Informatie

10.2: Plasmidennomenclatuur - Biologie

10.2: Plasmidennomenclatuur - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Een goede nomenclatuur is belangrijk voor het onderscheiden van plasmiden. In onze experimenten:

pYES2.1-MET1 zou de aanwijzen S. cerevisiae MET1 gen gekloneerd in pYES2.1.

pYES2.1-Met1 zou de aanwijzen S. pombe Met1 gen gekloneerd in pYES2.1. (Herinner je uit hoofdstuk 6 dat S. cerevisiae genen zijn ongebruikelijk in het gebruik van 3 hoofdletters voor hun naam.)

pYES2.1 -lacZ+ zou het bacteriële LacZ-gen aanduiden dat is gekloneerd in pYES2.1. (Opmerking: namen van bacteriële genen worden niet met een hoofdletter geschreven. Het plusteken geeft het wildtype-gen aan.)

Opmerking

De ortholoog van S. pombe van een S. cerevisiae-gen deelt mogelijk niet hetzelfde gennummer. Veel van de S. pombé genen kregen hun naam vanwege hun homologie met eerder geïdentificeerde S. cerevisiae genen, maar sommige S. pombé genen waren genoemd voordat hun DNA-sequenties bekend waren. Bijvoorbeeld, de ortholoog van S. cerevisiae MET2 in S. pombé is Met6.

​​​​​


10.2: Plasmidennomenclatuur - Biologie

Alle door MDPI gepubliceerde artikelen worden direct wereldwijd beschikbaar gesteld onder een open access licentie. Er is geen speciale toestemming nodig om het door MDPI gepubliceerde artikel geheel of gedeeltelijk te hergebruiken, inclusief figuren en tabellen. Voor artikelen die zijn gepubliceerd onder een open access Creative Common CC BY-licentie, mag elk deel van het artikel zonder toestemming worden hergebruikt, op voorwaarde dat het originele artikel duidelijk wordt geciteerd.

Feature Papers vertegenwoordigen het meest geavanceerde onderzoek met een aanzienlijk potentieel voor grote impact in het veld. Feature Papers worden ingediend op individuele uitnodiging of aanbeveling door de wetenschappelijke redacteuren en ondergaan peer review voorafgaand aan publicatie.

De Feature Paper kan een origineel onderzoeksartikel zijn, een substantiële nieuwe onderzoeksstudie waarbij vaak verschillende technieken of benaderingen betrokken zijn, of een uitgebreid overzichtsdocument met beknopte en nauwkeurige updates over de laatste vooruitgang in het veld dat systematisch de meest opwindende vorderingen in de wetenschappelijke literatuur. Dit type paper geeft een blik op toekomstige onderzoeksrichtingen of mogelijke toepassingen.

Editor's Choice-artikelen zijn gebaseerd op aanbevelingen van de wetenschappelijke redacteuren van MDPI-tijdschriften van over de hele wereld. Redacteuren selecteren een klein aantal artikelen die recentelijk in het tijdschrift zijn gepubliceerd en waarvan zij denken dat ze bijzonder interessant zijn voor auteurs, of belangrijk zijn op dit gebied. Het doel is om een ​​momentopname te geven van enkele van de meest opwindende werken die in de verschillende onderzoeksgebieden van het tijdschrift zijn gepubliceerd.


Nieuwe nomenclatuur en classificatieschema voor de neuronale ceroid lipofuscinoses

We bieden een nieuwe classificatie voor de neuronale ceroid lipofuscinoses (NCL's) die rekening houdt met recente genetische en biochemische ontwikkelingen. Dit werd oorspronkelijk ontwikkeld door een internationale groep met klinische, moleculair genetische, biologische en morfologische belangen, verder herzien door een panel van wereldexperts in de NCL's, en wordt nu bijgewerkt in het licht van recente onderzoeksresultaten. Het doel is om jonge mensen, verzorgers en professionals een diagnostisch label te geven dat informatief is, leidt tot effectief klinisch beheer van symptomen en in de toekomst misschien tot genezing, en om fundamenteel wetenschappelijk en klinisch onderzoek te ondersteunen. We stellen voor dat clinici ernaar streven om elk kind en gezin waar mogelijk gedetailleerde diagnostische informatie te verstrekken op klinisch, biochemisch en genetisch niveau, wat de nieuwe classificatie op een gengestuurde hiërarchische manier mogelijk maakt. De robuustheid en toepasbaarheid van deze bijgewerkte nieuwe classificatie zijn onafhankelijk gecontroleerd in de klinische setting met behulp van een reeks patiënten die eerder gediagnosticeerd waren met NCL volgens standaard ultrastructurele, biochemische of genetische criteria.


Virale integratie

Als onderdeel van zijn lysogene cyclus integreert wild-type AAV in het gastheergenoom op een specifieke plaats, AAVS1 op humaan chromosoom 19. Deze plaats heeft de voorkeur vanwege de aanwezigheid van een Rep-bindend element, maar willekeurige integraties kunnen plaatsvinden bij een veel lagere frequentie. Als replicatie-incompetent virus kan AAV niet zonder hulp de lytische cyclus binnengaan. Een ander virus, zoals adenovirus of herpes simplex-virus, of een genotoxisch middel zoals UV-straling of hydroxyureum, is nodig voor activering van de lytische cyclus.

Wanneer recombinant AAV (rAAV) wordt gebruikt voor onderzoeksdoeleinden, wordt het Rep-eiwit geleverd in trans , waardoor het vermogen van rAAV om te integreren in zijn voorkeursplaats van genomische integratie op humaan chromosoom 19, AAVS1 genaamd, wordt geëlimineerd. In plaats daarvan wordt het rAAV-genoom typisch verwerkt tot een dubbelstrengs circulair episoom door middel van dubbelstrengs synthese. Deze episomen kunnen concatemeriseren en structuren met een hoog molecuulgewicht produceren die extrachromosomaal worden gehandhaafd. rAAV is waarschijnlijker dan wildtype AAV om te integreren op niet-homologe plaatsen in het genoom, en dit met een frequentie van ongeveer 0,1%. Niettemin wordt aangenomen dat de meerderheid van de rAAV-deeltjes in episomen of concatemeren worden gehandhaafd.

Episomen verschillen sterk van virale deeltjes die tijdens een lytische cyclus worden geproduceerd. rAAV-episomen kunnen een chromatine-achtige organisatie ontwikkelen en gedurende een periode van jaren in niet-delende cellen blijven bestaan ​​zonder de gastheercel te beschadigen. Daarentegen worden virale deeltjes geproduceerd tijdens een lytische cyclus snel vrijgegeven door cellysis. Episomale stabiliteit maakt langdurige transgenexpressie in niet-delende cellen mogelijk en is een belangrijk voordeel van rAAV.


Toepassing van methylering bij het verbeteren van de transformatie van plasmiden naar Helicobacter pylori

Helicobacter pylori is een belangrijke gastro-intestinale ziekteverwekker. De stammen hebben verschillende niveaus van krachtige restrictiemodificatiesystemen, die een belangrijke belemmering vormen voor genetische hulpmiddelen die worden gebruikt voor het bestuderen van de rol van functionele genen in de pathogenese ervan. Methylerende vectoren in vitro werden gerapporteerd als een alternatief om deze barrière bij verschillende bacteriën te overwinnen. In deze studie gebruikten we twee H. pylori-E. coli shuttle-plasmiden en verschillende single/double-crossover homologe recombinatie gen-targeting plasmiden, om de rol van methylering in H. pylori-transformatie te testen. Volgens onze resultaten konden transformanten alleen worden verkregen nadat shuttle-plasmiden vóór transformatie waren gemethyleerd. Het is nuttig bij gencomplementatie en overexpressie, hoewel in een lage frequentie. De frequentie van gen-targeting transformatie was ook verhoogd na methylering, vooral voor de single-crossover recombinatie plasmiden, waarvan de transformanten alleen konden worden verkregen na methylering. Voor de op dubbele crossover recombinatie gerichte plasmiden was de initiële opbrengst aan transformanten 0,3-0,8 x 102 CFU's per microgram plasmide-DNA. Met behulp van methylering werd de opbrengst verhoogd tot 0,4-1,3 x 102 CFU's per microgram plasmide-DNA. Deze resultaten suggereren dat in vitro methylatie de H. pylori-transformatie door verschillende plasmiden kan verbeteren, wat het onderzoek naar pathogene mechanismen ten goede zal komen.

trefwoorden: Helicobacter pylori Methylatie Plasmide Transformatie.


Methoden:

Moleculaire biologie

PCR-fragmenten werden gegenereerd met Phusion DNA Polymerase (Finnzymes) of Taq Plus Precision (Stratagene). Primers en sjablonen worden weergegeven in aanvullende tabel S1 en in aanvullende methoden. Deze fragmenten, inclusief de regulerende elementen, werden gekloneerd in de pGEM-T-vector (Promega). Fragmenten werden uit deze vectoren gesneden met SapI (LguI), geïsoleerd uit TAE-agarosegels, gezuiverd met de Qiaquick-gelextractiekit (Qiagen) en vervolgens bewaard bij -20 ° C. Donor- en acceptorvectoren werden gecreëerd in een enkele ligatiestap van acht fragmenten (aanvullende figuur S1). De consensussequentie en de nomenclatuur van deze plasmiden worden gegeven in aanvullende figuur S2. De beschikbare donor- en acceptorvectoren worden getoond in aanvullende figuur S3. Plasmiden die een pUC-replicatieoorsprong bevatten, werden vermeerderd in TopTen- of DH10β-cellen, en plasmiden met een R6Kγ-replicatieoorsprong in pir+ cellen 6 . De genen van belang werden gekloneerd in donor- en acceptorvectoren met T4-DNA-ligase of SLIC12. Merk op dat bestaande expressievectoren van het pcDNA (Invitrogen) of pEGFP (Clontech) type kunnen worden geamplificeerd met standaard primers en in de gewenste ruggengraat kunnen worden ingevoegd (aanvullende figuur S4). de Cre/LoxP recombinatiereactie werd 60 minuten bij 37 ° C uitgevoerd (New England BioLabs). We raden aan om plasmiden te gebruiken die zijn gezuiverd met een anionenuitwisselingsmethode. Drie plasmiden kunnen routinematig in één stap worden geassembleerd. Het vierde of vijfde plasmide kan achtereenvolgens worden ingevoegd en er moeten zeer competente cellen worden gebruikt. Merk op dat er twee mogelijkheden zijn voor het samenstellen van drie plasmiden, zes mogelijkheden voor het samenstellen van vier plasmiden en 24 mogelijkheden voor het samenstellen van vijf plasmiden. Het ongezuiverde Cre-reactiemengsel werd gebruikt om DH10β- of TopTen-cellen te transformeren door middel van elektroporatie. De transformatie-efficiëntie van fusies die vier of vijf plasmiden bevatten, werd geoptimaliseerd door de getransformeerde cellen een nacht bij 30 ° C te kweken in een vloeibare cultuur die geschikte antibiotica bevat vóór het uitplaten en/of door zeer competente commerciële cellen te gebruiken. Plasmiden moeten worden geanalyseerd door digestie met restrictie-enzymen. Antibiotica werden gebruikt in de volgende concentraties voor samenstellingen van 1-3 plasmiden: ampicilline, 50 g l 1 kanamycine, 25 g l −1 spectinomycine, 50 g l 1 chlooramfenicol, 4 g l −1 en gentamycine, 4 g l 1 . Antibioticaconcentraties werden verlaagd tot 50% wanneer vier of vijf plasmiden werden geassembleerd. Herschikking of denaturatie van plasmiden tijdens de groei werd geëlimineerd door de bacteriën in Luria-Bertani (LB) -medium bij 30 ° C te kweken in plaats van door 2 x YT bij 37 ° C te gebruiken.

Cel cultuur

HEK293- en COS-cellen werden op 37 ° C gehouden met 5% CO2 in DMEM (Amimed) met 10% foetaal kalfsserum (Amimed), 100 eenheden ml −1 penicilline en 100 μg ml −1 streptomycine (Invitrogen). HAM-F12 (Amimed) werd gebruikt in plaats van DMEM voor endotheelcellen van de aorta van varkens. Cellen werden getransfecteerd met Fugene HD (Roche) of met calciumfosfaat. MultiLabel-plasmiden werden verdund met dragerplasmiden (1:3 of 1:5) wanneer het expressieniveau te hoog was. Stabiele cellijnen werden gegenereerd met het Flp-In-systeem volgens de aanbevelingen van de fabrikant (Invitrogen) of door willekeurige integratie van gelineariseerde plasmiden. Selectie werd uitgevoerd met de volgende antibiotica en concentraties: G418, 16 g ml 1 (Calbiochem) hygromycine, 50 g ml 1 (Roche) zeocine, 100 g l −1 (Invitrogen). Homing-endonucleasen werden verkregen van New England Biolabs.

