rapporten hebben al de succesvolle aanpassing van het CRISPR / Cas12a-systeem bij rijstverbetering aangetoond (Yin et al, 2017 Li S Y et al, 2018). Yin et al (2017) gebruikten de CRISPR-LbCpf1 om zich te richten op het vroege ontwikkelingsgen EPFL9 (Epidermale patroonfactor zoals-9), een positieve regulator van stomatale ontwikkeling in rijst. De homozygote mutante planten vertonen een 8-voudige vermindering van de stomatale dichtheid op het abaxiale bladoppervlak. Evenzo rapporteerden Li S Y et al (2018) dat de donorreparatiesjabloon met alleen de linker homologe arm goed genoeg is voor nauwkeurige gerichte allelische vervanging in het wildtype OsALS (Acetolactaatsynthase) gen resulterend in herbicide-resistente rijstplanten. Meest recentelijk werd een vergelijkende beoordeling uitgevoerd van drie Cas9 (Cas9 D10A nickase, HiFi Cas9 nuclease en WT Cas9 nuclease) en twee Cas12a nucleasen (LbCas12a en AsCas12a) om hun mutatie-efficiëntie te bepalen op een enkele doelwitplaats van de rijst fytoeen desaturase(PDS) gen (Banakar et al, 2020). De studie toonde aan dat LbCas12a resulteert in verwijdering tussen 2 en 20 bp zonder verlies van PAM-site, wat leidt tot een hogere bewerkingsefficiëntie ten opzichte van de Cas9-varianten, wat suggereert dat Cas12a potentieel heeft om specifieke en erfelijke gerichte mutaties in rijst te genereren en dus kan worden gebruikt als een nauwkeurig hulpmiddel voor het bewerken van het genoom voor toekomstige rijstverbeteringsprogramma's, inclusief bij de ontwikkeling van ziekteresistente rijstvariëteiten.

Hoewel de op HR gebaseerde genvervanging een haalbare benadering is met CRISPR/Cas9 en CRISPR/Cas12a, is de efficiëntie van de levering van sjabloon-DNA en het inbrengen van het doelwit aanzienlijk laag. Om dit probleem op te lossen, is de base-editortechnologie naar voren gekomen als een nieuwe en geavanceerde benadering voor precieze nucleotidesubstituties op een programmeerbare manier zonder de vereiste van een DSB of donorsjabloon (Fig. 1-B) (Komor et al, 2016). De basiseditors bestaan ​​uit een katalytisch inactief CRISPR/Cas9-domein (dCas9- of Cas9-nickase) en een cytosine- of adenosinedeaminasedomein dat de ene base in de andere omzet. Deze zijn in staat om variaties of substituties van één base te maken zonder een DSB in het doel-DNA te creëren, waardoor de frequentie van InDels wordt beperkt. Onlangs is het basisbewerkingssysteem efficiënt gebruikt bij het creëren van gerichte puntmutaties op meerdere endogene loci in rijst en tarwe (Li C et al, 2018). Meest recentelijk, rBE5 (hAID* ∆ -XTEN-Cas9n-UGI-NLS) basiseditor is gebruikt om te targeten Pi-d2, een voor de landbouw belangrijk rijstgen dat een puntmutatie herbergt die de afweerreactie op rijstschimmel moduleert (Ren et al, 2018). Cytosine- en adenine-base-editors zijn ook efficiënt gebruikt voor nauwkeurige basemodificatie (C naar T of A naar G) in eukaryote genomen (Zong et al, 2017 Hua et al, 2018 Qin et al, 2019). Toolboxen voor basisbewerking zijn efficiënt geoptimaliseerd en gedemonstreerd in verschillende gewassen, waaronder rijst, tarwe, maïs en tomaat (Lu en Zhu, 2017 Zong et al, 2017 Li C et al, 2018 Tang et al, 2019). In de loop van de tijd is een breed scala aan varianten van adeninebase-editors (ABE's) en cytidine-base-editors (CBE's) ontwikkeld voor efficiënte doelspecifieke basemodificatie (Mishra et al, 2020). Verder is nauwkeurige base-editing in RNA gerealiseerd met behulp van een katalytisch inactieve Cas13 (dCas13) in combinatie met adenosinedeaminase die inwerkt op RNA (ADAR) om de conversie van adenosine naar inosine te sturen (Cox et al, 2017). Cas13 is een type IV CRISPR-gekoppelde RNA-geleide RNase, terwijl ADAR's nauwkeurige bewerking van de transcripten bemiddelen (Nishikura, 2010). Samen zijn ze gebruikt om een ​​RNA-bewerkingssysteem te ontwikkelen dat RNA Editing for Programmable A to I Replacement (REPAIR) wordt genoemd en dat aanzienlijke toepasbaarheid heeft voor onderzoek in therapieën en biotechnologie (Staforst en Schneider, 2012). Het moet echter nog worden gebruikt in het plantensysteem.

Traditionele genoombewerking, waaronder het CRISPR/Cas9-systeem, omvat de levering van DNA-cassettes die coderen voor bewerkingsmachines in het gastheergenoom. Vaak resulteert de willekeurige integratie van de bewerkingscassette in ongewenste genetische veranderingen en off-target effecten (Zhang et al, 2018). Verder roept de introductie van een bewerkingscassette in het gastheergenoom ethische en regelgevende zorgen op (Jones, 2015). Daarom raken wetenschappers steeds meer afgestemd op het gebruik van DNA-vrije genoombewerkingstechnologieën om de kans op off-target mutaties te minimaliseren. DNA-vrije genoombewerking maakt gebruik van de CRISPR/Cas ribonucleoproteïne (RNP) -complexen die in de cel worden afgeleverd door protoplasttransformatie of deeltjesbombardement, wat leidt tot doel-DNA-modificatie. CRISPR-RNP is een assemblage van CRISPR-specifieke gids-RNA en Cas9-eiwit die samen een actief enzymcomplex vormen (Zhang et al, 2018). De eerste DNA-vrije genoom-edited planten werden verkregen door de CRISPR/Cas RNP's te transfecteren in de protoplast van Arabidopsis, tabak, sla en rijst (Woo et al, 2015). Evenzo is met deeltjesbombardement gemedieerde DNA-vrije bewerking met behulp van de CRISPR-Cas9 RNP's met succes aangetoond in maïs (Svitashev et al, 2016), tarwe (Liang et al, 2017) en rijst (Toda et al, 2019). In rijst zijn Cas9-gRNA RNP's direct afgeleverd in de jukbeenweefsels met een mutatie-efficiëntie van 14% tot 64% (Toda et al, 2019). In maïs zijn CRISPR / Cas9 RNP's gebruikt om zowel knock-out- als knockin-mutanten te genereren (Svitashev et al, 2016).

