Informatie

Lokalisatie van B- en T-cel

Lokalisatie van B- en T-cel


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Wat betekent lokalisatie van B-cel??
"Lokalisatie van B- en T-cellen in allergenen kan niet samenvallen". Wat betekent deze verklaring?
(Ik heb de afgelopen 8 jaar geen biologie gestudeerd en nu ga ik er doorheen omdat ik het nodig heb voor mijn onderzoek. Dus als iemand het in eenvoudige taal kan beschrijven, zou het erg nuttig zijn)


Ik denk dat de reden dat je moeite hebt met het onderscheiden van de verklaring is dat het niet echt veel zin heeft, en het naar mijn mening ook niet voldoende wordt uitgelegd in de krant. De zinnen die eraan voorafgaan, geven een kleine uitleg over waar de auteur op doelt:

Tot nu toe zijn 1500 allergene structuren geïdentificeerd. Online allergenendatabases en allergievoorspellingstools worden gebruikt om kruisreactiviteit tussen bekende allergenen te vinden. Lokalisatie van B- en T-cellen in het allergeen valt mogelijk niet samen.

Tijdens een overdreven immuunrespons (allergie) zullen de lymfocyten (B en T) zich lokaliseren (reizen of accumuleren ter) naar de plaats van het antigeen (allergeen).

Als ik zou kunnen raden, zou ik zeggen dat de auteur stelt dat gegevens hebben aangetoond dat er geen immuunrespons plaatsvindt (gegevens die zijn gegenereerd door de ophoping van lymfocyten in de buurt van het allergeen te beoordelen), ondanks het feit dat deze online allergeenvoorspellers zeggen dat een immuunrespons zou moeten gegenereerd worden.

De verklaring beweegt naar mijn mening om deze online allergeenvoorspellers in diskrediet te brengen.

Ik heb een deel van de rest van het manuscript bekeken en vond daarin nog twee andere dubbelzinnigheden.

De auteur citeert wel een ander artikel in uw zin die hier meer licht op kan werpen: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2686541/?report=reader

Een overzicht ervan gaf echter weinig duidelijkheid.

Ik vrees dat alleen een glazen bol of deze vraag aan de senior auteur je vraag met volledige zekerheid kan beantwoorden:

Dr. Rajat Kumar De Professor Machine Intelligence Unit Indian Statistical Institute 203 Barrackpore Trunk Road, Kolkata 700108, India.


"Lokalisatie van B- en T-cellen in allergenen mag niet samenvallen". Die zin is slecht geschreven, het verwart meer dan informeren.

Wat de auteur bedoelt is: de epitopen die B-cellen en T-cellen kunnen herkennen, zijn niet hetzelfde in één bepaald allergeen. We moeten niet vergeten dat bijna alle allergenen eiwitten zijn en eiwitten zijn opgebouwd uit aminozuren, en dat is wat epitopen vormen. Voor eenzelfde specifieke structuur, of bijvoorbeeld een allergeen, kan de T-cel alleen herkennen: LINEAIR epitopen terwijl de B-cel kan herkennen LINEAIR of CONFORMATIONEEL epitopen (dat wil zeggen, ze herkennen een 3D-achtige structuur en niet alleen een opeenvolging van aminozuren).

Wat ik mijn studenten altijd vertel, zodat ze het concept kunnen begrijpen, is dat de T-cellen een foto van een stoel kunnen 'zien' om deze te herkennen. Terwijl een B-cel dat kan en zelfs nog meer, kan hij een stoel echt "zien" voor wat hij is.


Fosfatidinezuurafhankelijke lokalisatie en basale defosforylering van RA-GEF's reguleren de lymfocytenhandel

Lymfocyten circuleren tussen perifere lymfoïde weefsels via bloed en lymfatische systemen, en chemokine-geïnduceerde migratie is belangrijk bij het transport van lymfocyten naar verre locaties. De kleine GTPase Rap1 is belangrijk bij het mediëren van de motiliteit van lymfocyten, en Rap1-GEF's zijn betrokken bij chemokine-gemedieerde Rap1-activering. Hier beschrijven we de rollen en mechanismen van Rap1-GEF's bij de handel in lymfocyten.

Resultaten

In deze studie laten we zien dat RA-GEF-1 en 2 (ook bekend als Rapgef2 en 6) belangrijke guanine-nucleotide-uitwisselingsfactoren (GEF) zijn voor Rap1 bij de handel in lymfocyten. Muizen met T-cel-specifieke knockouts van Rapgef2/6 demonstreren defecte homing en uitgang van T-cellen. Sfingosine-1-fosfaat (S1P) en chemokinen activeren Rap1 op een RA-GEF-1/2-afhankelijke manier, en hun tekort aan T-cellen schaadt Mst1-fosforylering, celpolarisatie en chemotaxis in de richting van de S1P-gradiënt. Aan de andere kant, B-cel-specifieke knock-outs van Rapgef2/6 verslechteren de chemokine-afhankelijke retentie van B-cellen in het beenmerg en vergemakkelijken passief de uittreding. Fosfolipase D2-afhankelijke productie van fosfatidinezuur door deze chemotactische factoren bepaalt de ruimtelijke verdeling van Rap1-GTP na membraanlokalisatie van RA-GEF's en induceert de ontwikkeling van voormembraan. Aan de andere kant is basale defosforylering van RA-GEF's noodzakelijk voor chemotactische factorafhankelijke toename van GEF-activiteit voor Rap1.