Microscopie

Cellen werden uitgeplaat op glazen dekglaasjes, 40 uur gekweekt en vervolgens gefixeerd met 4% formaldehyde (direct in het kweekmedium of in PBS). Monsters werden driemaal gewassen met PBS en vervolgens gemonteerd met Citifluor AF1. Beeldvorming werd uitgevoerd op een Leica SP5 laser scanning confocale microscoop of op een Olympus IX81 uitgerust met een Andor iXon EM-camera (aanvullende film 1). Emissievensters van de fluorescerende eiwitten werden gedefinieerd met een construct dat vijf niet-overlappende subcellulaire markers met fluorescentie-tag tot expressie bracht. EBFP2 werd geëxciteerd met de 405 nm laserlijn en emissie werd verzameld van 430 tot 450 nm (405/430-450). De andere fluorescerende eiwitten werden als volgt geanalyseerd: mTFP1 (458/485-510) mCitrine (514/525-545) mCherry (543/585-620) mPLUM (633/640-800). Bovendien werd de spectrale modus (xyλ) van de microscoop gebruikt om de aanwezigheid van alle fluorescerende eiwitten te verifiëren (gegevens niet getoond). Kwantificering werd uitgevoerd met LAS AF-software (Leica Microsystems). Cijfers zijn bewerkt met Photoshop of Imaris software (Bitplane). Gaussiaans filter, helderheid en contrast inclusief gamma-aanpassing werden gebruikt om de zichtbaarheid van blaasjes te vergroten. Alle bewerkingen werden uitgevoerd op de hele set afbeeldingen.

Western blotting

HEK293-cellen werden 1 dag voor transfectie uitgeplaat in schalen van 6 cm met een dichtheid van 50%. Cellen werden getransfecteerd met FugeneHD volgens de aanbevelingen van de fabrikant (Roche) en 40 uur later gelyseerd met lysisbuffer (0, 5% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl). Het supernatant werd gebruikt voor western blotting na sonificatie en centrifugatie. De gebruikte antilichamen waren konijnen-anti-EGFR (Neomarkers, RB-1417, 1:1.000 verdund in 3% BSA/TBST) en muizen-anti-myc-tag (9E10, 1:5 verdund in 3% BSA/TBST). Als secundaire antilichamen, alkalische fosfatase-gekoppelde geiten-antimuis (Southern Biotech, 1031-04, 1: 10.000 verdund in 3% melkpoeder/TBST) en anti-konijn (Southern Biotech, 4050-04, 1: 10.000 verdund in 3 % melkpoeder/TBST) antilichamen werden gebruikt, gevolgd door chemiluminescènedetectie.


3 Hoofdclassificatie van vectoren (met diagram)

Het punt is waar we ons op richten vanuit ons gen van belang - zijn meerdere kopieën of zijn eiwitproduct.

Afhankelijk van deze criteria zijn vec­tors van de volgende twee typen:

1. Klonen van vectoren:

We gebruiken een kloon-vec­tor wanneer het ons doel is om gewoon een aantal exemplaren (klonen) van ons gen van belang te verkrijgen (vandaar de naam kloonvectoren). Deze worden meestal gebruikt bij de constructie van genbibliotheken. Een aantal organismen kan worden gebruikt als bronnen voor het klonen van vectoren.

Sommige zijn synthetisch gemaakt, zoals in het geval van kunstmatige chromosomen van gist en kunstmatige chromosomen van bacteriën, terwijl andere zijn ontleend aan bacteriën en bacteriofagen. In alle gevallen moet de vector genetisch gemodificeerd worden om het vreemde DNA op te vangen door een invoegplaats te creëren waar het nieuwe DNA zal passen. Voorbeeld: PUC-kloneringsvectoren, pBR322-kloneringsvectoren, enz.

2. Expressievectoren of expressieconstructie:

We gebruiken een expressievector wanneer het ons doel is om het eiwitproduct van ons gen van belang te verkrijgen. Om de pro­teïne te krijgen, moeten we de expressie van ons gen van interesse mogelijk maken (vandaar de naam expres­sion-vector) door gebruik te maken van de processen van transcriptie en translatie.

Afgezien van de drie DNA-sequenties die hierboven zijn besproken (oorsprong van replicatie, selecteerbare markers en meerdere kloneringsplaatsen), hebben de expressievectoren ook enkele speciale aanvullende sequenties.

A. Een bacteriële promotor, zoals de lac-promotor. De promotor gaat vooraf aan een restrictieplaats waar vreemd DNA moet worden ingevoegd, waardoor transcriptie van vreemde sequentie kan worden gereguleerd door stoffen toe te voegen die de pro­moter induceren.

B. Een DNA-sequentie die, wanneer deze wordt omgezet in RNA, een prokaryotische ribosoombindingsplaats produceert.

C. Prokaryote transcriptie-initiatie- en -terminatiesequenties.

NS. Sequenties die de transcriptie-initiatie regelen, zoals regulatorgenen en operators.

In sommige typen expressievectoren die specifiek worden gebruikt in associatie met de bacteriële gastheer (zoals E. coli), ligt de meervoudige kloneringsplaats niet direct naast de ribo­some-bindingssequentie, maar wordt in plaats daarvan voorafgegaan door een speciale sequentie die codeert voor een bacterieel polypeptide.

Bij gebruik van een dergelijk type expressie- en shysion-vectoren wordt het gen van belang net na het gen voor bacterieel polypeptide ingevoegd. Op deze manier versmelten we twee leeskaders, waardoor een hybride gen ontstaat dat begint met het bacteriële gen en zich zonder onderbreking voortzet in de codons van ons gen van belang.

Het product van genexpressie is daarom een ​​hybride eiwit, bestaande uit een kort bacterieel polypeptide dat is gefuseerd in een aminoterminus van ons doelpolypeptide-sequentie. Deze hybride polypeptideketen die uit twee verschillende soorten polypeptiden bestaat, wordt een fusie-eiwit genoemd.

De volgende zijn de redenen voor het opnemen van een fusie-eiwit voor ons gen van belang:

(a) De aanwezigheid van bacterieel peptide aan het begin van het fusie-eiwit kan het molecuul stabiliseren en voorkomen dat het door de gastheercel wordt gedegradeerd. Daarentegen worden de for­eign-polypeptiden die een bacterieel segment missen vaak vernietigd.

(b) Het bacteriële polypeptide kan werken als een sig­nal-peptide, dat verantwoordelijk is voor het transporteren van ons doeleiwit naar een specifieke locatie van waaruit deze worden verzameld. Als bijvoorbeeld de bacteriële peptiden zijn afgeleid van een eiwit dat door de cel wordt geëxporteerd (bijv. producten van ompA-genen), dan zal ons doelpolypeptide eenvoudigweg buiten de gastheercel worden getransporteerd, rechtstreeks naar de kweekmedia van waaruit deze kunnen worden verzameld. .

(c) Het bacteriële polypeptide kan ook helpen bij de zuivering van het doelwitpolypeptide door verschillende zuiveringstechnieken zoals affiniteitschromatografie.

Vectorclassificatie # 2.

Op basis van gebruikte gastheercel:

Na constructie van een recombinant DNA kunnen deze in een gastheercel worden ingebracht. Dus afhankelijk van de gastheercel worden de vectoren ontworpen en geconstrueerd. Alle delen van de vectoren moeten functioneel compatibel zijn met de gastheer. Als we bijvoorbeeld een vector maken voor een bacteriële gastheer, moet deze een geschikte replicatieoorsprong hebben die functioneel zal zijn in een bac­teriale cel.

Afhankelijk van deze basis worden de vectoren geclassificeerd als onder:

1. Vectoren voor bacteriën:

Dit zijn specifieke bacteriële oorsprong van replicatie en selecteerbare markers voor an­tibiotische resistentie. Bac­teria ondersteunt verschillende soorten vectoren, b.v. plasmidevectoren, bacteriofagenvectoren, cosmiden, fasmiden, fagemiden, enz.

Ze hebben een speciale oorsprong van replicatie die autono & verlegen replicerende sequenties (ARS) wordt genoemd, bijvoorbeeld replicatieve plasmidevectoren van gist (YRp) enz.

3. Vectoren voor dieren:

Deze vectoren zijn nodig in de biotechnologie voor de synthese van recombinant eiwit uit genen die niet correct tot expressie worden gebracht wanneer ze worden gekloond in E. coli of gist, en klinische mo­leculaire biologen zoeken naar methoden voor klonering bij mensen die technieken voor gentherapie proberen te bedenken. waarbij een ziekte wordt behandeld door introductie van een gekloond gen in de patiënt, bijv. P-element, SV40 enz.

De productie van genetisch gemodificeerde planten is mogelijk geworden door succesvol gebruik van plantenvec­tors. bijv. Ti-plasmide, Ri-plasmide enz.

Vectorclassificatie # 3.

Op basis van de cellulaire aard van de gastheercel:

Op basis hiervan zijn de vectoren van twee typen:

1. Prokaryotische vectoren:

Dit omvat alle vectoren voor bacteriële cellen.

Dit omvat alle vectoren voor gist-, dierlijke en plantaardige cellen.

Prokaryotische vectoren (bacteriële vectoren):

De E. coli-cel die vaak als prokaryotische gastheer wordt gebruikt, heeft specifieke typen vec­tors nodig die dienovereenkomstig zijn ontworpen om in zijn cytoplasma te functioneren. Op plasmiden gebaseerde en op bacteriofaag gebaseerde vectoren zijn de meest voorkomende prokaryotische vectoren.De prokaryotische vectoren omvatten plasmide-afgeleide vectoren, bacteriofaag-afgeleide vectoren, faagmide-vectoren, plasmide-vectoren en fosmide-vectoren.

Deze zijn als volgt verdeeld:

Dit zijn de meest voorkomende vectoren voor de prokaryotische gastheercellen. Bacteriën zijn in staat om vreemde genen die in plasmiden zijn ingevoegd, te exprimeren (Fig. 4.13). Plasmiden zijn kleine, cirkelvormige, dubbelstrengs DNA-moleculen zonder eiwitomhulsel dat van nature voorkomt in het cytoplasma van veel bacteriestammen.

Enkele voorbeelden van natuurlijk voorkomende plasmiden zijn Ti-plasmiden, F-factoren, R-factoren, Co/E1-plasmide, enz. Plas­miden zijn onafhankelijk van het chromosoom van de bacteriële cel en variëren in grootte van 1000 tot 200.000 basenparen. Met behulp van de enzymen en ribosomen uit de jaren 70 die de bacteriële cel huisvest, kan DNA in plasmiden worden gerepliceerd en tot expressie worden gebracht.

De bacteriële cellen profiteren van de pre­sence van plasmiden, die vaak genen dragen die eiwitten tot expressie brengen die in staat zijn om antibioticaresistentie te verlenen. Deze beschermen ook bacteriën door genen te dragen voor resistentie tegen giftige zware metalen, zoals kwik, lood of cadmium.

Bovendien dragen sommige bacteriën plasmiden met genen die bacteriën in staat stellen om haar- en shybiciden, bepaalde industriële chemicaliën of de componenten van aardolie af te breken. De relatie tussen bacteriën en plasmiden is endosymbiotisch, zowel de bacteriën als de plasmiden hebben baat bij onderlinge rangschikking. Plasmiden hebben ook een karakteristiek exemplaarnummer.

Hoe hoger het aantal kopieën, hoe hoger het aantal individuele plasmiden in een bacteriële gastheercel. Als er meer kopieën van het plasmide bestaan, zal er meer eiwit worden gesynthetiseerd vanwege het grotere aantal genkopieën dat door het plasmide wordt gedragen. Het aantal kopieën speelt een rol bij de fenotypische manifestatie van een gen. Hoe meer agenten er bijvoorbeeld zijn van een antibioticumresistentiegen, hoe hoger de resistentie tegen het antibioticum.

Het is erg belangrijk op te merken dat plasmiden die van nature voorkomen, niet alle noodzakelijke sequenties hebben die een DNA-molecuul nodig heeft om als een winstgevende vector te werken. Hierdoor worden natu­ral-plasmiden geëxtraheerd en gemodificeerd door het invoegen van geschikte DNA-segmenten en wordt een eenvoudig vector-DNA-molecuul gemaakt.

Plasmide-kloneringsvectoren zijn afgeleid van bacteriële plas­miden en zijn de meest gebruikte, veelzijdige en gemakkelijk te manipuleren.

De volgende zijn verschillende soorten plasmidevectoren:

Dit was de eerste veelgebruikte, speciaal gebouwde plasmidevector. pBR322 heeft een relatief kleine omvang van 4.363 bp. Dit is belangrijk omdat de transformatie-efficiëntie omgekeerd evenredig is met de grootte en boven 10 kbp erg laag is.