Bovendien hebben de CRISPR/Cas-RNP's een relatief hoge bewerkingsefficiëntie en lage off-target mutaties in vergelijking met het CRISPR/Cas-systeem (Liang et al, 2017 Toda et al, 2019). In een ander onderzoek is de basisbewerking gecombineerd met het DNA-vrije bewerkingssysteem om een ​​hogere frequentie van C naar T-conversie (1,8%) in tarwe mogelijk te maken (Zong et al, 2018). Over het algemeen heeft dit transgenvrije nauwkeurige bewerkingssysteem een ​​enorm potentieel voor de verbetering van rijst en andere belangrijke gewassoorten. Hoewel het gebruik van CRISPR/Cas RNP's nog in de kinderschoenen staat, kan het effectief worden onderzocht om de veredeling van rijstgewassen te versnellen en kunnen de bewerkte producten een bredere acceptatie krijgen in het publiek door de hindernissen op het gebied van bioveiligheid te overwinnen.

Tijdens de tweede helft van de 19e en het begin van de 20e eeuw heeft resistentieveredeling een cruciale rol gespeeld bij de verbetering van de opbrengst en andere agronomische eigenschappen van rijst, waardoor de uitdagingen van het voeden van de groeiende wereldbevolking worden aangepakt. Traditionele methoden van resistentieveredeling zijn echter duur en tijdrovend, en soms beïnvloedt het resistentie-allel de groei en ontwikkeling van planten (Miah et al, 2013). Uitgebreide genetische en genomische studies hebben belangrijke moleculaire details onthuld over de aangeboren immuniteit van rijst, waaronder een groot aantal doelen voor controle en remming van pathogene infecties. Terwijl planten resistentie hebben ontwikkeld (R) genen die van pathogenen afgeleide virulentie-eiwitten of effectoren kunnen neutraliseren en door effector geactiveerde immuniteit kunnen activeren, ze zijn ook vatbaar (S) genen die in wezen betrokken zijn bij een succesvolle pathogene infectie. In de context van genome editing is de primaire strategie voor ziekteresistentie het uitschakelen hiervan Sgenen door de foutgevoelige NHEJ-pathway-gebaseerde reparatie van doel-DNA (Fig. 2-A). Alternatief, aankloppen R gen-allel naar de doelplaats van belang via het HR-mechanisme heeft het potentieel voor resistentieontwikkeling in algemeen aanvaarde gevoelige genotypen (Fig. 2-B en -C). Trouwens, allelen van bepaalde R en Sgenen variëren op het niveau van één nucleotide. Dus nauwkeurige bewerking door middel van gerichte vervanging of basisbewerking kan allelische varianten voor ziekteresistentie genereren (Fig. 2-B en -D). Aan de andere kant kunnen bewerkingsplatforms worden gebruikt om ziekteresistentie te induceren door de cis-regulerende regio's van doelgenen en loci van kwantitatieve kenmerken. Er zijn meer dan honderd regulerende mutaties gerealiseerd in de tomaat SlCLV3 promotor met behulp van een CRISPR / Cas9-systeem (Rodriguez-Leal et al, 2017). Dergelijke wijzigingen kunnen leiden tot een systematische beoordeling van: cis-regulerende regio's met resistente eigenschappen, die de rijstteelt kunnen verbeteren (Fig. 2-D). Gelijktijdig bewerken van meerdere Sgenen of regulerende elementen via een multiplex bewerkingsplatform (Fig. 2-E) kan in wezen resulteren in ziekteresistentie met een breed spectrum. Meerdere sgRNA's aangedreven door onafhankelijke promotors kunnen worden gemultiplext in enkele Cas9- of Cpf1 / sgRNA-expressievector met behulp van de Golden Gate-klonering of de Gibson-assemblagemethode (Silva en Patron, 2017). Wang et al (2017) toonden de haalbaarheid aan van multiplex-genediting met behulp van het CRISPR / Cpf1-systeem. De komst van meerdere bewerkingsplatforms heeft een of meer van deze strategieën mogelijk gemaakt voor de ontwikkeling van resistentie tegen biotische stress in gewassen, met name in rijst (Mishra et al, 2018 Yin en Qiu, 2019). De toepassing van CRISPR/Cas-tools is voornamelijk onderzocht in rijst tegen virale infectie, gevolgd door inspanningen om de resistentie tegen schimmels en bacteriën te verbeteren (tabel 1). Recente studies die de kracht van de genome editing-technologie aantonen bij het vaststellen van resistentie tegen deze pathogene categorieën worden hieronder besproken.

Tafel 1. Lijst met genen die het doelwit zijn van genoombewerkingstools voor resistentie tegen rijstziekte.
Pathogeen perspectiefdoelgenBewerkingstoolFunctieVerwijzing
Weerstand tegen bacteriële infectieOsSWEET13TALEN'sVerbeterde weerstand tegen BLB Li et al, 2012
OsSWEET13TALEN'sVerbeterde weerstand tegen BLB Zhou et al, 2015
OsSWEET13TALEN'sVerbeterde weerstand tegen BLB Blanvillain-Baufume et al, 2017
Os09g29100TALEN'sVerbeterde weerstand tegen BLB Cai et al, 2017
Os8N3(OsSWEET11)CRISPR/Cas9Verbeterde weerstand tegen BLB Kim et al, 2019
OsSWEET11en OsSWEET14CRISPR/Cas9Breed spectrum weerstand tegen BLB Xu et al, 2019
OsSWEET11, OsSWEET13enOsSWEET14CRISPR/Cas9Breed spectrum weerstand tegen BLB Olivia et al, 2019
Weerstand tegen schimmelinfectieOsERF922CRISPR/Cas9Verbeterde weerstand tegen blastziekte Wang et al, 2016
OsSEC3ACRISPR/Cas9Verbeterde weerstand tegen blastziekte Ma et al, 2018
OsPFT1CRISPR/Cas9Weerstand tegen rijstschedeziekte Shah et al, 2019
Weerstand tegen virale infectieeIF4GCRISPR/Cas9Verbeterde weerstand tegen tungro-ziekte Macovei et al, 2018

TALENs, transcriptie activator-achtige effector nucleasen CRISPR/Cas9, Cluster regelmatig afgewisseld korte palindroom herhaling/Cas9 BLB, Bacteriële bladziekte.