Conclusies

We laten hier zien dat subcellulaire distributie en activering van RA-GEF's sleutelfactoren zijn voor een directionele beweging van lymfocyten en dat fosfatidinezuur cruciaal is voor membraantranslocatie van RA-GEF's met chemokine-stimulatie.


Resultaten

Dynein werkt samen met NMII om het centrosoom te verplaatsen.

Om de rol van dyneïne te onderzoeken, transduceerden we primaire CD4+ T-celblasten met shRNA tegen de dyneïne zware keten (DynHC) samen met een construct dat codeert voor RFP-gelabeld centrin, een centrosomale marker (Fig. 1 EEN en B ). De T-cellen brachten de 5C.C7 TCR tot expressie, die het cytochroom van de mot herkent C88� (MCC)-peptide gebonden aan het klasse II MHC-molecuul I-Ek. Onderdrukking van DynHC verspreidde het Golgi-apparaat duidelijk, wat wijst op een verminderde dyneïnefunctie (Fig. S1). Vervolgens hebben we de polarisatie van het centrosoom beoordeeld door beeldvorming van vaste conjugaten gevormd door T-cellen en met antigeen beladen CH12 B-cellen (Fig. 1 BNS ). Zoals verwacht vertoonden controle-T-cellen die niet-targeting shRNA tot expressie brachten robuuste centrosoompolarisatie, gekenmerkt door een parameter 'polarisatie-index' die bijna nul was. Deze reactie werd opgeheven door nocodazol, dat het cytoskelet van de microtubuli depolymeriseert, en door forbolmyristaatacetaat (PMA), dat de heroriëntatie van het centrosoom blokkeert door ongepolariseerde DAG-signalering op te wekken (4). Verrassend genoeg vertoonden T-cellen zonder dyneïne slechts een klein polarisatiedefect dat in sommige experimenten geen statistische significantie bereikte. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met behulp van een recent beschreven dyneïne-remmer met een klein molecuul, ciliobrevin D (Fig. 1 .).E ), die zich richt op het dyneïne-motordomein (17). Vandaar dat verlies van dyneïne-eiwit of dyneïne-functie de heroriëntatie van het centrosoom slechts gedeeltelijk blokkeerde, wat het bestaan ​​​​van compenserende mechanismen impliceert.

Dynein en NMII werken samen tijdens centrosoompolarisatie in T-cel'x02013APC-conjugaten. (EENC) T-celblasten (5C.C7) die de aangegeven GFP-gemarkeerde shRNA's samen met centrin-RFP tot expressie brachten, werden gemengd met met antigeen beladen CH12-cellen en afgebeeld na fixatie. Cellen werden behandeld met 5 ng/ml PMA, 33 μM nocodazol, 50 μM blebbistatine of vehiculumcontrole (DMSO) zoals aangegeven. (EEN) Validatie van DHC shRNA-knockdown door immunoblot, waarbij β actine als laadcontrole dient. NT, niet-gerichte shRNA-controle. (B) Representatieve fluorescentiebeelden worden weergegeven als overlay op hun overeenkomstige helderveldbeelden. (Schaalbalken: 10 μm.) (C) Schematische weergave van de berekening van de polarisatie-index. (NS) Kwantificering van polarisatie-index in vaste conjugaten (N ≥ 44 conjugaten per aandoening). (E) Centrosoompolarisatie in vaste conjugaten behandeld met DMSO-vehiculum, 5 ng/ml PMA, 50 μM ciliobrevine D, 50 μM negatieve controleverbinding voor ciliobrevine D (verbinding 2), 50 μM blebbistatine of 50 μM ciliobrevin D in combinatie met 50 μM blebbistatine (N ≥ 45 conjugaten per aandoening). Foutbalken in NS en E duiden SEM aan. P waarden werden berekend met behulp van de Mann–Whitney-test. ***P < 0,001 **P < 0,01 *P ≤ 0,05 ns, P > 0,05.