Er is dus ‘room’ in pBR322 voor een insert van minimaal zes kbp. Ook deze vector heeft een redelijk hoog aantal kopieën (

15 kopieën per cel), die 200-voudig kan worden verhoogd door behandeling met een eiwitsyntheseremmer - chlooramfenicol-amplificatie.

De nomenclatuur van pBR 322:

De nomenclatuur van ‘pBR 322’ kan worden begrepen met de volgende uitleg:

1. ‘p’ geeft aan als een plasmide

2. ‘BR’ identificeert Bo-liver en Rodriguez, de twee onderzoekers die het hebben ontwikkeld

3. �’ onderscheidt die plasmiden van andere (zoals pBR 325, pBR 327, enz.) die in hetzelfde laboratorium zijn ontwikkeld.

De constructie van pBR322:

1. Oorsprong van replicatie:

Het draagt ​​een fragment van plasmide pMB1 dat fungeert als een oorsprong voor DNA-replicatie en zo zorgt voor vermenigvuldiging van de vector.

Het draagt ​​twee anti- en shybiotische resistentiegenen: ampicilline en tetracycline.

Het bevat een aantal unieke restrictieplaatsen. Sommige hiervan bevinden zich in een van de antibioticaresistentiegenen (bijv. plaatsen voor Pst I, Pvu I en Sac I worden gevonden in Ampr en BamHI en Hind III in Tetr). Klonen op een van deze plaatsen deactiveert het gen waardoor recombinanten kunnen worden onderscheiden van niet-recombinanten, ook wel insertie-inactivatie genoemd.

Met stamboom begrijpen we de oorsprong van pBR322. pBR322 is geen natuurlijk voorkomend plasmide. Het wordt vervaardigd door bepaalde stappen te volgen die worden beschreven in (Fig. 4.15). Het is belangrijk op te merken dat pBR322 DNA omvat dat is afgeleid van drie verschillende natuurlijk voorkomende & shyring-plasmiden.

Het amp R-gen dat oorspronkelijk opnieuw op het plasmide R1 (een natuurlijk voorkomend en shyring antibioticumresistent plasmide in E. coli) zit, het tetR-gen is afgeleid van R6-5 (een tweede antibioticumresistent plasmide) en de oorsprong van replica­tion is afgeleid van pMB1, dat is nauw verwant aan het colicine producerende plasmide ColE1.

Recombinante selectie met pBR322 – in-sectionele inactivatie van een antibioticumresistentiegen.

Wanneer we ons recombinante DNA (vector + gen van belang) in de gastheercel hebben geïntroduceerd (door een proces dat transformatie wordt genoemd en de gastheercellen die het recombinante DNA opnemen, worden getransformeerde gastheercellen genoemd), dan moeten we de gehele gastheerpopulatie in om de getransformeerde cellen (met recombi­nant-DNA) te selecteren uit de niet-getransformeerde (zonder recombinant-DNA).

Aan elke vector is een mechanisme verbonden voor deze screening.

Hier zullen we bespreken wat het mechanisme is dat in dit opzicht door de pBR322-vector wordt gevolgd. pBR322 heeft verschillende unieke restrictieplaatsen die kunnen worden gebruikt om de vec­tor te openen voordat een nieuw DNA-fragment wordt ingevoegd. BamHI, bijvoorbeeld, knipt pBR322 op slechts één positie, binnen het cluster van genen die coderen voor resistentie tegen tetracycline.

Een recombinant pBR322-molecuul, een molecuul dat een extra stukje DNA op de BamHl-plaats draagt, kan zijn gastheer niet langer tetracyclineresistentie verlenen, omdat een van de noodzakelijke genen nu wordt verstoord door het ingevoegde DNA. Cellen die dit recombinante pBR322-molecuul bevatten, zijn nog steeds resistent tegen ampicilline, maar gevoelig voor tetra­cycline (amp R tefs).

Screening op pBR322-re­combinanten wordt op de volgende manier uitgevoerd. Na transformatie worden de cellen uitgeplaat op ampicillinemedium en geïncubeerd totdat colo­nies verschijnen [Fig. 4.16(a)].

Al deze kolonies zijn transformanten (onthoud dat niet-getransformeerde cellen versterkers zijn en dus geen kolonies produceren op het selectieve medium), maar slechts een paar bevatten recombinante pBR322-moleculen: de meeste bevatten het normale, zelf-geligeerde plasmide. Om de recombinanten te identificeren worden de kolonies replica uitgeplaat op agarmedium dat tetra­cycline bevat [Fig. 4.16(b)].

Na incubatie groeien sommige van de oorspronkelijke kolonies terug, maar andere niet [Fig. 4.16(c)]. Degenen die wel groeien, bestaan ​​uit cellen die het normale pBR322 dragen zonder ingevoegd DNA en daarom een ​​functioneel tet­cyclineresistentiegencluster (ampRtetR).

De kolonies die niet op tetracycline-agar groeien, zijn recombinanten (amp R tef's). Zodra hun posities bekend zijn, kunnen monsters voor verder onderzoek worden teruggewonnen van de oorspronkelijke ampicilline-agarplaat.

Het wordt veel gebruikt als kloneringsvector. Daarnaast is het op grote schaal gebruikt als een modelsysteem voor de studie van prokaryotische transcriptie en translatie.

Voordelen van pBR322:

4,4 kb) maakt eenvoudige zuivering en manipulatie mogelijk.

2. Twee selecteerbare markers (amp en tet) voor gemakkelijke selectie van recombinant DNA.

3. Het kan worden geamplificeerd tot 1000-3000 kopieën per cel wanneer de eiwitsynthese wordt geblokkeerd door de toepassing van chlooramfenicol.

Nadelen van pBR322:

1. Het heeft een zeer hoge mobiliteit i. e het kan naar een andere cel gaan in aanwezigheid van een conjugatief plasmide zoals F-factor. Het nic-bom (bom=basis van mobiliteit) gebied van pBR322 is verantwoordelijk voor dit kenmerk. Hierdoor kan de vector verloren gaan in een populatie van gemengde gastheercellen.

2. Er is een beperking in de grootte van het gen van belang dat het kan accommoderen.

3. Er is niet een heel hoog aantal exemplaren aanwezig zoals van een goede vector mag worden verwacht.

4. Hoewel insertie-inactivatie van een antibioticumresistentiegen een effectieve manier is voor recombinante identificatie, wordt de methode lastig gemaakt door de noodzaak om twee screenings uit te voeren, één met het antibioticum dat op transformanten selecteert, gevolgd door de tweede screening, na replicaplating, met het an­tibioticum dat recombinanten onderscheidt.

Dit maakt het screeningsproces tijdrovend en arbeidsintensief.

Een andere vector pBR327 werd afgeleid van pBR322, door deletie van nucleotiden tussen 1.427 en 2.516. Deze nucleotiden worden verwijderd om de grootte van de vector te verkleinen en om sequenties te elimineren waarvan bekend was dat ze interfereren met de expressie van gekloond DNA in eukaryote cellen. pBR327 bevat nog steeds genen voor resistentie tegen twee antibiotica (tetracycline en ampicilline).

pBR327 heeft de volgende twee voordelen ten opzichte van pBR322:

1. pBR327 heeft een hoog aantal kopieën (30-45 cop­ies per cel).

pUC worden verkregen door de pBR322-vector te modificeren. pUC-vectoren zijn kleiner dan pBR322 of zijn alleen

2,7 kB. Maar relatief gezien hebben ze een hoog aantal exemplaren. Een mutatie binnen de replicatieoorsprong produceert 500 tot 600 kopieën van het plasmide per cel zonder amplificatie.

De nomenclatuur van pUC-vectoren:

De nomenclatuur van ‘pUC’ kan worden begrepen met de volgende uitleg:

1. ‘p’ geeft het plasmide aan.

2. ‘UC’ staat voor University of California, waar het voor het eerst werd ontwikkeld door J. Mess­ing et al.

We zien hierna ook veel getallen zoals pUC8, pUC18, pUC19 enzovoort. Ze zijn slechts de reeks van pUC en zijn alleen genoemd om van elkaar te scheiden.

De constructie van pUC-vectoren:

1. Oorsprong van replicatie: Het is afgeleid van de oorsprong van replicatie van pBR322. De ColEl-oorsprong van replicatie van pBR322 is gemodificeerd door een toevallige mutatie uit te voeren, zodat elke getransformeerde E. coli-cel 500-600 kopieën van het plasmide heeft.

2. Selecteerbare marker: het heeft een ampicil & shylin-resistent gen. De getransformeerde gastheercellen kunnen groeien op media met ampicilline, terwijl niet-getransformeerde cellen afsterven.

3. lac Z'8217-gen met MCS.

4. Het lac Z'8217 is in deze vector opgenomen en codeert voor het enzym beta-galactosidase dat inwerkt op een chromogeen substraat genaamd X-gal (aanwezig in bacteriële kweekmedia). De expressie van het lac Z'8217-gen wordt beïnvloed door een andere verbinding die aanwezig is in dezelfde media, Isopropylthiogalactoside (IPTG) genaamd.

Wanneer de enzymsubstraatreactie plaatsvindt, wordt de X-gal omgezet van wit naar een blauw com­pound. Nu heeft het lac Z'8217-gen zelf MCS. Als het gen van belang is geïntroduceerd in het lac Z'8217-gen, kan het dus niet coderen voor bèta-galactosidase en in dit geval wordt het substraat (X-gal) dus nooit omgezet in een andere kleur. Deze vorm van screening wordt blauw-wit screen­ing genoemd.

Stamboom van pUC-vectoren:

Tijdens de constructie van pUC is de enige se­lecteerbare marker die uit pBR322 wordt gehouden, het ampicilline-resistente gen. Maar alle MCS worden uit de versterker R verwijderd door toevallige mutaties uit te voeren. De ColE1-replicatieoorsprong wordt ook gewijzigd door hetzelfde proces, zodat het het proces van replica­tion steeds weer soepel kan uitvoeren, waardoor uiteindelijk het aantal kopieën van de vector wordt verhoogd.

Daarnaast wordt ook een lac Z'8217-sequentie die codeert voor bèta-galactosidase ingevoegd. Evenzo creëren we daarna door de pro­cess van toevallige mutatie MCS binnen de lac Z'8217-sequentie (Fig. 4.19).

Screening van getransformeerde gastheercellen en pUC-vectoren schuwen:

Na het transformeren van de gastheercellen voeren we hun screening uit om de getransformeerde cellen te selecteren uit niet-getransformeerde. pUC8 [Afb. 4.20(a)], dat het ampicillineresistentiegen draagt ​​en een gen genaamd lac Z'8217, dat codeert voor een deel van het enzym beta-galactosidase.

Klonen met pUC8 omvat insertie-inactivatie van het lac Z'8217-gen, waarbij recombinanten werden geïdentificeerd vanwege hun onvermogen om bèta-galactosidase te synthetiseren [Fig. 4.20(b)].

Bèta-galactosidase is een van de reeksen enzymen die betrokken zijn bij de afbraak van lactose tot glucose plus galactose. Het wordt normaal gecodeerd door het gen lac Z, dat zich op het E. coli-chromosoom bevindt. Sommige stammen van E. coli hebben een gemodificeerd lac Z-gen, een dat het segment mist dat opnieuw wordt aangeduid als lac Z'8217 en dat codeert voor het a-peptidegedeelte van bèta-galactosidase [Fig. 4.21(a)].

Deze mutanten kunnen het enzym alleen synthetiseren als ze een plasmide herbergen, zoals pUC8, dat het ontbrekende lac Z'8217-segment van het gen draagt.

Een kloneringsexperiment met pUC8 omvat de selectie van transformanten op ampicilline-agar gevolgd door screening op bèta-galactosidase-activiteit om recombinanten te identificeren. Cellen die een normaal pUC-plasmide herbergen zijn ampR en kunnen bèta-galactosidase synthetiseren [Fig. 4.21(a)]-recombinanten zijn ook ampR maar niet verlegen om bèta-galactosidase te maken [Fig. 4.21(b)].

Screening op aan- of afwezigheid van bèta-galactosidase is in feite vrij eenvoudig. In plaats van te testen of lactose wordt gesplitst in glucose en galactose, testen we op een iets andere reactie die ook wordt gekatalyseerd door bèta-galactosy­dase.

Het gaat om een ​​lactose-analoog genaamd X-gal (5-broom-4-chloor-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside), die door bèta-galactosidase wordt afgebroken tot een diepblauw gekleurd product.