Bacteriële bladziekte (BLB), veroorzaakt door γ-proteobacterium Xanthomonas oryzaepv. oryzae (Xoo), is een van de meest destructieve vaatziekten van rijst, vooral in de belangrijkste rijstteeltgebieden van Zuidoost-Azië en Afrika bezuiden de Sahara. Het is afzonderlijk verantwoordelijk voor meer dan 75% van het opbrengstverlies, waarbij jaarlijks miljoenen hectaren rijst worden aangetast (Varshney et al, 2019). Identificatie van genetisch resistente rijstplanten en hun gebruik in genomisch geassisteerde veredeling zijn de meest effectieve methode voor het ontwikkelen van Xoo resistente rassen. Echter, de opkomst van nieuwe en nieuwe Xoo typen is de grootste uitdaging geweest bij het beheersen van de ziekte. De Xoo pathogeniteit in rijst wordt voornamelijk vastgesteld door de injectie van DNA-bindende eiwitten, TALE's genaamd, die binden aan de effectorbindende elementen (EBE's) in de promotors van de S genen in rijst (Cohn et al, 2014). TALE's richten zich meestal op de suikertransporterende SWEET-genfamilie in rijst, die primair verantwoordelijk is voor het vrijgeven van de suiker in de apoplast als voeding van de Xoo pathogenen (Cohn et al, 2014). Meerdere TALE's waaronder AvrXa7, TalC, Tal5 en PthXo3 gevonden in verschillende Xoo stammen zijn allemaal gericht op de Os11N3 (ook gekend als OsSWEET14) gen in rijst en werden daarom beschouwd als de belangrijkste gevoeligheidsfactoren die verband houden met bacteriële infectie (Antony et al, 2010 Li et al, 2012 Hutin et al, 2015). Door TALEN gemedieerde montage resulteert in de ontwikkeling van gewenste mutaties binnen de Os11N3promotorgebied met een EBE voor AvrXa7, dat overlapt met een andere EBE voor PthXo3. De bewerkte rijstplanten met de gewenste homozygote mutatie voor de deletie van 4 of 9 bp op de doelplaats zijn zeer resistent tegen bacteriële bacterievuur (Li et al, 2012). Zhou et al (2015) rapporteerden ook de identificatie van een ander sucrosetransportergen OsSWEET13 als de ziektegevoeligheidsfactor voor PthXo2 TALE (transcriptie activator-achtige effector) afhankelijk Xoo stam, en identificeerde ook dat de PthXo2-afhankelijke stam induceert OsSWEET13 uitdrukking specifiek in indica rijst IR24 vanwege de aanwezigheid van een mysterieuze effectorbindingsplaats, die niet aanwezig is in de allelen van japonica rijst Nipponbare en Kitaake. In een ander onderzoek werd een natuurlijk voorkomende deletie van 18 bp O. barthi en O. glaberrima Er wordt voorspeld dat wilde rijstsoorten de binding van TALE's waarvan bekend is dat ze zich richten, voorkomen OsSWEET14en resistentie verlenen tegen BLB (Hutin et al, 2015). Het allel, genaamd alsxa41(t), is bestand tegen de helft van de geteste Xoo stammen. Meer recent gebruikten Blanvillain-Baufume et al (2017) de TALEN-constructen om een ​​allelbibliotheek van de OsSWEET14 promotorgebied in rijst om het gevoeligheidsniveau te beoordelen van bewerkte rijstlijnen die mutaties dragen in de EBE's van AvrXa7, Tal5 en TalC. En de rijstlijnen met verstoring van de AvrXa7 en Tal5 EBE's resulteren in weerstand tegen Xoostammen die afhankelijk zijn van de overeenkomstige TALE's.

CRISPR/Cas9-gemedieerde verstoring van de TALE EBE's van twee susceptibiliteitsgenen, OsSWEET11 en OsSWEET14, in rijstvariëteit Kitaake werd geprobeerd om breedspectrum BLB-resistentie in rijst te vergemakkelijken (Xu et al, 2019). Een van de rijstmutanten MS14K toont breedspectrumresistentie tegen de meerderheid van de Xoo stammen. Verder worden twee PthXo2-achtige TALE's geïdentificeerd als belangrijke virulentiefactoren in de compatibele Xoostammen. Omdat de PthXo2 TALE's zich voornamelijk richten op het gevoeligheidsgen OsSWEET13/Xa25, een analyse van EBE-varianten in de OsSWEET13 promotor over 3 000 rijstvariëteiten onthulde de aanwezigheid van minstens 10 Xa25-achtige haplotypes. De CRISPR/Cas9-strategie werd verder gebruikt om InDels te introduceren in de EBE van de OsSWEET13 promotor van de MS14K lijn, en een nieuwe rijstlijn met drie bewerkte OsSWEET EBE's resulteerde in breedspectrumresistentie tegen alle geteste Xoo stammen (Xu et al, 2019). Dit suggereert dat genoomengineering van TALE-susceptibility factor co-evolved loci cruciaal is voor het voorkomen van door effector veroorzaakte gevoeligheid, waardoor breedspectrum BLB-resistentie wordt gerealiseerd.