Omdat NMII betrokken is bij polariteitsinductie in hechtende celtypen (10, 11), hebben we onderzocht of het zou kunnen bijdragen aan centrosoomheroriëntatie in T-cellen. Blebbistatine, een specifieke remmer van de myosine II-motor, veroorzaakte een klein polarisatiedefect, vergelijkbaar in grootte met dat veroorzaakt door alleen dyneïne-deficiëntie (Fig. 1 BE ). Het combineren van blebbistatine met DynHC shRNA of ciliobrevin D remde echter de polarisatie van het centrosoom grondig, met gemiddelde polarisatie-indices vergelijkbaar met met nocodazol en PMA behandelde cellen. TCR-geïnduceerde Erk-fosforylering werd niet beïnvloed door remming van dyneïne of NMII, wat impliceert dat de polarisatiefenotypen die we hebben waargenomen niet het gevolg waren van verminderde TCR-signalering (Fig. S2EEN). Deze resultaten gaven aan dat NMII en dyneïne op een gedeeltelijk redundante manier werken om het centrosoom naar de IS te verplaatsen.

Om het samenspel tussen dyneïne en NMII nauwkeurig te onderzoeken en polarisatiereacties te correleren met andere signaleringsgebeurtenissen, hebben we een eerder beschreven TCR-fotoactivatie- en beeldvormingstest gebruikt (18). T-cellen zijn bevestigd aan dekglaasjes bedekt met een fotogekooide versie van hun verwante pMHC. Daaropvolgende bestraling van een micron-groot gebied onder de T-cel met UV-licht induceert gelokaliseerde TCR-activering, waardoor een IS-achtig gebied binnen de T-cel'x02013glass-interface ontstaat. DAG en nPKC's accumuleren doorgaans in dit gebied na � s, met centrosoomheroriëntatie na 10� s later (4). Dit systeem stelt ons in staat om TCR-afhankelijke centrosoomheroriëntatie te activeren en bijbehorende reacties te volgen met een hoge spatiotemporele resolutie.

Onderdrukking van DynHC resulteerde in een klein, maar detecteerbaar defect in de heroriëntatie van het centrosoom naar het met UV-bestraalde gebied (Fig. 2 EEN en B ). T-cellen zonder DynHC vertoonden ook een significante vermindering van de maximale centrosoomsnelheid, wat suggereert dat het vermogen om het centrosoom te verplaatsen verminderd was (Fig. 2C ). Soortgelijke defecten werden waargenomen na behandeling met blebbistatine (Fig. 2 EENC ), consistent met een rol voor NMII in het proces. shRNA-gemedieerde onderdrukking van MyH9, de enige NMII-zware keten die tot expressie wordt gebracht in T-cellen, remde ook de heroriëntatie van het centrosoom, hoewel in mindere mate dan blebbistatine (Fig. S3EEN). Dit weerspiegelde waarschijnlijk suboptimale knockdown door het MyH9-shRNA (Fig. S3 'B). Belangrijk is dat gelijktijdige toediening van DynHC-shRNA en blebbistatine de polarisatiereacties in veel grotere mate remde dan beide behandelingen alleen. Beweging van het centrosoom naar het bestraalde gebied werd in wezen opgeheven (figuur 2) EEN en B ), en de maximale centrosoomsnelheid was meer dan tweevoudig verlaagd ten opzichte van controle-T-cellen (FigC ). Knockdown van DynHC had geen invloed op de TCR-geïnduceerde DAG-productie, noch veranderde blebbistatine de rekrutering van PKCθ, wat aangeeft dat vroege TCR-signalering intact was (Fig. S2 B en C). Deze gegevens geven aan dat dyneïne en NMII samenwerken om het centrosoom stroomafwaarts van gepolariseerde nPKC-activering te verplaatsen.

Dynein en NMII werken samen om het centrosoom te polariseren als reactie op TCR-fotoactivering. Centrosoompolarisatie in T-cellen behandeld met nontargeting (NT) shRNA of shRNA tegen DynHC (DHC), met of zonder 50 μM blebbistatine. (EEN) Representatieve time-lapse montages, met de tijd van UV-straling aangegeven door gele tekst. Gele cirkels duiden het bestraalde gebied in elk experiment aan. De tijd wordt aangegeven als minuten:seconden boven de montages. (Schaalbalken: 5 μm.) (B) Gemiddelde afstand tussen het door licht geactiveerde gebied en het centrosoom in de loop van de tijd, waarbij UV-straling wordt aangegeven door een paarse lijn. (C) Maximale snelheid van centrosoombeweging (N ≥ 34 cellen per monster). Foutbalken duiden SEM aan. P waarden werden berekend met Student t toets. ***P < 0,001 **P < 0,01 *P ≤ 0,05 ns, P > 0,05.

Wederzijdse lokalisatie van NMII en dyneïne tijdens centrosoomheroriëntatie.