Als X-gal (plus een inductor van het enzym zoals Iso-pro-pylthiogalactoside, IPTG) wordt toegevoegd aan de agar, samen met ampicilline, dan zullen niet-recombinante kolonies, waarvan de cellen bèta-galactosidase synthetiseren, blauw gekleurd worden , terwijl recombinanten met een verstoord lac Z'8217-gen en niet in staat p-galactosidase te maken, wit zullen zijn.

Dit systeem, dat Lac-selectie wordt genoemd, is samengevat in [Fig. 4.21(b)]. Merk op dat zowel ampicillineresistentie als de aanwezigheid of afwezigheid van p-galactosidase wordt getest op een enkele agarplaat. De twee screen­ings worden daarom samen uitgevoerd en er is geen noodzaak voor de tijdrovende replica-plating stap die nodig is met plas­mids zoals pBR322.

Gebruik van pUC-vectoren:

pUC-vectoren kunnen zowel als kloneringsvec­tor als expressievector worden gebruikt. Bij gebruik als expressievector worden de sequenties enigszins gewijzigd om aan de noodzakelijke vereisten te voldoen.

Voordelen van pUC-vectoren:

De pUC-vectoren bieden de volgende belangrijke voordelen ten opzichte van pBR322-vectoren:

(a) Hoog aantal kopieën van 500-600 exemplaren per cel.

(b) Eenvoudige en enkele stap selectie.

(c) De unieke restrictieplaatsen die worden gebruikt voor clon­ing zijn geclusterd binnen de MCS. Dit maakt het klonen van een DNA-fragment met twee verschillende plakkerige uiteinden mogelijk.

Nadelen van pUC:

Het kan geen interessant gen bevatten dat groter is dan 15 kb.

Deze lijken op cosmiden, maar zijn gebaseerd op het bacteriële F-plasmide. De kloneringsvec­tor is beperkt, omdat een gastheer (meestal E. coli) maar één fosmidemolecuul kan bevatten. Fosmiden zijn 40 kb willekeurig genomisch DNA. Fosmidebibliotheek wordt bereid uit een genoom van het doelorganisme en gekloneerd in een fosmidevector.

Laag aantal kopieën & shyber biedt een hogere stabiliteit dan vergelijkbare cosmiden met een hoog aantal kopieën. Fosmide-systeem kan nuttig zijn voor het construeren van stabiele bibliotheken van complexe genomen.

Van bacteriofaag afgeleide vectoren:

Bacteriofagen, of fagen zoals ze gewoonlijk worden genoemd, zijn virussen die specifiek bacteriën infecteren. Zoals alle virussen hebben fagen een zeer eenvoudige structuur, ze bestaan ​​slechts uit een DNA-molecuul (of soms ribonucleïnezuur (RNA)) dat een aantal genen draagt, waaronder meerdere voor replicatie van de faag, omgeven door een beschermende laag of capside bestaande uit eiwit moleculen (Fig. 4.22).

Het algemene infectiepatroon, dat voor alle soorten fagen hetzelfde is, is een proces in drie stappen:

1. Het faagdeeltje hecht zich aan de buitenkant van de bacterie en injecteert zijn DNA-chromosoom en verlegen in de cel.

2. Het faag-DNA-molecuul wordt gerepliceerd, gewoonlijk door specifieke faag-enzymen die worden gecodeerd door genen op het faagchromosoom.

3. Andere faaggenen sturen de synthese van pro­teïnecomponenten van capside aan, en nieuwe faagdeeltjes worden geassembleerd en vrijgegeven uit de bacterie.

Bij sommige faagtypes is de hele infectiecyclus zeer snel voltooid, mogelijk in minder dan 20 minuten. Dit type snelle infectie wordt een lytische cyclus genoemd, omdat het vrijkomen van de nieuwe ph­age-deeltjes gepaard gaat met de lysis van de bacteriële cel.

Het karakteristieke kenmerk van een lytische infectiecyclus is dat faag-DNA-replificatie onmiddellijk wordt gevolgd door synthese van capside-eiwitten, en het faag-DNA-molecuul wordt nooit in een stabiele toestand in de gastheercel gehouden. In tegenstelling tot een lytische cyclus wordt lysogene infectie gekenmerkt door retentie van het faag-DNA-molecuul in de gastheerbacterie, mogelijk voor vele duizenden celdelingen.

Fred Blatter en zijn collega's waren de eersten die een bacteriofaag als vector ontwikkelden.

De volgende zijn verschillende soorten plasmidevectoren:

I. Bacteriofaag M13 vectoren:

De M13-familie van vectoren is afgeleid van bac­teriophage M13. Dit is een mannelijke specifieke (infecteert E. coli met f. pili), lysogene filamenteuze faag met een cirkelvormig enkelstrengs DNA-genoom van ongeveer 6.407 bp (6,4 kb) lang. Eenmaal in de gastheercel fungeert het enkelstrengs DNA van de M13-faag als de matrijs voor de synthese van een complementaire streng, wat resulteert in normaal dubbelstrengs DNA [Fig. 4.23(a)].

Dit molecuul wordt niet in het bacterieel genoom ingebracht, maar repliceert in plaats daarvan totdat er meer dan 100 kopieën in de cel aanwezig zijn [Fig. 4.23(b)]. Wanneer de bacterie zich deelt, ontvangt elke dochtercel kopieën van het faaggenoom, dat zich blijft repliceren, waardoor het totale aantal per cel behouden blijft.

Zoals getoond in [Fig 4.23(c)], worden continu nieuwe faagdeeltjes geassembleerd en vrijgegeven, waarbij ongeveer 1000 nieuwe ph­ages worden geproduceerd tijdens elke generatie van een geïnfecteerde cel.

De aantrekkingskracht van M13 als kloonvector:

Verschillende kenmerken van M13 maken deze faag aantrekkelijk als basis voor een kloneringsvector. Het genoom is minder dan 10 kb groot, ruim binnen het bereik dat wenselijk is voor een potentiële vector. Bovendien gedraagt ​​de dubbelstrengige replicatieve vorm (RF) van het M13-genoom zich heel erg als een plasmide en kan als zodanig worden behandeld voor experimentele doeleinden.

Het wordt gemakkelijk bereid uit een kweek van geïnfecteerde E. coli-cellen en kan opnieuw worden geïntroduceerd door transfectie. Het belangrijkste is dat genen die zijn gekloond met een op M13 gebaseerde vec­tor kunnen worden verkregen in de vorm van enkelstrengs DNA. Enkelstrengige versies van gekloonde genen zijn bruikbaar voor verschillende technieken, met name DNA-sequencing en in vitro mutageen­esis.

Het gebruik van een M13-vector is een gemakkelijke en betrouwbare manier om enkelstrengs DNA voor dit soort werk te verkrijgen.

Constructie van M13 vectoren:

De eerste stap in de constructie van M13 clon­ing vector is het introduceren van het lac Z'8217 gen in de intergene sequentie. Dit geeft aanleiding tot M13 mp1 dat blauwe plaques vormt op X-gal-agar (Fig. 4.25(a)). M13 mp1 laat geen enkele eenheidsrestrictieplaats in het lac Z'8217-gen voortschrijden.

Het bevat echter een hexanucleotidesequentie GGATTC nabij het begin van het gen. Een enkele nucleotideverandering (door gebruik te maken van in vitro mutageen­esis) zou deze GAATTC maken, wat een EcoR1-plaats is.

Dit resulteert in de vorming van M13 mp2.M13 mp2 heeft een licht gewijzigd lac Z'8217-gen, maar het bèta-galactosidase-enzym dat wordt geproduceerd door cellen die zijn geïnfecteerd met M13 mp2 is nog steeds perfect functioneel. M13 mp2 is de eenvoudigste M13-vector. DNA-fragmenten met ECoR1-kleverige uiteinden kunnen in de kloneringsplaats worden ingebracht en recombinanten worden onderscheiden als heldere plaques op X-gal-agar.

We gaan voor verdere modificaties van M13 mp2 wat resulteert in de productie van een andere M13-vector genaamd M13 mp7. Bij het genereren van M13 mp7 synthetiseren we allereerst een korte oli­gonucleotide genaamd poly-linker die bestaat uit een reeks restrictieplaatsen en EcoR1 plakkerige uiteinden heeft. Deze poly-linker wordt ingevoegd in de EcoRI-plaats van M13 mp2 om M13mp7 te genereren.

Deze polylinker verschaft ook maar liefst vier mogelijke kloneringsplaatsen (ECoRI, BamHI, SaiI en PstI) aan de nieuwe vector. Het is erg belangrijk op te merken dat de poly-linker zo is ontworpen dat deze het lac Z'8217-gen niet volledig verstoort: een read­ing-frame wordt gehandhaafd door de poly-linker en een functioneel, hoewel veranderd, bèta-galactosidase-enzym is nog geproduceerd.

Screening van getransformeerde gastheercellen en afschrikkende bacteriofaag M13-vectoren:

Het inbrengen van nieuw DNA verhindert bijna altijd de productie van bèta-galactosidase. Recombinante plaques zijn dus helder op X-gal-agar. Als alternatief, als de poly-linker opnieuw wordt geplaatst en de originele M13mp7 wordt hervormd, ontstaan ​​blauwe plaques.

Gebruik van bacteriofaag M13-vectoren:

Lange tijd was de belangrijkste toepassing van M13 clon­ing bij DNA-sequentiebepaling met de Sanger-methode, ook wel de dideoxy- of ketenbeëindigingsmethode genoemd. Dit berust op synthese van DNA in aanwezigheid van ketenbeëindigende remmers, de 2'8242, 3'8242-di-deoxynucleosidetrifosfaten (ddNTP's). De methode is nu een zeer standaard instrument van de moleculaire biologie.

2. Faagweergavevectoren:

Een belangrijk gebruik van filamenteuze fagen is in faag dis­play-systemen. Hier worden coderende sequenties ingevoegd in een van de vachteiwitgenen. Het resultaat is dat de fagen worden gegenereerd met een hybride vorm van dit eiwit, wat een fusie is van de normale eiwitsequentie en het eiwitproduct van de ingevoegde se­quence (aangenomen dat de ingevoegde sequentie hetzelfde leeskader heeft als het manteleiwitgen).

De fagen worden door de cel uitgescheiden, waarbij dit extra materiaal aan de buitenkant 'weergegeven' wordt. Deze weergavevectoren hebben veel toepassingen, bijvoorbeeld bij het screenen van bibliotheken door middel van panning en voor vaccinproductie.

Sommige protocollen voor plaatsgerichte mutagenese maken ook gebruik van enkelstrengs DNA, dat kan worden verkregen met vectoren op basis van filamenteuze fagen. Enkelstrengs DNA is ook van bijzonder nut bij het genereren van sondes voor RNA-analyse en -shysis.

Er kunnen probes worden gemaakt die specifiek zijn voor RNA-transcripten van beide DNA-strengen. De laatste toepassingen vallen buiten het bestek van dit boek, maar meer informatie kan worden verkregen uit gespecialiseerde laboratoriumhandleidingen.

Voordelen van bacteriofaag M13 vector:

1. Voordelen ten opzichte van Lambda Phage Vec & shytor:

M13 is een voorbeeld van een filamenteuze faag en is qua structuur totaal anders dan lambda. Bovendien is het M13-DNA-molecuul veel kleiner dan het lambda-genoom, met een lengte van slechts 6407 nucle­otiden. Het is circulair en ongewoon omdat het volledig uit enkelstrengs DNA bestaat.

Door de kleinere omvang van het M13-DNA-molecuul is er ruimte voor minder genen dan het lambda-genoom. Dit is mogelijk omdat de M13-capside is samengesteld uit meerdere kopieën van slechts drie eiwitten (waarvoor slechts drie genen nodig zijn), terwijl de synthese van de lambda-kop-en-staartstructuur meer dan 15 verschillende eiwitten omvat.

Bovendien volgt M13 een eenvoudiger infectiecyclus dan lambda en heeft het geen genen nodig voor insertie in het gastheergenoom. Injectie van een M13-DNA-molecuul in een E. coli-cel vindt plaats via de pilus, de structuur die twee cellen verbindt tijdens seksuele conjugatie.

Op M13 gebaseerde vectoren zijn dat ze dezelfde poly-linker- en alfa-peptidefragmenten bevatten als de pUC-reeks en dat recombinanten kunnen worden geselecteerd met de blauw → witte kleurtest. Ook de grootte van het genoom is minder dan 10 kb en is dus gemakkelijk te hanteren.

Nadelen van bacteriofaag M13 vec­tors:

De volgende zijn de nadelen van bacte­riophage M13-vectoren:

1. Van belang zijnde genen van meer dan 2 kb kunnen niet worden gekloond.

2. Het heeft een lage opbrengst aan DNA.

3. De faag produceert veel toxines in hoge concentraties.

II. Lamda faagvectoren:

Dit is een veelgebruikte vector voor het klonen van zeer grote stukken genen.