Onlangs hebben Kim et al (2019) het CRISPR / Cas9-systeem gebruikt om rijst uit te schakelen Os8N3 (ook gekend als OsSWEET11) die een gevoeligheidsfactor is voor de Xoo stammen die de TAL-effector PthXo1 dragen. Gewenste aanpassingen in Os8N3worden stabiel overgebracht naar T0, T1, T2 en T3 generaties zonder het overgedragen DNA (T-DNA) door genetische segregatie. Niet alleen vertoonden de homozygote mutanten een significant verhoogde resistentie tegen: Xoo stam, het bewerken van Os8N3 had ook geen invloed op de agronomische eigenschappen en de levensvatbaarheid van pollen in de mutantlijnen. Olivia et al (2019) hebben 856 TALE's gesequenced over meerdere Xoo isolaten uit Azië en Afrika die zich specifiek richten op promotors van meerdere OsSWEET-genen (ZOET11, ZOET13 en ZOET14) en vond de complexiteit die betrokken is bij de ontwikkeling van TALE ongevoelige rijstlijnen. Om deze moeilijkheid te overwinnen, wordt een CRISPR/Cas9-gemedieerd genoombewerkingssysteem gebruikt om mutaties te introduceren bij de promotors van alle drie de SWEET-genen bij EBE's die door verschillendeXoo VERHALEN. Sequentieanalyses onthullen meerdere TALE-varianten voor ZOET13 en ZOET14 allelen. Introductie van maar liefst vijf SWEET-promotormutaties in de rijsttoevoegingen Kitaake, IR64 en Ciherang-Sub1 resulteerde in krachtige en breedspectrum BLB-resistentie. Meest recent hebben Zhang Q W et al (2020) een significante verbetering van de rijstrespons op BLB-pathogeen mogelijk gemaakt door het gebruik van een T5-exonuclease (T5exo)-Cas-fusiegereedschapskist. Vergeleken met CRISPR/Cas9 resulteert T5exo-Cas9 of -Cas12a in grotere deletiemutaties op de beoogde plaats van UPTPthXo1(opgereguleerd door transcriptie-activator-achtige effector PthXo1) box van de OsXa13 genpromotor in bewerkte rijstplanten. Fenotypische analyse onthulde dat de rijstplanten die zijn bewerkt door T5exo-Cas9 of -Cas12a een significante vermindering van de lengte van de laesie en een verbetering van de resistentie tegen BLB hebben in vergelijking met die bewerkt door CRISPR/Cas9 of CRISPR/Cas12a, wat mogelijk verband houdt met de factor die T5exo -Cas9 induceert grotere deleties aan de cis-regelgevend element (Zhang Q W et al, 2020).Al deze onderzoeken geven duidelijk aan dat de genoombewerking van rijst, met name met het CRISPR/Cas-systeem, aanzienlijk heeft bijgedragen aan het verlenen van breedspectrum BLB-resistentie, en deze strategieën kunnen effectief worden gebruikt in niet-transgene genomische geassisteerde gewasverbeteringsprogramma's.

Meer dan 30% van de plantenziekten wordt veroorzaakt door fytopathogenen van schimmels (Giraud et al, 2010 Sharma et al, 2012). Rijstontploffing veroorzaakt door de hemibiotrofe draadschimmel Magnaporthe oryzaeis de meest wijdverbreide en verwoestende ziekte van rijst. Het is een terugkerend probleem voor zowel hoogland- als laaglandrijst, die zeer kwetsbaar is voor deze schimmelfytopathogeen vanaf de zaailing tot het volwassen stadium. Het veelvuldig voorkomen van nieuwe rassen van explosiepathogenen heeft geresulteerd in meer dan 30% van de verliezen in de wereldwijde rijstproductie, wat genoeg is om 60 miljoen mensen te voeden (Nalley et al, 2016). Het gebruik van ontploffingsresistente cultivars is de meest effectieve maatregel voor de beheersing van ontploffingspathogenen. Vanaf nu meer dan 100 grote ontploffing R genen zijn geïdentificeerd en 30 daarvan zijn moleculair gekloond (Xiao et al, 2019). Grote ontploffing Rgenen inclusief Pi-ta/Pi-ta2, Pi-zo, Pi-b en Pi-ko/H/m/szijn ingezet in combinatie met genoom-geassisteerde fok- en transgene programma's voor de ontwikkeling van resistente genotypen in de rijstproducerende regio's (Li Y et al, 2016). Bijvoorbeeld de onlangs geïdentificeerde rijst Pigm locus bestaat uit een cluster van genen die coderen voor nucleotide-binding site-leucine-rich repeat (NBS-LRR) receptoren die resistentie verlenen tegen blast schimmel M. oryzae zonder afbreuk te doen aan de opbrengsteigenschap. De locus wordt gekenmerkt door een paar epigenetisch gereguleerde antagonistische paar NBS-LRR-receptoren, PigmR en PigmS. Terwijl PigmR vergemakkelijkt breed spectrum weerstand, PigmS voorkomt PigmR homodimerisatie om resistentie te onderdrukken en op zijn beurt de zaadproductie te verhogen (Deng et al, 2017). Evenzo kan een enkele basiswijziging in de regelgevende regio van bsr-d1 induceert ontploffingsweerstand in rijst (Li et al, 2017). De huidige uitdaging ligt echter in de ontwikkeling van een verzameling blastresistentiegenen die kunnen worden gebruikt tegen de onophoudelijk evoluerende en gevarieerde stammen van M. oryzae. Daarom zijn nauwkeurige hulpmiddelen voor het bewerken van het genoom de behoefte van het uur voor de implementatie van effectieve plantresistentie in rijst.