Om te onderzoeken hoe NMII centrosoompolarisatie beïnvloedt, hebben we de lokalisatie ervan gevolgd in fotoactiveringsexperimenten met behulp van T-cellen die GFP-gelabelde MyoRLC tot expressie brengen. NMII vormde voorbijgaande, filamenteuze clusters onder het plasmamembraan (Fig. 3EEN ) die kunnen worden gevisualiseerd door totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie. Gelokaliseerde TCR-fotoactivering veranderde dit patroon door de vorming van nieuwe NMII-clusters in het bestraalde gebied te onderdrukken (Fig. 3 EEN en B en Film S1). Dit genereerde asymmetrie in de NMII-verdeling, omdat clusters zich in het membraan achter het centrosoom bleven vormen terwijl het zich heroriënteerde (Fig. 3B ). Nauwe analyse van individuele stappen in centrosoombeweging onthulde een duidelijke correlatie tussen de momentane snelheid van het centrosoom en het MyoRLC-intensiteitsverschil gemeten langs de bewegingsrichting (Fig. 3C ). Hogere snelheden waren dus geassocieerd met hogere accumulatie van MyoRLC achter het centrosoom en grotere uitputting ervoor. Bovendien gaf kruiscorrelatieanalyse aan dat het verlies van NMII uit het bestraalde gebied voorafging aan de heroriëntatie van het centrosoom met 27,0 ± 5,9 s. Daarom vond NMII-remodellering op het juiste moment plaats om de polarisatierespons te beïnvloeden.

Wederzijdse lokalisatie van NMII en dyneïne na TCR-activering. Fotoactiveringsexperimenten werden uitgevoerd met behulp van 5C.C7 T-cellen die MyoRLC-GFP tot expressie brengen samen met ofwel centrin-RFP (EENC) of DynIC-RFP (NS en E). MyoRLC-GFP en DynIC-RFP werden afgebeeld met behulp van TIRF-microscopie en centrin-RFP werd afgebeeld met epifluorescentie. (EEN en NS) Representatieve time-lapse montages, met de tijd van UV-straling aangegeven door gele tekst. Gele cirkels duiden het bestraalde gebied in elk experiment aan. Pijlpunten in EEN tonen MyoRLC-GFP-clusters. De tijd wordt aangegeven als minuten:seconden bovenaan elke afbeelding. (Schaalbalken: 5 μm.) (B en E) Kwantificering van MyoRLC- en DynIC-dynamiek (N ≥ 10 cellen voor elke curve). Uitsluiting van MyoRLC uit het bestraalde gebied (B en E) en rekrutering van DynIC naar het bestraalde gebied (E) worden weergegeven als 㥏/F, wat een genormaliseerde achtergrondgecorrigeerde gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) is. MyoRLC-herschikking werd ook beoordeeld door de MFI-verhouding tussen de achterkant en de voorkant van de T-cel te berekenen (B) (zie ook SI-materialen en -methoden). (C) Correlatie tussen de stapgrootte van het centrosoom en de differentiële accumulatie van MyoRLC rond het centrosoom, berekend op elk tijdstip door de MyoRLC MFI voor het centrosoom af te trekken van de MFI achter het centrosoom. Gegevens worden gesorteerd op basis van de stapgrootte van het centrosoom op hetzelfde tijdstip (N = 10 cellen zie ook SI-materialen en -methoden). Foutbalken geven SEM aan.

Dyneïne wordt gerekruteerd naar het gebied van TCR-stimulatie vóór het centrosoom (4). Deze rekruteringsreactie kan worden gevolgd door TIRF-beeldvorming in levende cellen met behulp van fluorescent gelabelde dyneïne-subeenheden, waaronder de tussenliggende keten (DynIC), de lichte tussenliggende keten (DynLIC) en de TcTex-lichte keten (DynLC). Met behulp van T-cellen die GFP-gelabelde MyoRLC tot expressie brengen samen met RFP-gelabelde DynIC, ontdekten we dat dyneïne en NMII wederzijdse configuraties aannamen tijdens polarisatiereacties (Fig. 3 NS en E en Film S2). Terwijl dyneïne werd gerekruteerd naar de bestraalde zone, clusterde myosine in regio's zonder dyneïne. Deze duidelijke anticorrelatie was zowel voor als na TCR-stimulatie detecteerbaar, wat suggereert dat de wederzijdse lokalisatie van NMII en dyneïne niet wordt vastgesteld door TCR-signalering, maar er alleen door wordt benut (Fig. S4EEN). NMII-uitputting ging 24,8 ଑,5 s vooraf aan de accumulatie van dyneïne in het bestraalde gebied, wat aangeeft dat NMII in deze route vóór dyneïne wordt gereorganiseerd. Samen met de functionele experimenten die hierboven zijn beschreven, ondersteunen deze resultaten een model waarbij dyneïne het microtubuli-netwerk vanaf de voorkant trekt, terwijl NMII het van achteren duwt.