Lambda is een typisch voorbeeld van een kop-staart faag. Het genetische materiaal is DNA dat aanwezig is in de veelvlakkige kopstructuur en de staart dient om de faag aan het bacteriële oppervlak te hechten en om het DNA in de cel te injecteren. Het lambda-DNA-molecuul is 49 kb groot.

Het is een gematigde fase en deze kan lytische en lysogene cycli uitvoeren. De posities en identiteiten van de meeste genen op het lambda-DNA-molecuul zijn bekend (Fig. 4.28).

Lambda-faag kan zowel lineaire als circulaire vormen van DNA hebben. Het in (Fig. 4.28) getoonde molecuul is lineair, met twee vrije uiteinden, en stelt het DNA voor dat aanwezig is in de faagkop. Dit lineaire molecuul bestaat uit twee complementaire DNA-strengen, basenparen in overeenstemming met de Watson-Crick-regels. Aan beide uiteinden van het molecuul bevindt zich echter een kort stuk van 12 nucleotiden waarin het DNA enkelstrengs is [Fig. 4.30(a)].

De twee enkele strengen zijn complementair en kunnen dus basenparen met elkaar vormen om een ​​cirkelvormig, volledig dubbelstrengs molecuul te vormen [Fig. 4.30(b)]. Comple­mentaire enkelvoudige strengen worden vaak 'plakkerige'8217 uiteinden of samenhangende uiteinden genoemd, omdat basenparen ertussen de twee uiteinden van een DNA-molecuul (of de uiteinden van twee verschillende DNA-moleculen) aan elkaar kunnen 'kleven'.

De cohesieve lambda-uiteinden worden de cos-sites genoemd en ze spelen twee verschillende rollen tijdens de lambda-in- en shyfection-cyclus. Ten eerste zorgen ze ervoor dat het lineaire DNA-molecuul dat in de cel wordt geïnjecteerd, wordt gecirculeerd, wat een noodzakelijke voorwaarde is voor insertie in het bacteriële genoom (Fig. 4.29).

De tweede rol van de cos-sites is nogal anders en komt in het spel nadat de pro-ph­age uit het gastheergenoom is weggesneden. In dit stadium wordt een groot aantal nieuwe lambda-DNA-moleculen geproduceerd door het rollende cirkelmechanisme van replicatie [Fig. 4.30(c)], waarbij een continue DNA-streng van het sjabloonmolecuul wordt gerold. Het resultaat is een catenaan die bestaat uit een reeks lineaire A-genomen die op de cos-locaties zijn samengevoegd.

De rol van de cos-sites is nu om te fungeren als herkenningssequenties voor een endonuclease dat het catenaan op de cos-sites splitst, waardoor individuele lambda-genomen worden geproduceerd. Dit endonuclease, dat het product is van gen A op de lambda-DNA-mol­ecule, creëert de enkelstrengs kleverige uiteinden en werkt ook samen met andere eiwitten om elk lambda-genoom in een faagkopstructuur te verpakken.

De splitsings- en verpakkingsprocessen herkennen alleen de cos-plaatsen en de DNA-sequenties aan weerszijden ervan. Het veranderen van de structuur van de interne regio's van het lambda-genoom, bijvoorbeeld door het inbrengen van nieuwe genen, heeft geen effect op deze gebeurtenissen zolang de totale lengte van het A-genoom niet al te veel wordt belemmerd.

Problemen in verband met natuurlijk oc­curring lambda faag voor gebruik als clon­ing vectoren:

Er moeten twee problemen worden opgelost voordat op lambda gebaseerde kloneringsvectoren kunnen worden ontwikkeld:

1. Het lambda-molecuul kan met slechts ongeveer 5% worden vergroot, wat overeenkomt met de toevoeging van slechts 3 kb nieuw DNA. Als de totale grootte van het molecuul meer dan 52 kb is, kan het niet in de lambdakopstructuur worden verpakt en worden er geen infectieuze faagpar­ticles gevormd. Dit beperkt de grootte van een DNA-fragment dat kan worden ingebracht in een ongewijzigde lambda vec­tor ernstig.

2. Het lambda-genoom is zo groot dat het meer dan één herkenningssequentie heeft voor vrijwel elke restrictie-endonucleasen. Restrictie kan niet worden gebruikt om het normale lambda-molecuul te splitsen op een manier die insertie van nieuw DNA mogelijk maakt, omdat de moleculen in verschillende kleine fragmenten zouden worden geknipt die zeer onwaarschijnlijk zouden zijn om een ​​levensvatbaar lambda-genoom te hervormen bij verwijdering.

Om deze redenen kan het DNA van natuurlijk voorkomende lambda-faag niet als kloneringsvector worden gebruikt. Om dit probleem op te lossen, passen we het genoom van de lambda aan en maken het geschikt om een ​​succesvolle vector te zijn.

Oplossen de problemen:

Uit onderzoek is gebleken dat een groot segment in het centrale gebied van het lambda-DNA-molecuul kan worden verwijderd zonder het vermogen van de faag om E. coli-cellen te infecteren aan te tasten. Verwijdering van dit niet-essentiële gebied tussen posities 20 en 35 op de kaart vermindert de grootte van het lambda-genoom met maximaal 15 kb.

Dit maakt ruimte voor maar liefst 18 kb nieuw DNA dat eraan kan worden toegevoegd om een ​​recombinant molecuul te vormen.

Deze aldus verwijderde niet-essentiële genen zijn betrokken bij de integratie en excisie van de lambda-profaag van het E. coli-chromosoom. Een verwijderd lambda-genoom is daarom niet-lysogeen en kan alleen de lytische infectiecyclus volgen. Dit is op zichzelf wenselijk voor een kloon­ing-vector, omdat het betekent dat we plaques kunnen krijgen (een zichtbare structuur gevormd in een celcultuur, zoals bacterieculturen in een voedingsmedium).

We kunnen onnodige restrictieplaatsen verwijderen door in vitro mutagenese uit te voeren. Een ECoRI-site, GAATTC, zou bijvoorbeeld kunnen worden veranderd in GGATTC, dat niet wordt herkend door het enzym.

Soorten Lambda-vectoren:

Er zijn twee soorten lambda-kloneringsvectoren.

(a) Lambda-insertievectoren:

In dit geval is een groot deel van de niet-essentiële re­gion verwijderd en zijn de twee armen aan elkaar geligeerd. Een insertievector bezit ten minste één unieke restrictieplaats waarin nieuw DNA kan worden ingevoegd. De grootte van het DNA-fragment dat een individuele vector kan dragen hangt af van de mate waarin het niet-essentiële gebied is verwijderd, b.v. lambda-gtl0, lambda-ZAP11.

(b) Lambda-vervangingsvectoren:

Deze vectoren hebben twee herkenningsplaatsen voor de restrictie-endonucleasen. Deze plaatsen flankeren een DNA-segment dat wordt vervangen door het te klonen DNA [Fig.4.34(a)]. Of­ten draagt ​​het vervangbare fragment (of stufferfragment) extra restrictieplaatsen die kunnen worden gebruikt om het in kleine stukjes te knippen, zodat het zeer onwaarschijnlijk is dat het zelf opnieuw wordt ingebracht tijdens een kloneringsexperiment.

Re­tion-vectoren zijn over het algemeen ontworpen om grote stukken DNA te dragen dan inser­tion-vectoren aankunnen, bijvoorbeeld lambda-EMBL, lambda-GEMll, enz.

Kloneringsexperimenten met lambda-inser­tion- of vervangingsvectoren:

Een kloneringsexperiment met een lambda-vector kan worden uitgevoerd door de vergelijkbare methode te volgen die we hebben gevolgd voor een plasmide-vector - de lambda-DNA-moleculen worden gedigereerd met een geschikt en shyable restrictie-endonuclease-enzym, het gen van interesse wordt toegevoegd, het mengsel wordt geligeerd en het resulterende recombinant DNA wordt geïntroduceerd in E. coli gastheercel (door een proces genaamd trans­fection) [Fig. 4.35(a)].

Dit type experiment vereist dat de vector in zijn cirkelvorm is, met de cos-plaatsen waterstofgebonden aan elkaar.

Het transfectieproces dat een circulair lambda-DNA-molecuul vereist, is niet bijzonder efficiënt. Om een ​​groter aantal recombinanten te verkrijgen, kunnen we enkele verfijningen in het lambda-genoom introduceren. In dit opzicht kunnen we de voorkeur geven aan een lineaire vorm van de vector. Wanneer de lineaire vorm van de vector wordt verteerd met het relevante restrictie-endonuclease, komen de linker- en rechterarm vrij als afzonderlijke fragmenten.

Een recombinant DNA kan worden geconstrueerd door ons gen van belang te mengen met de vectorarmen [Fig. 4.35(b)]. Ligatie resulteert in verschillende moleculaire arrangementen, waaronder catenae's bestaande uit linkerarm-DNA-rechterarm vele malen herhaald. Recombinant ph­age dat aldus in de reageerbuis wordt geproduceerd, kan worden gebruikt om een ​​E.coli-cultuur te infecteren.

Visualisatie van faaginfectie na het proces van transfectie:

De invoer van recombinant DNA in de gastheercel wordt gevolgd door de lytische cyclus die uiteindelijk resulteert in de lysis van de gastheercel. De gelyseerde gastheercel kan zich op het agarmedium bevinden als plaques op een gazon van bacteriën. Elke plaque is een opruimingszone die wordt geproduceerd als de fagen de cel lyseren en verder gaan om de naburige bacteriën te infecteren.

Screening van getransformeerde gastheercellen door bacteriofaag lambda-vectoren:

Er zou een verscheidenheid aan manieren kunnen worden gebruikt om onderscheid te maken tussen recombinante plaques en niet-recombinante plaques.

De methoden zijn als volgt:

(a) Insertionele inactivatie van Lac Z'8217-gen gedragen door de Lambda-faagvector:

Insertie van ons gen van belang in het lac Z'8217-gen inactiveert de synthese van beta-galactosidase. Recombinanten worden onderscheiden door het uitplaten van cellen op X-gal-agar waar de recombinante plaques helder zijn, terwijl niet-recombinante plaques blauw van kleur zijn.

(b) Insertie-inactivatie van Lambda Cl-gen:

Verschillende lambda-kloneringsvectoren hebben een restrictieplaats in het cl-gen. Insertie-inactivatie van het cl-gen veroorzaakt een zichtbare verandering in de plaquemorfologie. Normale plaques zien er troebel (wazig) uit, terwijl re­combinante plaques met een verstoord cl-gen duidelijk zijn.

(C) Selectie met behulp van het Spi-fenotype:

P2 ph­age is een familielid van lambda-faag, lamda-fagen kunnen geen E. coli-cellen infecteren die al een geïntegreerde P2-faag in zijn genoom hebben. Hierdoor wordt van lamda-faag gezegd dat het Spi-+ is (gevoelig voor P2-pro-faag in- en shyfection). Sommige lambda-kloneringsvectoren zijn zo ontworpen dat het inbrengen van nieuw DNA een verandering van Spi-+ naar Spi-'8211 veroorzaakt, waardoor de recombinant wordt belemmerd om cellen te infecteren die P2-profagen dragen.

Dergelijke cellen worden gebruikt als gastheer voor kloneringsexperimenten met deze vectoren. In dit geval zijn recombinanten Spi-, dus ze kunnen plaques vormen.

(NS) Selectie op basis van Lambda Ge­nome Grootte:

We weten dit vanaf het begin & schuwen dat elk gen van belang dat kleiner is dan 37kb of meer dan 52kb niet in de kop van lambda-faag kan worden verpakt. Veel lambda-vectoren zijn geconstrueerd door grote segmenten van het lambda-DNA-molecuul te verwijderen en zijn dus minder dan 37 kb lang.

Deze kunnen alleen worden verpakt in rijpe faagdeeltjes nadat ons gen van belang is ingebracht. Dit brengt de totale genoomgrootte op 37 kb of meer. Daarom kunnen met deze vectoren alleen recombi­nant-fagen repliceren.

Gebruik van bacteriofaag lambda-vectoren:

Het belangrijkste gebruik van alle op lambda gebaseerde vectoren is het klonen van DNA-fragmenten die te lang zijn om door plasmide- of M13-vectoren te worden verwerkt. Een vervangings- en shyment-vector zoals lambda-EMBL4 kan tot 20 kb van ons gen van belang dragen. Dit komt overeen met een maximale insertiegrootte van ongeveer 8 kb voor bijna alle plasmiden en minder dan 3 kb voor M13-vectoren.