Verhoogde resistentie tegen blastziekte is aangetoond in rijst door zich te richten op het gen voor de transcriptiefactor voor ethyleenrespons OsERF922 via CRISPR / Cas9-gerichte knock-out (Wang et al, 2016). Door CRISPR/Cas9 geïnduceerde InDel-mutaties worden gerapporteerd in het beoogde gen met een mutatiefrequentie tot 42% in de T0 generatie. De allele mutaties worden stabiel doorgegeven aan volgende generaties. Blastresistentiescreening in zes homozygote gemuteerde T2lijnen onthult significant lagere laesies in vergelijking met wildtype planten in zowel de zaailing- als de uitloperfase. Verder wordt er geen significant verschil waargenomen in de agronomische prestaties van de mutanten, wat suggereert dat nauwkeurige bewerking andere belangrijke eigenschappen van de planten niet verandert. Bovendien is het gebruik van meerdere CRISPR/Cas9-constructen (Cas9/multi-target-sgRNA) voor het targeten van verschillende sites binnen OsERF922 locus resulteert in een hoger aantal mutanten. Deze suggereren dat CRISPR/Cas9-gemedieerde targeting van meerdere locaties de potentie heeft om de mutatie-efficiëntie te verhogen, waardoor de ontploffingsweerstand in rijst wordt verbeterd. CRISPR/Cas9 SSN is gebruikt om te verstoren OsSEC3A, een gen dat codeert voor exocyst-subeenheid-eiwit om zijn functionele rol in plantenimmuniteit te onderzoeken (Ma et al, 2018). OsSEC3A is eerder betrokken geweest bij wortelhaarverlenging, pollenkieming en afweerreactie bij andere plantensoorten (Bloch et al, 2016). Twee sgRNA's zijn ontworpen om zich te richten op de derde en tiende exons van de OsSEC3A gen. Door CRISPR/Cas9 geïnduceerde mutant vertoont verbeterde immuunresponsen gekoppeld aan opwaartse gereguleerde expressie van pathogenese-gerelateerde eiwitten, salicylzuursynthesegenen, verhoogde salicylzuurspiegels en verbeterde weerstand tegen de rijstblastpathogeen M. oryzae. De mutantlijnen vertonen echter ook veranderde groei en agronomische kenmerken, waaronder dwerggestalte, kleinere zaailingen, kortere hoofdwortels en verminderde of verminderde planthoogte, pluimlengte, helmstokgetal, 1000-graingewicht en aartjesvruchtbaarheid in vergelijking met het wildtype. Meerdere benaderingen van ontploffingsweerstand in rijst kunnen worden bewerkstelligd door nauwkeurige bewerking van multifunctionele genen die zijn geassocieerd met afweersignalering in rijst. Onlangs is CRISPR/Cas9 ook toegepast om mutaties te induceren in het proline-rijke motief van Pi21 voor rijstweerstand tegen: M. oryzae (Li et al, 2019). CRISPR/Cas9-vector is ontworpen om gelijktijdige gerichte mutatie van de thermosensitieve mannelijke steriele 5 (TMS5), rijst explosie S gen pi21 en BLB S gen xa13 in de rijstvariëteit Pinzhan (Li et al, 2019). Drie van de gegenereerde mutanten met homozygote frameshift-mutaties bij alle drie de genen (tms5/pi21/xa13) vertonen kenmerken van warmtegevoelige genetische mannelijke steriliteit met verbeterde weerstand tegen infecties van M. grisea en Xoo stam PXO99 (Li et al, 2019), waardoor het proces van hybride rijstveredeling aanzienlijk wordt versneld.

Rijstschedeziekte, veroorzaakt door: Rhizoctonia solaniKuhn [Teleomorf stadium, Thanatephorus cucumeris(Frank) Donk], is de op één na belangrijkste schimmelziekte van rijst na ontploffing met een opbrengstverlies in het bereik van 8% -50% in de tropische rijstproducerende landen van de wereld (Savary et al, 2000). CRISPR/ Cas9-bewerking is onlangs geprobeerd te wijzigen Oryza sativa Fytochroom en bloeitijd 1 (OsPFT1) gen om de functionele rol ervan bij de resistentie tegen rijstschedeziekte te begrijpen (Shah et al, 2019). Arabidopsis PFT1 is kritisch betrokken bij het induceren van ziektegevoeligheid door op te treden als een universele adapter tussen RNA-polymerase II en DNA-gebonden transcriptiefactoren (Bä ckströ m et al, 2007 Het kan niet worden gevonden in REFERNCE, controleer. 2e referentie in de lijst van REFERENTIE Thatcher et al, 2009). CRISPR/Cas9-constructen zijn gemobiliseerd in de indica rijstvariëteit ASD16 via Agrobacterium- gemedieerde transformatie die mutatie in de PFT1 plaats. De mutatie-efficiëntie en ziekteresistentie-affiniteit van de bewerkte rijstlijnen moeten echter nog worden vastgesteld.

Virale ziekten vormen ook een belangrijke wereldwijde belemmering bij het streven om de rijstproductiviteit te verhogen. Van de verschillende virale infecties heeft de rijst-tungro-ziekte ernstige gevolgen voor de rijstproductie in ongeveer 3,5 miljoen hectare in de belangrijkste rijstproducerende Aziatische landen (Canselier et al, 2006). De ziekte wordt in principe veroorzaakt door de interactie van twee verschillende virussen, namelijk tungro sferisch virus (RTSV) met een enkelstrengs RNA-genoom en tungro bacilliform virus (RTBV) met een dubbelstrengs DNA-genoom (Hull, 1996). RTBV ontwikkelt de primaire ziektesymptomen en verspreidt de ziekte door te helpen bij de overdracht van RTBV via de groene bladspringersoorten zoals Nephotettix virescensen N. nigropictus (Hibino en Kabauatan, 1987). Gastheerresistentiefokprogramma's door het screenen van enorme rijstkiemplasmacollecties hebben geresulteerd in de identificatie van meerdere rijstvariëteiten met specifieke resistentie tegen een of beide virussen (Khush et al, 2004). Geconcentreerd moleculair onderzoek in een indica rijstvariëteit Utri Merah toonde aan dat de RTSV-resistentie wordt gecontroleerd door de aanwezigheid van single-nucleotide polymorfisme of deletie die de YVV-aminozuurresiduen in de translatie-initiatiefactor vier gamma beïnvloedt (eIF4G) gen (Lee et al, 2010). Als zodanig is het essentieel om RTSV-resistente variëteiten te ontwikkelen om secundaire verspreiding van deze ziekte te voorkomen. Onlangs is CRISPR/Cas9-genoombewerking met succes gebruikt om te muteren eIF4G gen in de voor RTSV gevoelige rijstvariëteit, IR64, om nieuwe bronnen van resistentie tegen RTSV te ontwikkelen (Macovei et al, 2018). Mutatiefrequentie variërend van 36% tot 86% wordt gerealiseerd en geïnduceerde mutaties worden overgedragen naar de volgende generatie zonder detecteerbare modificaties in de dichtstbijzijnde off-target sites. Sequentie-analyse en pathogeen-infectietest onthulden dat in-frame mutatie in de aminozuurresiduen naast de YVV-residuen verhoogde RTSV-resistentie verleent samen met verbeterde agronomische parameters zoals planthoogte en graanopbrengst. De stabiele mutanten kunnen worden vrijgegeven in gebieden die gevoelig zijn voor rijsttungro-ziekte als alternatieve bron van RTSV-resistentie voor het beheersen van de infectie en het verbeteren van de rijstproductiviteit.