Er is gemeld dat NMII zich ophoopt bij de IS in T-cel'x02013APC-conjugaten (13), wat schijnbaar onverenigbaar is met het idee dat het centrosoompolarisatie van achteren zou kunnen beïnvloeden. Om dit probleem te onderzoeken, hebben we T-cellen afgebeeld die zowel MyoRLC-GFP als centrin-RFP tot expressie brengen samen met APC's (Fig. S4B). Hoewel we af en toe synaptische accumulatie van NMII observeerden, kwam het voor in minder dan de helft van de conjugaten die we onderzochten (5/14) en duurde het in alle gevallen minder dan 3 minuten. Interessant is dat we ook tijdelijke NMII-puncta-vorming aan de zijkanten en achterkant van geactiveerde T-cellen hebben waargenomen tijdens centrosoomheroriëntatie (witte pijlpunten in Fig. S4B). Hoewel we niet met zekerheid kunnen zeggen dat deze puncta identiek zijn aan de NMII-clusters die zijn waargenomen in fotoactiveringsexperimenten, vormden ze zich op de juiste plaats en op het juiste moment om betrokken te zijn bij de polarisatierespons. Daarom is de lokalisatie van NMII in T-cel'x02013APC-conjugaten niet inconsistent met ons voorgestelde model.

NPKC's reguleren de lokalisatie van NMII en dyneïne.

Vervolgens hebben we onderzocht of door TCR geïnduceerde NMII- en dyneïne-remodellering gelokaliseerde DAG-accumulatie vereist. PMA, dat de effecten van DAG-gradiënten maskeert door ongepolariseerde DAG-signalering te induceren, heft zowel NMII- als dyneïne-remodellering op in fotoactiveringsexperimenten (Fig. 4 EEN en B ). Dit impliceerde een cruciale rol voor gelokaliseerde DAG in de regulering van beide motoren.

NMII- en dyneïne-asymmetrie wordt gereguleerd door nPKC-activiteit stroomafwaarts van DAG. (EEN en B) T-cellen (5C.C7) die ofwel MyoRLC-GFP (EEN) of DynIC-GFP (B) werden gefotoactiveerd en afgebeeld in aanwezigheid van 5 ng/ml PMA of voertuigcontrole. Kwantificering van NMII-klaring en rekrutering van dyneïne wordt getoond (N ≥ 8 cellen per monster). (CE) T-cellen (5C.C7) afgeleid van PKCθ −/− (θKO) muizen werden getransduceerd met MyoRLC-GFP samen met de aangegeven shRNA's en gebruikt voor fotoactiveringsexperimenten. (C) Validatie van shRNA-knockdown door immunoblot, waarbij β actine als laadcontrole dient. NT, niet-gerichte shRNA-controle. (NS) Representatieve time-lapse-montages die de MyoRLC-distributie vergelijken in θKO-cellen met of zonder PKCη en PKCε. De tijd van UV-bestraling wordt aangegeven door gele tekst en het bestraalde gebied wordt aangegeven door gele cirkels. (Schaalbalken: 5 μm.) (E) Kwantificering van NMII-klaring uit het bestraalde gebied in θKO-cellen met of zonder PKCη en PKCε (N ≥ 10 cellen voor elk monster). MyoRLC- en DynIC-dynamiek werden gekwantificeerd zoals in Fig. 3, met paarse lijnen die UV-straling aangeven. Foutbalken duiden SEM aan.

DAG bevordert de heroriëntatie van het centrosoom door PKC'x003b5, PKC'x003b7 en PKC'x003b8 naar de IS te rekruteren (5). Om te bepalen of deze kinasen nodig zijn voor de wederzijdse distributie van dyneïne en NMII, hebben we de dynamiek van MyoRLC-GFP en DynLC-GFP in T-cellen gevolgd die verschillende combinaties van nPKC's misten. Gelijktijdige onderdrukking van PKC'x003b7 en PKC'x003b5, die redundant functioneren in deze route (5), had geen invloed op de klaring van NMII uit het bestraalde gebied (Fig. 4C en Afb. S5EEN). Evenzo vertoonden cellen afgeleid van PKC'x003b8 −/−-muizen geen significant defect in NMII-remodellering (Fig. 4 NS en E ). Onderdrukking van PKC'x003b7 en PKC'x003b5 in een PKC'x003b8 knock-out achtergrond deed de NMII-dynamiek echter volledig teniet (Fig. 4 NS en E en Afb. S5B). Dyneïne-accumulatie in het bestraalde gebied werd ook geblokkeerd in cellen zonder PKC'x003b7, PKC'x003b5 en PKC'x003b8 (Fig. S5 C en NS). Deze resultaten gaven aan dat nPKC-activiteit essentieel is voor de herlokalisatie van zowel NMII als dyneïne. In overeenstemming met deze interpretatie onderdrukten relatief lage concentraties (500 nM) van de PKC-remmer G� met brede specificiteit de TCR-geïnduceerde NMII-depletie en dyneïne-accumulatie (Fig. S5 E en F). Alles bij elkaar genomen tonen deze resultaten aan dat PKC'x003b7, PKC'x003b5 en PKC'x003b8 redundant functioneren om NMII en dyneïne te reguleren tijdens centrosoompolarisatie.