Voordelen van Bacteriofaag Lambda Vec & shytors

Hieronder volgen de voordelen van lambda vec­tors:

1. Opslag van faagdeeltjes is relatief veel gemakkelijker dan die van op plasmiden gebaseerde vectoren.

2. De houdbaarheid van faagdeeltjes is oneindig.

3. Transfectie van E. coli is veel gemakkelijker met faagdeeltjes.

Nadelen van bacteriofaag lambda-vectoren:

Als je een kloon hebt geïsoleerd, is het vaak best lastig om grote hoeveelheden DNA te isoleren. In de praktijk komen veel problemen voor die bij plasmiden niet voorkomen. Er is nog steeds geen echt snel, betrouwbaar protocol voor de productie van zeer schoon lambda-DNA.

De meest succesvolle methode is het gebruik van anionenuitwisselingskolommen. Het meest voorkomende probleem is dat het preparaat vuil bevat dat verdere verwerking, zoals een restrictievergisting, moeilijk of onmogelijk maakt.

Zelfs in de vervangingsvectoren bestaat bijna tweederde van het DNA uit vectorsequenties. Indien mogelijk moet u de secties die van belang zijn, klonen met behulp van plasmiden. LambdaZAP-banken kunnen werk besparen, omdat de plasmide-gedeelten in vivo worden uitgesneden, samen met het ingevoegde DNA. Dat proces is zeer efficiënt, vereist relatief weinig werkstappen en duurt slechts 1 tot 2 dagen.

Het is het meest geavanceerde type op lambda gebaseerde vector. Cosmiden zijn de hybriden tussen het faag-DNA-molecuul en het bacteriële plas­mid. Hun ontwerp is gebaseerd op het feit dat de enzymen die het lambda-DNA-mol­ecule in de faageiwitmantel verpakken, alleen de cos-plaatsen nodig hebben om te kunnen functioneren.

Constructie van cosmidevectoren:

Een cosmide is in feite een plasmide dat een cos-plaats draagt. Het heeft ook een selecteerbare marker nodig, zoals een ampicilline-resistent gen, en een plasmide-oorsprong van replicatie. Dit is belangrijk om op te merken dat aangezien cosmide alle lambda-genen mist, er dus geen plaques worden geproduceerd. In plaats daarvan worden kolonies gevormd op de selectieve media, net als bij plasmidevectoren.

Klonenexperiment met cosmidevectoren:

Dit wordt als volgt uitgevoerd. De cosmide wordt geopend en zijn unieke restrictieplaats en ons gen van interesse wordt ingevoegd. Deze fragmenten worden gewoonlijk geproduceerd door gedeeltelijke digestie met een restrictie-endonuclease, aangezien totale digestie bijna altijd resulteert in fragmenten die te klein zijn om te worden gekloneerd met een cosmide.

Ligatie wordt uitgevoerd zodat catenanen worden gevormd. Deze lambda-fagen worden vervolgens gebruikt om een ​​E. coli-cultuur te infecteren. Alle kolonies zijn recombinante kolonies omdat niet-recombinante lambda-fagen niet in de kop van de lambda-bacteriofaag kunnen worden verpakt.

Gebruik van cosmidevectoren:

Cosmiden worden gebruikt voor de constructie van genoombibliotheken van eukaryoten, aangezien deze kunnen worden gebruikt voor het klonen van grote DNA-fragmenten.

Voordelen van cosmiden:

Hieronder volgen de voordelen van cosmide-vectoren:

1. Deze kunnen worden gebruikt om genen van inter­est te klonen tot 40 kb.

2. Aangezien de lambda-faag het recombinante DNA in de gastheercel zal inbrengen, wordt een extra stap van het inbrengen van het recombinante DNA in de gastheercel niet uitgevoerd.

3. Er wordt een eenvoudige screeningmethode gevonden.

Hoewel M13-vectoren zeer bruikbaar zijn voor de productie van enkelstrengs versies van gekloonde genen, hebben ze één nadeel. Er is een limiet aan de grootte van het DNA-fragment dat kan worden gekloond met een M13-vector, waarbij 1500 bp over het algemeen wordt beschouwd als de maximale capaciteit.

Om dit probleem te omzeilen is een aantal nieuwe vectoren geconstrueerd die de hybriden zijn van plasmiden en M13-vectoren. We noemen ze phagemids (‘phage'8217 van M13 bacteriofaag en ‘mid'8217 van plasmide).

Constructie van faagmidevector:

Een typische faagmide heeft de volgende onderdelen:

1. Faag M13 oorsprong van replicatie.

2. Een deel van het lac Z'8217-gen aangedreven door lac pro­moter.

3. Een meervoudige kloneringsplaats (MCS) met het lac Z'8217-gen.

4. Faag T7- en T3-promotersequenties die de MCS-sequenties flankeren.

5. ColE1 oorsprong van replicatie.

Plasmiden die de M13-replicatieoorsprong dragen naast een conventionele oorsprong van dsDNA-synthese, kunnen worden gerepliceerd als dsDNA van de laatste of als enkelstrengs DNA van de M13-oorsprong.Replicatie vanaf de M13-oorsprong vereist dat de juiste pro­teïnen (zoals gen II-eiwit) worden verschaft vanuit een helperfaag die ook in de cel repliceert.

Replicatie genereert enkelstrengs DNA dat vervolgens kan worden verpakt in faagmantels. Voorbeelden van fagemiden zijn de vectoren pUC118, 119 en 120.

Ze worden gerepliceerd als plasmiden totdat de cel die ze bevat mede is geïnfecteerd met een helperfaag, zoals M13K07, die de eiwitten levert voor enkelstrengs DNA-synthese en verpakking. M13K07 is een M13-faag die is gemodificeerd, het meest belangrijk door de inbouw van een plasmide-replicatieoorsprong.

Replicatie vanaf deze oorsprong maakt het mogelijk dat de helperfaag aanwezig is in een hoog aantal kopieën per cel en daardoor de grotere hoeveelheden van de eiwitten die nodig zijn om het faagmidemolecuul te repliceren en te verpakken, kan bevorderen.

M13K07 bevat ook een kanamycineresistentiegen om selectie op de aanwezigheid van de helperfaag mogelijk te maken. (Natuurlijk is het mogelijk dat de M13K07-helperfaag ook verpakt is, maar in de praktijk blijken de verpakte faagmide-moleculen een 100-voudige overmaat boven de helperfaag te hebben.)

Een ander voorbeeld van deze vectoren is de pBluescript-reeks, zoals pBluescriptIIKSÞ, getoond in Fig. 4.39. Deze reeks plasmiden bevat, naast de reeds beschreven kenmerken, promotors van de E. coli-bacteriofagen T3 of T7, die bruikbaar zijn voor het tot expressie brengen van gekloonde sequenties.

Gebruik van faagmide-vectoren:

Deze vector is een multifunctionele vector omdat deze als volgt kan dienen:

Voordelen van faagmidevectoren:

Het belangrijkste voordeel van het faagmidesysteem is dat het kan worden gebruikt om enkel- of dubbelstrengs materiaal te verschaffen zonder herklonering.

Fasmiden zijn echte plasmiden met faaggenen. Dit zijn lineaire duplex-DNA's waarvan de uiteinden lambda-segmenten zijn die alle genen bevatten die nodig zijn voor een lytische infectie en waarvan het middelste gedeelte gelineariseerd is. Zowel de lambda- als de plasmide-replicatiefuncties zijn intact.

Evenmin dragen plasmidevectoren een lambda-aanhechtingsplaats. Eenmaal in de E. coli-cel kan de phas­mid zich als een faag repliceren en op de normale manier plaques vormen. Als de vector echter het gen bevat dat codeert voor lambda-repressor, dan repliceert het plasmide als een plasmide in plaats van als een faag.

Afhankelijk van het al dan niet functioneren van cl-proteïne (gecodeerd door repressor), kan de phasmid zich repliceren als plasmide (cl-proteïne inactief) of faag wanneer cl-proteïne actief is. De activiteit van cl-eiwit kan inactief zijn door de E.coli-cultuur bij 40°C te laten groeien.

Plasmiden kunnen op verschillende manieren worden gebruikt. DNA kan bijvoorbeeld op een conventionele manier in de plasmidevector worden gekloneerd en vervolgens kan het recombinante plasmide op de faag worden getild. Plasmiden zijn gemakkelijk op te slaan, ze hebben een effectief oneindige houdbaarheid en het screenen van fagen door moleculaire hybridisatie geeft schonere resultaten dan het screenen van bac­teriale kolonies.

De meeste kloneringsexperimenten worden uitgevoerd met E. coli als gastheer en de grootste verscheidenheid aan kloneringsvectoren is beschikbaar voor dit organisme. E. coli is vooral populair wanneer het doel van het kloneringsexperiment is om de basiskenmerken van de moleculaire biologie te bestuderen, zoals de structuur en functie van genen. Onder bepaalde omstandigheden kan het echter wenselijk zijn om een ​​andere gastheer te gebruiken voor een genkloneringsexperiment.

Maar wanneer het doel van het RDT-experiment niet alleen is om een ​​gen te bestuderen, maar om klonen te gebruiken om een ​​belangrijk meta­bolisch product te con­trol of de synthese te verbeteren (bijv. om herbicideresistentie in een gewas te introduceren), dan nemen we een gastheercel die geavanceerder is en in staat is om een ​​geavanceerd niveau van metabolisme te bereiken.

Hierdoor beschouwen we vaak eukaryote vectoren voor onze kloneringsexperimenten. Gist-, dierlijke en plantaardige vectoren worden allemaal beschouwd als eukaryote vectoren.

De gist (Saccharomyces cerevisiae) is een van de belangrijkste organismen in de biotechnol­ogy. Zijn rol is ook erg belangrijk bij het brouwen en het maken van brood. Gist is gebruikt als gastheerorganisme voor de productie van belangrijke geneesmiddelen uit gekloonde genen. De ontwikkeling van kloneringsvectoren voor gist is enorm gestimuleerd door de ontdekking van plasmide dat aanwezig is in de meeste stammen van S. cerevisiae.

Er zijn verschillende gistvectoren ontworpen, zodra het vermogen en de bruikbaarheid van gist is bevestigd. Ze hebben allemaal drie kenmerken gemeen.

1. Ze bevatten allemaal unieke doelwitplaatsen voor een aantal restrictie-endonucleasen.

2. Ze kunnen allemaal repliceren in E. coli, vaak met een hoog aantal kopieën.

3. Ze gebruiken allemaal markers die kunnen worden gebruikt om recombinante gisten te selecteren, bijvoorbeeld Hi53, leo2, trpl en ura3.

Soorten gistvectoren:

Alle gistvectoren kunnen in drie typen worden verdeeld:

1. Gistkloneringsvectoren (of Gistplasmidevectoren)

2. Gistexpressievectoren

3. Gist kunstmatige chromosomen (YAC)

Gistkloneringsvectoren (of gistplasmidevectoren):

Deze vectoren worden gebruikt om ons gen van interesse in de gistgastheercel te klonen (meerdere dubbele kopieën te maken). Alle kloneringsvectoren zijn geconstrueerd uit 2fx-plasmide, het van nature voorkomende plasmide in de gistcel.

Ze zijn van de volgende typen:

1. Episomale gistplasmiden (YEps):

Het is 6.318 bp lang en heeft een kopienummer van 70-200. De meeste YEp's zijn shuttle-vec­tors (kunnen zowel in prokaryote gastheren als in eukaryote gastheren als vectoren worden gebruikt) en zijn dus op een schuchtere manier ontworpen. Een voorbeeld van YEps is Yep13.

Het heeft de volgende onderdelen:

(a) Oorsprong van replicatie afgeleid van 2m plas­mid.

(b) amp R- en tetR-regio van pBR322. Dit selecteerbare markergebied is nuttig voor het screenen van recombinante gastheercellen wanneer de vector wordt gebruikt in een prokaryotische cel.

(c) LEU2-regio die is afgeleid van gistchromosoom en zou kunnen worden gebruikt als een selecteerbaar gebied wanneer de vector wordt gebruikt in een eukary-shyotische cel. LEU2, dat codeert voor bèta-iso-propylmalaatdehydrogenase, een van de enzymen die betrokken zijn bij de omzetting van pyrodruivenzuur in leucine.

Dit is erg belangrijk om op te merken dat wanneer we gistcellen nemen voor YEps, we alleen leu2-gisten moeten nemen die auxo-shytrofe mutanten moeten zijn met een niet-functioneel LEU2-gen.

De leu2−-gistgastheercellen zijn niet in staat aminozuur leucine te synthetiseren en kunnen overleven, alleen als dit aminozuur als voedingsstof in het groeimedium wordt geleverd [Fig. 4.41(a)]. Se­lection is mogelijk omdat transformanten gastheercellen een kopie van YEp bevatten (met het LEU2-gen) en goed in staat zijn om te groeien in de afwezigheid van aminozuren.

In een kloneringsexperiment werden cellen Eire uitgeplaat op minimaal medium, dat geen toegevoegde aminozuren bevat. Alleen getransformeerde cellen kunnen overleven en kolonies vormen [Fig. 4.41(b)].