Hoewel benaderingen voor genoombewerking afhankelijk zijn van de gerichte mutatie van S genen voor de introductie van ziekteresistentie in planten, kan dit gepaard gaan met fitnesskosten. Bewusteloos slaan S genen, die coderen voor eiwitten die verantwoordelijk zijn voor pre-penetratiestructuren, afweeronderdrukking en replicatiemachines, kunnen leiden tot fenotypische afwijkingen en voedingstekorten die de groei en ontwikkeling van planten kunnen beïnvloeden (van Schie en Takken, 2014). Terwijl OsSWEET-rijstmutanten resistentie induceren door beperkte suikerbeschikbaarheid voor BLB-pathogeen, kan dit ook leiden tot verminderde plantengroei en stuifmeelabortie (Chu et al, 2006). Dit kan mogelijk worden verzacht door gerichte bewerking van verschillende promotorregio's van de S genen is aangetoond voor SWEET-genen in rijst (Blanvillain-Baufume et al, 2017). Als alternatief, in plaats van een volledig uitschakelen Sgen kan ziekteresistentie ook worden ontwikkeld door synthetische varianten van S gen identiek aan het allel dat van nature voorkomt in resistente genotypen (Bastet et al, 2017). Een dergelijk nieuw allel kan plantenresistentie induceren en tegelijkertijd normale eiwitfuncties vertonen zonder ontwikkelingskosten. Bovendien kunnen de recent ontwikkelde basisbewerkingstools ook worden gebruikt voor het nauwkeurig invoeren van enkele basisovergangen in sommige S genen, die alleen variëren op het niveau van het polymorfisme van één nucleotide. Bovendien kan de beschikbaarheid van meerdere pathogene induceerbare promotors en regulerende elementen in planten worden gericht met behulp van een door pathogenen geïnduceerd CRISPR-systeem voor tijdelijke uitschakeling van de S gen zonder compromis in hun fitnessrollen. Een dergelijk CRISPR-vectorsysteem dat gebruik kan maken van de door pathogenen induceerbare promotor, zou kunnen worden geconceptualiseerd om hun effectiviteit tegen ziekteresistentie in veldgewassen aan te tonen. Integendeel, de introductie van een aangepaste ontwerpsequentie in het genoom zal meer geschikt zijn wanneer specifieke allelische varianten betrokken zijn bij resistentierespons. Een CRISPR-systeem in combinatie met het HR-mechanisme kan de mogelijkheid om aan te kloppen voor onbepaalde tijd vergroten R gen-allel in de doelplaats van keuze voor het ontwikkelen van ziekteresistentie. Hoewel HR technisch gezien nog steeds een uitdaging is in planten vanwege de lage efficiëntie en het ontbreken van multiplexprotocollen, moeten CRISPR-toolboxen worden ontworpen en geanalyseerd om hun toepassingen in resistentieveredeling voor rijstverbetering uit te breiden.

Dit onderzoek werd ondersteund door het China Priority Program-Breeding of Seven Major Crops (Grant No. 2017YFD01100100), het Innovation Program van de Chinese Academy of Agricultural Sciences (Grant No. 01-ICS) en het Talented Young Scientist Program van China (Grant No. India-17-01). We danken Dr. Muktikanta Mishra, President, Centurion University of Technology and Management voor zijn aanmoediging en steun.


Aslanidis C, de Jong PJ (1990) Ligatie-onafhankelijke klonering van PCR-producten (LIC-PCR). Nucleïnezuren Res 18(20):6069-6074

Aslanidis C, de Jong PJ, Schmitz G (1994) Minimale lengtevereiste van de enkelstrengs staarten voor ligatie-onafhankelijke klonering (LIC) van PCR-producten. PCR-methoden Appl 4(3):172-177

Berger I, Fitzgerald DJ, Richmond TJ (2004) Baculovirus-expressiesysteem voor heterologe multi-eiwitcomplexen. Nat Biotechnol 22(12):1583-1587. doi:10.1038/nbt1036

Bieniossek C, Nie Y, Frey D, Olieric N, Schaffitzel C, Collinson I, Romier C, Berger P, Richmond TJ, Steinmetz MO, Berger I (2009) Geautomatiseerde onbeperkte multigene recombinatie voor multiproteïne complexe productie. Nat Methoden 6 (6): 447-450. doi:10.1038/nmeth.1326

Busso D, Peleg Y, Heidebrecht T, Romier C, Jacobovitch Y, Dantes A, Salim L, Troesch E, Schuetz A, Heinemann U, Folkers GE, Geerlof A, Wilmanns M, Polewacz A, Quedenau C, Bussow K, Adamson R , Blagova E, Walton J, Cartwright JL, Bird LE, Owens RJ, Berrow NS, Wilson KS, Sussman JL, Perrakis A, Celie PH (2011) Expressie van eiwitcomplexen met behulp van meerdere Escherichia coli eiwit-co-expressiesystemen: een benchmarkonderzoek. J Struct Biol 175(2):159-170. doi:10.1016/j.jsb.2011.03.004

Carrera J, Rodrigo G, Jaramillo A (2009) Op weg naar de geautomatiseerde engineering van een synthetisch genoom. Mol Biosyst 5(7):733-743. doi:10.1039/b904400k

Cohen SN, Chang AC, Boyer HW, Helling RB (1973) Constructie van biologisch functionele bacteriële plasmiden in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 70(11):3240–3244

Cowieson NP, Kobe B, Martin JL (2008) Verenigd staan ​​we: structurele methoden combineren. Curr Opin Struct Biol 18 (5): 617-622. doi:10.1016/j.sbi.2008.07.004

Dennis K, Srienc F, Bailey JE (1985) Ampicilline-effecten op vijf recombinante Escherichia coli stammen: implicaties voor het ontwerp van selectiedruk. Biotechnol Bioeng 27(10):1490-1494. doi:10.1002/bit.260271014

Dymond JS, Richardson SM, Coombes CE, Babatz T, Muller H, Annalure N, Blake WJ, Schwerzmann JW, Dai J, Lindstrom DL, Boeke AC, Gottschling DE, Chandrasegaran S, Bader JS, Boeke JD (2011) Synthetische chromosoomarmen functioneren in gist en genereren fenotypische diversiteit door ontwerp. Natuur 477(7365):471-476. doi:10.1038/natuur10403