Om te beoordelen of PKC-activiteit voldoende is om NMII-remodellering te induceren, hebben we TIRF-microscopie gebruikt om de effecten van acute PKC-stimulatie op de lokalisatie van MyoRLC te volgen. PMA, dat wereldwijd PKC's activeert, induceerde binnen enkele seconden de dramatische verspreiding van corticale NMII-vezels (Fig. 5EEN en Film S3). We hebben deze reorganisatie gekwantificeerd door de SD van MyoRLC-fluorescentie in elke cel te berekenen, die de mate van clustering weerspiegelt (Fig. 5B ). Acute remming van PKC-activiteit met G� had het tegenovergestelde effect, waardoor de vorming van NMII-clusters onder het membraan werd versterkt (Fig. 5 EEN en C en Film S4). Gelijktijdige toevoeging van zowel PMA als G� bevorderde ook clustering, wat aangeeft dat clusteronderdrukking door PMA PKC-activiteit vereist (Fig. 5 EEN en NS en Film S5). Deze resultaten suggereren sterk dat PKC-gemedieerde fosforylering van NMII de dissociatie van membraancomplexen bevordert. Interessant is dat acute toevoeging van PMA of G� geen effect had op de corticale distributie van dyneïne (Fig. S6), wat impliceert dat globale stimulatie van PKC's onvoldoende is om rekrutering van dyneïne te induceren. Hoewel PKC-activering voldoende is om NMII-clustering te onderdrukken, is de regulatie van dyneïne waarschijnlijk complexer.

Acute activering of remming van PKC-activiteit induceert NMII-remodellering. T-cellen (5C.C7) die MyoRLC-RFP tot expressie brengen, werden afgebeeld in TIRF en behandeld met 5 ng/mL PMA of 500 nM G� zoals aangegeven tijdens time-lapse-acquisitie. (EEN) Representatieve time-lapse montages, met toevoeging van reagentia aangegeven door de rode lijn. (Schaalbalken: 5 μm.) (BNS) Clustering van MyoRLC op het membraan werd gekwantificeerd door berekening van de SD van de fluorescentiesignalen voor elke cel (N = 10 cellen voor elke curve zie ook Materialen en methodes). De tijd van toevoeging van reagens wordt aangegeven door de opening in elke curve. Foutbalken duiden SEM aan.

PKC-fosforyleringslocaties binnen MyoRLC zijn vereist voor NMII-onderdrukking.

Van PKC-gemedieerde fosforylering van MyoRLC op Ser1 en Ser2 is gemeld dat het de NMII-functie remt (19 �). Om het belang van deze fosforyleringsgebeurtenissen voor centrosoompolarisatie te onderzoeken, analyseerden we de lokalisatie van een MyoRLC-construct [MyoRLC(S1AS2A)], waarvan de N-terminale fosforyleringsplaatsen waren gemuteerd naar Ala. MyoRLC(S1AS2A) opgehoopt in clusters onder het plasma membraan die morfologisch vergelijkbaar waren met structuren die wildtype MyoRLC bevatten (Fig. 6'EEN ). Terwijl fotoactivatie de clustering van wildtype MyoRLC in het bestraalde gebied consequent onderdrukte, was de uitputting van MyoRLC (S1AS2A) echter aanzienlijk verminderd (Fig. 6 EEN en B ).

nPKC-rekrutering en MyoRLC-fosforylering is geassocieerd met NMII-remodellering. (EEN en B) TCR-fotoactiveringsexperimenten werden uitgevoerd met behulp van 5C.C7 T-cellen die ofwel wildtype MyoRLC-GFP of MyoRLC(S1AS2A)-GFP tot expressie brengen. (EEN) Representatieve time-lapse montages, met de tijd van UV-straling aangegeven door gele tekst. Gele cirkels geven het bestraalde gebied aan. (B) Kwantificering van MyoRLC-klaring uit het bestraalde gebied (N ≥ 10 cellen voor elk monster). (CF) TCR-fotoactiveringsexperimenten werden uitgevoerd met behulp van 5C.C7 T-cellen die MyoRLC-GFP tot expressie brengen samen met ofwel PKCη-RFP (C en NS) of PKCθ-RFP (E en F). (C en E) Representatieve time-lapse montages, met de tijd van UV-straling aangegeven door gele tekst. Gele cirkels geven het bestraalde gebied aan. Alle sondes werden afgebeeld in TIRF. (NS en F) Kwantificering van MyoRLC-klaring en nPKC-rekrutering in het bestraalde gebied (N = 10 cellen voor elk monster). Analyse werd uitgevoerd zoals in Fig. 3, met paarse lijnen die UV-bestraling aangeven. Foutbalken duiden SEM aan. (Alle schaalbalken: 5 μm.)