YEp kan in het gist-chro­mosoom worden geïnsereerd door een proces van homologe recombinatie tussen het plasmide LEU2-gen en het gistmutante LEU2-gen. Het plasmide kan geïntegreerd blijven, of een latere recombinatiegebeurtenis kan ertoe leiden dat het opnieuw wordt uitgesneden.

2. Gistintegratieve plasmiden (YIPs):

Dit zijn in feite bacteriële plasmiden die een gistgen verdrijven. Een voorbeeld is YIp5, dat pBR322 is met een ingevoegd URA3-gen.

3. Replicatieve gistplasmiden (YRps):

Deze kunnen zich als onafhankelijke plasmiden vermenigvuldigen omdat ze een chromo­somale DNA-sequentie dragen die een ori­gin van replicatie bevat. Een voorbeeld is YRp7.

Gistexpressievectoren:

Deze vectoren worden gebruikt wanneer het ons doel is om ons gen van belang in de gistcel te exprimeren. Gistexpressievectoren zullen promotor- en terminatorsequenties gebruiken naast het gen van belang. Afgezien hiervan hebben we genetische tags zoals het gen voor groene fluorescerende eiwitten (GFP) voor het volgen van de locatie van het eiwit na zijn biosynthese.

Hieronder volgen enkele voorbeelden:

Gistexpressievector met een hoog aantal kopieën die het aminoglycosidefosfotransferasegen draagt ​​voor selectie in gist met behulp van G418. Inserts worden tot expressie gebracht vanaf de sterke TEF-promotor.

Gistexpressievector met een laag aantal kopieën die het aminoglycosidefosfotransferasegen draagt ​​voor selectie in gist met behulp van G418. Inserts worden tot expressie gebracht vanaf de zwakke CYC1-promotor.

Gistexpressievector voor uitgescheiden eiwitten. Een sterke TEF1-promotor zorgt voor constitutieve expressie van een cDNA dat is gefuseerd met de pre-pro-leidersequentie van paringsfactor-alfa om de uitscheiding van het eiwitproduct in het medium te verzekeren.

Kunstmatige gistchromosomen:

Kunstmatige gistchromosomen (YAC's) zijn synthetische dubbelstrengs lineaire constructies die de elementen bevatten die nodig zijn voor replica­tion als onafhankelijke chromosomen in gist. Zie kunstmatige chromosomen voor meer details.

De volgende zijn enkele voorbeelden van dierlijke vectoren:

Baculovirus tast insecten aan. Dit virus is staafvormig met een groot dubbelstrengs genoom. Tijdens normale infecties produceert baculovirus nucleaire inclusielichaampjes die bestaan ​​uit virusdeeltjes ingebed in een eiwitma­trix.

Deze eiwitmatrix wordt polyhedrine genoemd en is goed voor 70% van het totale pro­teïne dat door het virus wordt gecodeerd. Genetische manipulatie van het virale DNA is niet mogelijk omdat het een zeer groot DNA heeft met veel restrictieplaatsen voor een enkel enzym.

Daarom wordt het gen van belang gekloneerd in de kleine recombinatie-overdrachtsvector en samen met het wildtype virus in de cel gecotransfecteerd in insectencellijnen. Homolo­gous-recombinatie vindt plaats tussen het polyhedrine-gen en ons gen van inter­est.

Zo zal ons gen van belang worden overgebracht van het vectorplasmide naar het wildtype virus en het polyhedrine-gen zal van het virus op het plas­mid worden overgedragen.

Dit is zoiets als verplaatsingsreactie. Deze verplaatsing van het gen heeft geen invloed op de replicatie van het virus, aangezien het polyhedrine-gen niet vereist is voor replicatie. Het recombinatievirus repliceert in de cellen en genereert karakteristieke plaques (zonder inclusielichaampjes).

Normaal gesproken wordt het virus gekweekt in de insectencellijn van Spodopterafrugiperda. Het gen van belang komt tot expressie tijdens de infectie en tegen de tijd dat de cel lyseert, kunnen zeer hoge eiwitopbrengsten worden bereikt.

2. Boviene papillomavirusvector:

Bo­vine papillomavirus (BPV) veroorzaakt wratten (ongecontroleerde epitheliale proliferatie) bij runderen.

BPV infecteert normaal gesproken terminaal gedifferentieerde plaveiselepitheelcellen.

BPV heeft een capside-eiwit dat een circulair dubbelstrengs DNA met een grootte van 79 kb omgeeft. 69% van dit genoom is belangrijk voor de virale functie, terwijl 31% van het genoom kan worden vervangen door een vreemde DNA-sequentie zoals ons gen van belang.

Het recombinante BPV wordt geconstrueerd door ons gen van belang en BPV-vector (69%) te ligeren op het pBR322-plasmide, waardoor de shuttle-vector wordt gegenereerd die de plasmide-ori-plaats en virusreplicatiesequenties bevat. Deze shuttle-vectoren worden eerst vermenigvuldigd in E. coli-cellen en vervolgens worden ze getransformeerd in muizencellijn.

Het grote voordeel van BPV is het genereren van een permanente cellijn. Omdat de geïnfecteerde cellen niet worden gedood, wordt een stabiel aantal plasmiden gevonden, zelfs wanneer het insert van grote omvang is. De selectie van transformanten is heel eenvoudig omdat ze een stapel cellen vormen op de overgedragen monolaag van cellen, genaamd “Focus'8221.

De getransformeerde cellen worden vervolgens geselecteerd door de aanwezigheid van een markergen dat meestal het neomy­cinefosfotransferasegen is dat codeert voor resistentie tegen G418. Een voorbeeld van dit type vector is p3.7LDL.

3. Op SV40 Virus gebaseerde vectoren:

SV 40 is een bolvormig virus met dubbelstrengs circulair DNA met een grootte van 5,2 kb. Het virale eiwit bevat drie viraal gecodeerde eiwitten. VP1 is het belangrijkste eiwit dat aanwezig is in het capside met een grootte van 47000 kDa. Er zijn ook nog twee pro­teins VP2 en VP3 aanwezig.

Het DNA van het virus is geassocieerd met de vier histonen (H4, H2A, H2B en H3) eiwitten. Het virale DNA kan worden gesegmenteerd in vijf precieze segmenten die coderen voor vijf verschillende eiwitten kleine T, grote T, VP1, VP2 en VP3. Het VP1-coderingsgebied overlapt VP2 en VP3 in een ander vertaalleesframe. SV 40-virus infecteert niercellijnen van apen.

Het virus reist naar de kern en wordt ongecoat. Vervolgens worden beide T-genen die zich in de buurt van de oorsprong bevinden, met de klok mee vertaald. Het grote T-pro­teïne is belangrijk voor de replica­te van virus-DNA en begint na de translatie van het grote T-eiwit.

Replicatie begint bij de oorsprong en is bidirectioneel. Het eindigt wanneer twee replicatievorken elkaar ontmoeten. Per cel worden ongeveer 105 moleculen duplex-DNA gesynthetiseerd en verkleind. Samen met DNA-replicatie worden VP1-, VP2- en VP3-eiwitten gesynthetiseerd en verkleind.

Dan vindt het inpakken van DNA plaats om nieuwe virionen te vormen, die worden vrijgegeven door de ly­sis van de cel. Het hele proces kan ook worden gestart door transfectie met naakt SV 40-DNA. SV40-vectoren zijn op dezelfde manier geconstrueerd als faagvectoren. Delen van het virale genoom worden verwijderd en vervangen door andere DNA-segmenten. Er zijn drie typen SV 40-voertuigen die elk een duidelijk voor- of nadeel hebben.

(a) SV40 passieve transformerende vectoren:

Deze vectoren repliceren noch pro­duceren virionen, maar integreren eenvoudig de DNA-segmenten in het cellulaire DNA. Deze getransformeerde cellen repliceren het nieuwe DNA als een integraal onderdeel van hun eigen genomen. Deze plasmiden zijn ook shuttle-vectoren en omvatten selectieve markers zoals herpesvirus-, thymidinekinase- of neo-genen.

Afgezien van de selectieve markers, omvatten ze transcriptionele regulatorsignalen en polyadenylatieplaatsen.

(b) SV40 transducterende vectoren:

Deze vec­tors zijn in staat om zich te repliceren en in viriondeeltjes te verpakken. Transducerende vec­tors bevatten een segment van 300 bp dat fungeert als de oorsprong van replicatie en zorgt voor de transcriptionele regulerende signalen voor de synthese van mRNA's.

Dit type vector heeft een insert nodig van 3,9 tot 4,5 kb. Deze plasmiden hebben niet de genen die coderen voor VP1, VP2 en VP3. Omdat er geen DNA aan SV 40 DNA kan worden toegevoegd zonder enig DNA uit het genoom te verwijderen, wordt bij het toevoegen van de insert het genoom-DNA verwijderd dat niet nodig is.

De functies van het DNA die verloren gaan door deze deleties worden geleverd door een helpervirus te gebruiken of door de SV40-gedeleteerde genen in het gastheer-DNA in te voegen. Normaal gesproken worden de recombinante SV 40-vectoren (meestal bestaande uit DNA van in-shyterest en replicatiesequentie en gen voor het coderen van VP1, VP2 en VP3) getransformeerd in de cos-cellijn.

Cos-cellijn is een niercellijn van de nier van de Afrikaanse groene aap. Het heeft het T-eiwitgen ingebouwd in het genoom. Dus wanneer de vector in deze cellen wordt getransfecteerd, worden viriondeeltjes verkregen met behulp van helpervirus.

(c) SV40-plasmidevectoren:

Deze vectoren vermenigvuldigen zich in de apencellijn maar zijn niet verpakt als de virionen. Deze vectoren bevatten gewoonlijk oorsprong van replicatie-sequenties en grotere T-eiwitgenen, maar bevatten geen VP1-, VP2- en VP3-genen. Het zijn shuttle-vectoren en hebben het vermogen om zich zowel in E. coli- als in apencellijnen te vermenigvuldigen.

Kloneringsvectoren voor hogere planten werden in de jaren tachtig ontwikkeld en het gebruik ervan heeft geleid tot de genetisch gemodificeerde (GM)-gewassen die tegenwoordig in de krantenkoppen staan.

We zullen de details van plantenvec­tors en de genetische modificatie van gewassen onderzoeken. Hier kijken we naar de kloonvectoren en hoe ze worden gebruikt.

Bij hogere planten zijn met wisselend succes drie soorten kloonsystemen toegepast:

1. Vectoren gebaseerd op natuurlijk voorkomende plas­miden van Agrobacterium (bijv. Ti-plasmiden van A. tumifaciens en Ri-plasmide van A. rhizogens).

2. Directe genoverdracht met behulp van verschillende soorten plasmide-DNA. (bijvoorbeeld met behulp van supercoiled plasmiden).

3. Vectoren gebaseerd op plantenvirussen (bijv. Caulimo-virusvectoren en Gemini-virusvectoren).

Shuttle vectoren:

Shuttle-vectoren zijn vectoren die zich kunnen vermenigvuldigen in twee verschillende niet-verwante soorten. Shuttle-reactoren zijn ontworpen om te repliceren in de cellen van twee soorten, omdat ze twee replicatieoorsprongen bevatten, één die geschikt is voor elke soort, evenals genen die nodig zijn voor replicatie en niet worden geleverd door de gastheercel, dwz het is zelfvoorzienend met het proces van de replicatie ervan.

De shuttle-vectoren zijn van de volgende typen:

1. Eukaryotische – Prokaryotische Shuttle Vec & shytors:

Vectoren die zich kunnen voortplanten in eukaryoten en prokaryoten. YEp vec­tors kunnen bijvoorbeeld zowel in gist (schimmels) als in E. coli (bacteriën) worden vermeerderd.

2. Prokaryote – Prokaryote Shuttle Vec & shytors:

Vectoren die kunnen worden vermeerderd in twee niet-verwante prokaryotische gastheercellen, bijv. RSF1010-vectoren, kunnen zowel in bacteriën als in spirocheten worden vermeerderd.

De gemeenschappelijke kenmerken van dergelijke shuttle vec­tors of eukaryote vectoren zijn de volgende:

(a) Ze zijn in staat om te repliceren in twee of meer soorten gastheren, waaronder prokaryotische en eukaryote cellen.

(b) Ze repliceren autonoom, of integreren in het gastheergenoom en repliceren wanneer de gastheercel zich vermenigvuldigt.

(c) Deze vectoren worden vaak gebruikt voor het transporteren van genen van het ene organisme naar het andere.