Fitzgerald DJ, Berger P, Schaffitzel C, Yamada K, Richmond TJ, Berger I (2006) Eiwitcomplexexpressie met behulp van multigene baculovirale vectoren. Nat-methoden 3 (12): 1021-1032. doi:10.1038/nmeth983

Gibson DG, Benders GA, Andrews-Pfannkoch C, Denisova EA, Baden-Tillson H, Zaveri J, Stockwell TB, Brownley A, Thomas DW, Algire MA, Merryman C, Young L, Noskov VN, Glass JI, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO (2008a) Volledige chemische synthese, assemblage en klonering van a Mycoplasma genitalium genoom. Wetenschap 319(5867):1215-1220. doi: 10.1126/wetenschap.1151721

Gibson DG, Benders GA, Axelrod KC, Zaveri J, Algire MA, Moodie M, Montague MG, Venter JC, Smith HO, Hutchison CA (2008b) Eenstaps assemblage in gist van 25 overlappende DNA-fragmenten om een ​​volledig synthetisch Mycoplasma genitalium genoom. Proc Natl Acad Sci U S A 105(51):20404-20409. doi:10.1073/pnas.0811011106

Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA 3rd, Smith HO (2009) Enzymatische assemblage van DNA-moleculen tot enkele honderden kilobasen. Nat Methoden 6 (5): 343-345. doi:10.1038/nmeth.1318

Gibson DG, Glass JI, Lartigue C, Noskov VN, Chuang RY, Algire MA, Benders GA, Montague MG, Ma L, Moodie MM, Merryman C, Vashee S, Krishnakumar R, Assad-Garcia N, Andrews-Pfannkoch C, Denisova EA, Young L, Qi ZQ, Segall-Shapiro TH, Calvey CH, Parmar PP, Hutchison CA, Smith HO, Venter JC (2010) Creatie van een bacteriële cel gecontroleerd door een chemisch gesynthetiseerd genoom. Wetenschap 329(5987):52-56. doi: 10.1126/wetenschap.1190719

Gunyuzlu PL, Hollis GF, Toyn JH (2001) Plasmideconstructie door door linker ondersteunde homologe recombinatie in gist. Biotechnieken 31(6):1246, 1248, 1250

Kaznessis YN (2007) Modellen voor synthetische biologie. BMC Syst Biol 1:47. doi:10.1186/1752-0509-1-47

Kim KJ, Kim HE, Lee KH, Han W, Yi MJ, Jeong J, Oh BH (2004) Twee-promotorvector is zeer efficiënt voor overproductie van eiwitcomplexen. Eiwit Sci 13 (6): 1698-1703. doi: 10.1110/ps.04644504

Krivoruchko A, Siewers V, Nielsen J (2011) Mogelijkheden voor gistmetabolische engineering: lessen uit synthetische biologie. Biotechnol J 6(3):262-276. doi:10.1002/biot.2010000308

Lee JW, Kim TY, Jang YS, Choi S, Lee SY (2011) Systems metabolic engineering voor chemicaliën en materialen. Trends Biotechnol 29(8):370-378. doi:10.1016/j.tibtech.2011.04.001

Li MZ, Elledge SJ (2007) Gebruik maken van homologe recombinatie in vitro om recombinant DNA te genereren via SLIC. Nat Methoden 4 (3): 251-256. doi:10.1038/nmeth1010

Ma H, Kunes S, Schatz PJ, Botstein D (1987) Plasmideconstructie door homologe recombinatie in gist. Gen 58(2–3):201–216

McArthur GHT, Fong SS (2010) Op weg naar engineering van synthetisch microbieel metabolisme. J Biomed Biotechnol 2010:459760. doi: 10.1155/2010/459760

Miyazaki K (2011) MEGAWHOP-klonering: een methode voor het creëren van willekeurige mutagenesebibliotheken via megaprimer-PCR van hele plasmiden. Methoden Enzymol 498:399–406. doi:10.1016/B978-0-12-385120-8.00017-6

Miyazaki K, Takenouchi M (2002) Het creëren van willekeurige mutagenesebibliotheken met behulp van megaprimer-PCR van het hele plasmide. Biotechnieken 33(5):1033-1034, 1036-1038

Na D, Kim TY, Lee SY (2010) Constructie en optimalisatie van synthetische routes in metabole engineering. Curr Opin Microbiol 13(3):363-370. doi:10.1016/j.mib.2010.02.004

Nandagopal N, Elowitz MB (2011) Synthetische biologie: geïntegreerde gencircuits. Wetenschap 333(6047):1244-1248. doi: 10.1126/wetenschap.1207084

Perrakis A, Musacchio A, Cusack S, Petosa C (2011) Onderzoek naar een macromoleculair complex: de toolkit met methoden. J Struct Biol 175(2):106–112. doi:10.1016/j.jsb.2011.05.014

Portnoy VA, Bezdan D, Zengler K (2011) Adaptieve laboratoriumevolutie - gebruikmaken van de kracht van biologie voor metabolische engineering. Curr Opin Biotechnol 22 (4): 590-594. doi:10.1016/j.copbio.2011.03.007

Purnick PE, Weiss R (2009) De tweede golf van synthetische biologie: van modules tot systemen. Nat Rev Mol Cell Biol 10(6):410-422. doi:10.1038/nrm2698

Ramon A, Smith HO (2011) Eenstaps-linker-gebaseerde combinatorische assemblage van promotor- en gencassettes voor pathway-engineering. Biotechnol Lett 33(3):549-555. doi:10.1007/s10529-010-0455-x

Raymond CK, Pownder TA, Sexson SL (1999) Algemene methode voor plasmideconstructie met behulp van homologe recombinatie. Biotechnieken 26(1):134-138, 140-131.