Om te bepalen of nPKC-lokalisatie consistent was met een rol bij NMII-remodellering, hebben we fotoactiveringsexperimenten uitgevoerd met behulp van T-cellen die GFP-gelabelde MyoRLC tot expressie brengen samen met RFP-gelabelde PKC'x003b8 of RFP-gelabelde PKC'x003b7. In overeenstemming met eerder werk (5), induceerde TCR-fotoactivatie de robuuste accumulatie van zowel PKC'x003b7 als PKC'x003b8 in het bestraalde gebied (Fig. 6 CF en films S6 en S7). De rekrutering van PKC'x003b7 en PKC'x003b8 was op alle tijdstippen duidelijk antigecorreleerd met NMII (Fig. S4EEN), consistent met het idee dat de nPKC's NMII-clustering onderdrukken. We onderzochten ook de relatie tussen PKC-activiteit en NMII met behulp van een fluorescent gelabelde vorm van Marcksl1, een membraan-geassocieerd eiwit dat dissocieert wanneer het wordt gefosforyleerd door PKC's (5, 23). Zoals verwacht induceerde fotoactivering van T-cellen die GFP-gelabelde Marcksl1 tot expressie brengen samen met RFP-gelabelde MyoRLC de klaring van beide constructen uit het bestraalde gebied (Fig. S7 EEN en B). Uitputting van Marcksl1 ging vooraf aan verlies van NMII met 𢏈 s (Fig. S7C). Dus TCR-geïnduceerde PKC-activering vond plaats op het juiste moment en op de juiste plaats om NMII-remodellering te bemiddelen.

Van PKC's is ook bekend dat ze het actine-cytoskelet reguleren (24). Het bleef dus mogelijk dat de NMII-dynamiek die we waarnamen secundair was aan hermodellering van corticale actine. Om deze hypothese te onderzoeken, hebben we T-cellen afgebeeld die GFP-gelabelde MyoRLC tot expressie brengen samen met RFP-gelabelde Lifeact, die specifiek bindt aan filamenteuze (F)-actine (25). TIRF-microscopie onthulde een vlekkerige verdeling van F-actine onder het plasmamembraan die verschoof tijdens cycli van cellulaire expansie en contractie (Fig. S8EEN). Hoewel deze F-actine gedeeltelijk colokaliseerde met MyoRLC, was de vorming van NMII-clusters niet geassocieerd met F-actine-verrijking in dezelfde zones. Interessant is dat fotoactivering van de TCR de uitputting van F-actine uit het bestraalde gebied induceerde. Deze uitputtingsreactie vond echter plaats 24,9 ± 10,0 s na verlies van NMII (Fig. S8 B en C), wat aangeeft dat het onwaarschijnlijk is dat NMII-remodellering in deze context door actine wordt aangedreven.

We onderzochten ook de relatie tussen NMII en perifere microtubuli door T-cellen af ​​​​te beelden die MyoRLC-RFP en GFP-tubuline tot expressie brengen. TIRF-microscopie onthulde dat microtubuli dicht bij het plasmamembraan zeer dynamisch waren en zowel hun lengte als oriëntatie veranderden tijdens polarisatiereacties. Er was echter geen duidelijke correlatie tussen deze dynamiek en NMII-remodellering (Fig. S8NS). Verder werd NMII-clustering aan de achterkant van de cel niet beïnvloed door depolymerisatie van microtubuli met nocodazol of stabilisatie met taxol (Fig. S8 E en F). Daarom vindt NMII-reorganisatie onafhankelijk van microtubuli plaats.

Rho-kinase is vereist voor NMII-clustering.

Rho-kinase (ook wel ROCK genoemd) activeert NMII door MyoRLC te fosforyleren op Thr18 en Ser19 (12, 26). Om te testen of ROCK NMII-lokalisatie in ons systeem reguleert, behandelden we T-cellen die GFP-gelabelde MyoRLC tot expressie brengen met Y27632, een ROCK-remmer. Y27632 induceerde de verspreiding van corticale NMII-clusters in minder dan een minuut, vergelijkbaar met de effecten van PMA (Fig. 7 EEN en B en Film S8). Deze dispersie werd niet omgekeerd door G�, wat aangeeft dat ROCK nodig is om NMII op het plasmamembraan te stabiliseren, zelfs in de afwezigheid van PKC-activiteit (Fig. 7 EEN en B ). We hebben ook onderzocht of de ROCK-fosforyleringsplaatsen in MyoRLC, Thr18 en Ser19 nodig waren voor NMII-remodellering in fotoactiveringsexperimenten. Mutatie van beide residuen naar Ala verminderde de MyoRLC-clustering op het membraan aanzienlijk (Fig. 7 .).C ), en fotoactivering van de TCR versterkte deze clustering niet of induceerde asymmetrie in de NMII-verdeling (Fig. 7 C en NS ). Samen gaven deze gegevens aan dat ROCK-gemedieerde fosforylering NMII-clustering stimuleert tijdens polarisatiereacties. In overeenstemming met deze interpretatie vonden we dat Y27632 de heroriëntatie van het centrosoom vertraagde en ook de maximale snelheid van het centrosoom verminderde (Fig. 7 E en F ). We concluderen dat ROCK en de nPKC's polariserende NMII-asymmetrie in T-cellen tot stand brengen door tegengestelde fosforregulatie van MyoRLC.