De aanwezigheid van twee replicatieoorsprongen levert soms speciale problemen op, een deel van de replicatieoorsprong van de ene soort is totaal niet verwant aan de andere en interfereert met de rep­licatie van een andere gastheer. Daarom moeten in een shuttle vec­tor verschillende soorten replicatieoorsprongen worden ingevoegd en gecontroleerd voordat wordt geëxperimenteerd.

Kunstmatige chromosomen:

Kunstmatige chromosomen zijn synthetisch ongetekende DNA-moleculen met een bekende structuur, die in vitro (in het laboratorium) worden samengesteld uit specifieke DNA-sequenties die werken als een natuurlijk chromosoom. Kunstmatige chromo­somes zijn cirkelvormige of lineaire vectoren die stabiel in stand worden gehouden, meestal 1-2 kopieën per cel.

Ze zijn enorm groot in vergelijking met andere vectoren, maar kunnen zeer grote segmenten van chromosomen klonen (zelfs een heel chromosoom). Alvorens verschillende soorten kunstmatige chro­mosomen te zien, kunnen de drie belangrijkste componenten van een eukaryoot chromosoom worden gezien die nodig zijn voor het stabiele onderhoud ervan in een cel.

1. Het centromeer, dat nodig is om het chromosoom tijdens de celdeling correct over de dochtercellen te verdelen.

2. Twee telomeren, de structuren aan de uiteinden van een chromosoom, die nodig zijn om de uiteinden op de juiste manier te repliceren en die ook voorkomen dat het chromo­soom wordt weggeknabbeld door exonu­cleasen.

3. De oorsprong van replicatie, dit zijn de posities langs het chromosoom waarop DNA-replicatie begint, vergelijkbaar met de oorsprong van replicatie van een plasmide.

Als we eenmaal de chromosomale structuur van een eukaryoot organisme (zoals hu­mans en gist) hebben gedefinieerd, kunnen we de belangrijkste componenten van hun chromosomen isoleren en ze samenvoegen om een ​​kunstmatig chromo­some te vormen. Vervolgens kunnen we in dit kunstmatige chromosoom ons gen van belang invoegen dat vervolgens in zijn respectieve cel kan worden gekloond.

Hieronder volgen de soorten kunstmatige chromosomen:

A. Kunstmatige gistchromosomen (YAC):

Een YAC kan worden beschouwd als een functioneel kunstmatig chromosoom, aangezien het drie specifieke DNA-sequenties bevat die het mogelijk maken om zich van de ene gistcel naar zijn nakomelingen voort te planten:

De telomeer die zich aan elk chromosoomuiteinde bevindt, beschermt het lineaire DNA tegen afbraak door nucleasen.

Het centromeer dat de aanhechtingsplaats is voor mitotische spoelvezels, 'trekt' een kopie van elk gedupliceerd chromosoom in elke nieuwe dochtercel.

3. Oorsprong van replicatie (OF):

Replicatieoorsprongsequenties die specifieke DNA-sequenties zijn waarmee de DNA-replicatiemachinerie zich op het DNA kan assembleren en naar de replicatievorken kan bewegen.

Selecteerbare markers die gemakkelijke isolatie mogelijk maken van gistcellen die een kunstmatig chromosoom hebben opgenomen.

Erkenningsplaats voor twee restrictie-enzymen EcoRI en BamHl.

Klonenexperiment met behulp van een YAC-vector:

1. Grote DNA-fragmenten worden verkregen door restrictiedigestie met auto­rying uit te voeren met behulp van EcoRI.

2. De YAC wordt verteerd door twee restrictie-enzymen EcoRI en Bam HI.

3. Die twee elementen recombineren op de EcoRI-plaatsen en zijn covalent gekoppeld door DNA-ligase.

4. Er wordt een recombinante YAC-vector geproduceerd, een kunstmatig chromosoom van gist waarin genomisch DNA is ingebracht. Deze vector kan worden gebruikt om gistcellen te infecteren en een onbeperkt aantal kopieën te genereren.

1. YAC kan worden gebruikt om verschillende aspecten van chromosoomstructuur en gedrag te bestuderen, bijvoorbeeld om de segregatie van chromosomen tijdens meiose te onderzoeken.

2. Het YAC-kloneringssysteem kan een DNA-insertie van meer dan 100 kb gebruiken. Hierdoor kunnen ze worden gebruikt om de functies en wijzen van expressie van genen te bestuderen die voorheen onhandelbaar waren voor analyse door middel van recombi­nant-DNA-technieken.

3. YAC's kunnen worden vermeerderd in zoogdiercellen, waardoor de functionele analyse kan worden uitgevoerd in het organisme waarin het gen zich normaal bevindt. Door ze te gebruiken, kunnen we dus leren over de ware vorm van genexpressie in vivo-omstandigheden.

4. Kunstmatige gistchromosomen zijn zeer nuttig bij de productie van genenbibliotheken. E. coli-vectoren kunnen DNA-insert maxi­mum tot 300 kb opnemen. Hierdoor zijn er zo'n 30000 klonen nodig voor een menselijke genenbibliotheek als we ze als kloneringsvector gebruiken.

YAC-vectoren worden echter routinematig gebruikt om fragmenten van 600 kb te klonen, en speciale typen kunnen DNA tot 1400 kb lang aan, waarbij de laatste de grootte van een menselijke genenbibliotheek terugbrengt tot slechts 6500 klonen.

Soms wordt YAC gezien met het probleem van gebrek aan stabiliteit van de insertie, waarbij het gekloonde DNA soms wordt herschikt door intramoleculaire recombinatie. Desalniettemin zijn YAC's van enorme waarde geweest bij het leveren van lange stukken gekloond DNA voor gebruik in grootschalige DNA-sequencingprojecten. Voorbeeld van YAC is pYAC3.

2. Bacteriële kunstmatige chromosomen (BAC):

Bacteriële Kunstmatige Chromosomen (BAC's) zijn kloneringsvectoren op basis van de extra-chromosomale plasmiden van E.coli, F-factor of vruchtbaarheidsfactor genoemd. Deze vectoren maken de constructie van kunstmatige chromosomen mogelijk, die in E.coli kunnen worden gekloond.

Deze vector is nuttig voor het klonen van DNA-fragmenten tot 350 kb, maar kan worden gehanteerd als gewone bacteriële plasmidevectoren en is zeer nuttig voor het sequencen van grote stukken chromosomaal DNA.

Zoals elke andere vector bevatten BAC's ori-sequenties die zijn afgeleid van E. coli-plasmide F-factor, meerdere kloneringsplaatsen (MCS) met unieke restrictieplaatsen en geschikte selecteerbare markers. De genomen van verschillende grote DNA-virussen en RNA-virussen zijn gekloond als BAC's. Deze constructies worden aangeduid als: “besmettelijke klonen”, aangezien transfectie van het BAC-construct in gastheercellen voldoende is om virale infectie te initiëren.

De besmettelijke eigenschap van deze BAC's heeft de studie van vele virussen zoals herpesvirussen, pokkenvirussen en coronavirussen toegankelijker gemaakt. BAC's worden nu in grotere mate gebruikt bij het modelleren van genetische ziekten, vaak naast transgene muizen.

BAC's zijn op dit gebied gebruikt omdat complexe genen verschillende regulerende sequenties stroomopwaarts van de coderende sequentie kunnen hebben, waaronder verschillende promotorsequenties die het expressieniveau van een gen bepalen. BAC's zijn tot op zekere hoogte met succes gebruikt bij muizen bij het bestuderen van neurologische ziekten zoals de ziekte van Alzheimer of zoals in het geval van aneuploïdie geassocieerd met het syndroom van Down.

Voorbeelden van BAC zijn pBACE3.6, pBeloBAC11 enz.

3. Menselijke kunstmatige chromosomen (HAC):

Een humaan kunstmatig chromosoom (HAC) is een mini-chromosoom dat kunstmatig in menselijke cellen wordt geconstrueerd. Dat wil zeggen, in plaats van 46 chromosomen, zou de cel er 47 kunnen hebben, waarbij de 47e erg klein is, ongeveer 6-10 megabasen groot, en in staat is om nieuwe genen te dragen die door menselijke onderzoekers zijn geïntroduceerd.

Door zijn eigen zelfreplicerende en segregerende systemen te negeren, kan een HAC zich gedragen als een stabiel chro­mosoom dat onafhankelijk is van de chromo­somen van gastheercellen.

De essentiële elementen voor het onderhoud en de overdracht van chromosomen zijn de volgende drie gebieden:

1. De 'oorsprong van replicatie', waaruit de du­plicatie van DNA begint,

2. De “centromeer,” die functioneert in een goede chromosoomsegregatie tijdens celdeling, en

3. De '8220telomeer' die de uiteinden van lineaire chromosomen beschermt.

Ze zijn bruikbaar in expressiestudies als vectoren voor genoverdracht en zijn hulpmiddelen voor het ophelderen van de functie van menselijke chromosomen. Ze worden gekweekt in HT1080-cellen en zijn tot zes maanden mitotisch en cytogenetisch stabiel.

4. Pl-afgeleid kunstmatig chromosoom (PAC):

Dit zijn DNA-constructen die zijn afgeleid van het DNA van PI-bacteriofaag. Ze kunnen grote hoeveelheden (ongeveer 100-300 kilobasen) van andere sequenties dragen voor een verscheidenheid aan bio-engineeringdoeleinden. Het is een type vector dat wordt gebruikt voor het klonen van DNA-fragmenten (gemiddelde insertgrootte van 100 tot 300 kb, 150 kb) in Escherichia coli-cellen.


WHO werkt de nomenclatuur van SARS-CoV-2-varianten bij

Lisa Winter
1 juni 2021

D e naamgeving van varianten van SARS-CoV-2 is een beetje slordig geweest. Verschillende databases die de sequenties van het virus delen, hebben verschillende nomenclatuurnormen. Zo heet de variant die in het Verenigd Koninkrijk is ontstaan ​​op het Pango-platform B.1.1.7, maar op Nextstrain 20I/S:501Y.V1. Gisteren (31 mei) heeft de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) aangekondigd dat SARS-CoV-2-varianten van belang (VOI) en varianten van zorg (VOC) zullen worden genoemd op basis van het Griekse alfabet voor doeleinden van openbare discussie.

Omdat B.1.1.7 de eerste VOC was die door de WHO werd aangewezen, wordt het onder het nieuwe naamgevingssysteem Alpha genoemd. B.1.351, afkomstig uit Brazilië, heet nu Beta. De twee andere VOC's zijn P.1, de variant die voor het eerst werd geïdentificeerd in Brazilië en nu Gamma wordt genoemd, en B.1.617.2 die zijn oorsprong vindt in India, nu Delta genoemd. De zes door de WHO aangewezen VOI's nemen Epsilon via Kappa op in het Griekse alfabet. De volledige lijst zal worden bijgehouden op de website van de WHO.

"Deze [Griekse] labels vervangen geen bestaande wetenschappelijke namen (bijvoorbeeld die toegewezen door GISAID, Nextstrain en Pango), die belangrijke wetenschappelijke informatie overbrengen en zullen blijven worden gebruikt in onderzoek", luidt de verklaring van de WHO.

Volgens de WHO zijn de technische variantnamen te verwarrend voor het grote publiek en "mensen nemen daarom vaak hun toevlucht tot belvarianten op de plaatsen waar ze worden gedetecteerd, wat stigmatiserend en discriminerend is."

Het nieuwe naamgevingssysteem komt lang nadat de eerste varianten werden beschreven. WHO-functionarissen zeggen dat de beslissing kwam na veel discussie over welke naamgevingsconventie het beste zou zijn. Reuters meldt dat de groep andere mogelijkheden heeft overwogen, waaronder portmanteaus, fruit of Griekse goden.

Volgens STAT, bestond de groep achter de beslissing uit veel van dezelfde mensen die in het International Committee on the Taxonomy of Viruses zitten. Hoewel de organisatie SARS-CoV-2 noemde, valt de variantnomenclatuur buiten het officiële bereik, en dus werd de taak overgelaten aan de WHO.

“Ik heb gehoord dat het soms een hele uitdaging is om tot overeenstemming te komen over de naamgeving”, vertelt Frank Konings, de leider van de werkgroep. STAT. "Dit was een relatief eenvoudige discussie om op het punt te komen waarop iedereen het erover eens was."


NIEUWE MATEN

De CGSC-database van E coli genetische informatie omvat: genotypen en referentie-informatie voor de stammen in de CGSC-collectie, de namen, synoniemen, eigenschappen en kaartpositie voor genen, genproduct informatie en informatie over specifieke mutaties en verwijzingen naar primaire literatuur. De openbare versie van de database bevat deze informatie en kan direct worden opgevraagd via deze CGSC DB WebServer. Gebruik voor hulp de hulplinks hierboven en op elk vragenformulier, of neem rechtstreeks contact met ons op.


Bekijk de video: - HL Inheritance (Februari 2023).