Scheich C, Kummel D, Soumalakakis D, Heinemann U, Bussow K (2007) Vectoren voor co-expressie van een onbeperkt aantal eiwitten. Nucleïnezuren Res 35(6):e43. doi:10.1093/nar/gkm067

Storici F, Durham CL, Gordenin DA, Resnick MA (2003) Chromosomale plaatsspecifieke dubbelstrengs breuken zijn efficiënt gericht op reparatie door oligonucleotiden in gist. Proc Natl Acad Sci U S A 100(25):14994-14999. doi:10.1073/pnas.2036296100

Tillett D, Neilan BA (1999) Enzymvrij klonen: een snelle methode om PCR-producten te klonen, onafhankelijk van vectorrestrictie-enzymplaatsen. Nucleïnezuren Res 27(19):e26

Vick JE, Johnson ET, Choudhary S, Bloch SE, Lopez-Gallego F, Srivastava P, Tikh IB, Wawrzyn GT, Schmidt-Dannert C (2011) Geoptimaliseerde compatibele set BioBrick-vectoren voor metabole route-engineering. Appl Microbiol Biotechnol 92(6): 1275-1286. doi:10.1007/s00253-011-3633-4

Wakamori M, Umehara T, Yokoyama S (2010) Een reeks bacteriële co-expressievectoren met zeldzame herkenningssequenties. Eiwit Expr Purif 74(1):88-98. doi:10.1016/j.pep.2010.06.016

Wang TW, Zhu H, Ma XY, Zhang T, Ma YS, Wei DZ (2006) Mutantbibliotheekconstructie in gerichte moleculaire evolutie: een breder net werpen. Mol Biotechnol 34(1):55-68. doi:10.1385/MB:34:1:55

Wang HH, Isaacs FJ, Carr PA, Sun ZZ, Xu G, Forest CR, Church GM (2009) Programmeren van cellen door multiplex genoom-engineering en versnelde evolutie. Natuur 460(7257):894-898. doi:10.1038/natuur08187

Wingler LM, Cornish VW (2011) Reiteratieve recombinatie voor de in vivo assemblage van bibliotheken van multigene routes. Proc Natl Acad Sci U S A 108(37):15135-15140. doi:10.1073/pnas.1100507108

Wladyka B, Puzia K, Dubin A (2005) Efficiënte co-expressie van een recombinante staphopaïne A en zijn remmer staphostatine A in Escherichia coli. Biochem J 385 (Pt 1): 181-187. doi:10.1042/BJ20040958

Yang W, Zhang L, Lu Z, Tao W, Zhai Z (2001) Een nieuwe methode voor co-expressie van eiwitten in Escherichia coli met behulp van twee incompatibele plasmiden. Eiwit Expr Purif 22(3):472-478. doi:10.1006/prep.2001.1453

Yokoyama S (2003) Eiwitexpressiesystemen voor structurele genomica en proteomics. Curr Opin Chem Biol 7(1):39-43. doi:S1367593102000194


Technieken gebruikt in de experimentele &

Experimentele toepassingen zijn onder meer:

  1. Geneesmiddelontdekking/doelidentificatie
  2. Identificatie van biomarkers
  3. Microbiologie
  4. Virologie
  5. Bio-informatica/systematiek
  6. Biotechnologie
  7. Recombinant klonen
  8. genomica
  9. Genetica
  10. forensisch onderzoek

Klinische toepassingen zijn onder meer:

  1. Medische diagnose
  2. Beslissingen over gepersonaliseerde geneeskunde/patiënt
  3. Farmacogenomie
  • wanneer een ander nucleotide wordt toegevoegd, zal DNA-polymerase de binding tussen de eerste en tweede fosfaten van het deoxynucleosidetrifosfaat verbreken
  • het binnenkomende nucleotide wordt vervolgens verbonden met de vrije 3'-hydroxyl van de groeiende DNA-keten

Geautomatiseerde fluorescerende DNA-sequencing

  • gebruikt 4 verschillende fluorescerende kleurstoffen, één voor elk van de 4 basen;
  • Alle 4 de reacties worden uitgevoerd in een enkele baan van de gel, aangezien de 4 basen gemakkelijk te onderscheiden zijn door hun kleuren
  • aka Sequencing door Oligonucleotide Array
  • dit toont een oligonucleotide-array die ooit een combinatie van 4 basenparen mogelijk heeft
  • het onbekende DNA-fragment is fluorescent gelabeld en mag hybridiseren met alle mogelijke oligonucleotiden op de chip
    • de eerste plek die hybridiseerde met het onbekende DNA heeft de sequentie, ATCG
    • de tweede plek die hybridiseerde heeft de sequentie, CTGG
    • de derde plek die hybridiseerde heeft de sequentie, TGGC

    een computer zal deze in de juiste overlappende volgorde assembleren

    de volgorde wordt vervolgens bepaald op basis van deze informatie 5. Pyrosequencing

    • Tijdens elke sequentiereactie wordt het DNA met één nucleotide verlengd en komt pyrofosfaat vrij
    • Het pyrofosfaat wordt samen met adenosinefosfosulfaat (APS) door ATP-sulfarylase gebruikt om ATP te genereren. Luciferase gebruikt ATP + Luciferine en straalt licht uit (fluorescentie)
    • Apyrase verwijdert ongebruikte trifosfaten
    1. Sequentie van de volgende generatie
    • Heeft hogere snelheden bij het uitlezen van resultaten en lagere kosten
    • Een groot aantal monsters kan naast elkaar in hetzelfde apparaat worden geplaatst
    • Puur genomisch DNA kan als sjabloon worden gebruikt
    • Wat zijn de belangrijkste methoden?
    1. 454 Sequencing: gebruikt pyrosequencing om te bepalen welk nucleotide wordt toegevoegd door DNA-polymerase

    dit vertelt de onderzoeker dat het onbekende DNA volledig is gekruist en nu volledig is gesequenced.

    1. Illumina/Solexa-sequencing: maakt gebruik van omkeerbare kleurstofterminators om het nucleotide te identificeren dat wordt toegevoegd door DNA-polymerase
    1. Nanoporie DNA-detectie
      • Het nanoporiemembraan scheidt twee compartimenten van verschillende lading

    Negatief geladen moleculen (d.w.z. DNA) kunnen in een uitgebreide formatie door de porie gaan

    een detector meet hoeveel stroom, als gevolg van de normale ionenstroom, wordt verminderd - aangezien elke base de stroom met verschillende hoeveelheden verandert, kan de detector de volgorde bepalen terwijl het DNA door de porie gaat


    Bekijk de video: What are exonucleases and their applications? (Februari 2023).