ROCK is vereist voor NMII-clustering achter het centrosoom. (EEN en B) T-cellen (5C.C7) die MyoRLC-RFP tot expressie brengen, werden afgebeeld in TIRF en behandeld met 50 μM Y27632 en 500 nM G� zoals aangegeven tijdens time-lapse-acquisitie. (EEN) Representatieve time-lapse montages, met toevoeging van reagentia aangegeven door de rode lijn. (B) Kwantificering van MyoRLC-clustering zoals beschreven in Fig. 5 (N = 8 cellen per curve). (C en NS) Fotoactiveringsexperimenten werden uitgevoerd met behulp van 5C.C7 T-cellen die ofwel wildtype MyoRLC-GFP of MyoRLC(T18AS19A)-GFP tot expressie brengen. (C) Representatieve time-lapse montages, met de tijd van UV-straling aangegeven door gele tekst. Gele cirkels geven het bestraalde gebied aan. (NS) MyoRLC-asymmetrie werd gekwantificeerd zoals beschreven in Fig. 3 (N ≥ 10 cellen per monster). (E en F) Centrosoompolarisatie in aanwezigheid van 50 &#cM Y27632 of vehikelcontrole werd beoordeeld zoals beschreven in Fig. 2 . (Alle schaalbalken: 5 μm.) Paarse lijnen in grafieken geven UV-straling aan en foutbalken geven SEM aan. P waarden werden berekend met Student t toets. ***P < 0,001.


Verander geschiedenis

Williams, B.R. & Amon, A. Aneuploidy: de fatale fout van kanker? Kanker onderzoek. 69, 5289–5291 (2009).

Lengauer, C., Kinzler, K.W. & Vogelstein, B. Genetische instabiliteiten bij menselijke kankers. Natuur 396, 643–649 (1998).

Strebhardt, K. Veelzijdige polo-achtige kinasen: medicijndoelen en antitargets voor kankertherapie. nat. Rev. Drugsontdek. 9, 643–660 (2010).

Petronczki, M., Lenart, P. & Peters, J. M. Polo over de opkomst van mitotische toegang tot cytokinese met Plk1. ontwikkelaar Cel 14, 646–659 (2008).

Sumara, I. et al. Rollen van polo-achtig kinase 1 bij de assemblage van functionele mitotische spindels. Curr. Biol. 14, 1712–1722 (2004).

Lenart, P. et al. De kleine-molecuulremmer BI 2536 onthult nieuwe inzichten in mitotische rollen van polo-achtig kinase 1. Curr. Biol. 17, 304–315 (2007).

Elowe, S., Hummer, S., Uldschmid, A., Li, X. & Nigg, E. A. Spanningsgevoelige Plk1-fosforylering op BubR1 reguleert de stabiliteit van kinetochoor-microtubuli-interacties. Genen Dev. 21, 2205–2219 (2007).

Maia, A.R. et al. Cdk1 en Plk1 bemiddelen een CLASP2-fosfo-switch die kinetochoor-microtubuli-aanhechtingen stabiliseert. J. Cell Biol. 199, 285–301 (2012).

Liu, D., Davydenko, O. & Lampson, M. A. Polo-achtig kinase-1 reguleert de kinetochoor-microtubuli-dynamiek en spilcontrolepuntuitschakeling. J. Cell Biol. 198, 491–499 (2012).

Lee, K.S. et al. Mechanismen van lokalisatie van polo-achtig kinase 1 (Plk1) van zoogdieren: zelf- versus niet-zelfaanzuigend. Celcyclus 7, 141–145 (2008).

Elia, A.E. et al. De moleculaire basis voor fosfoafhankelijke substraattargeting en regulatie van Plks door het Polo-box-domein. Cel 115, 83–95 (2003).

Cheng, K.Y., Lowe, E.D., Sinclair, J., Nigg, E.A. & Johnson, L.N. De kristalstructuur van het menselijke polo-achtige kinase-1 polobox-domein en zijn fosfo-peptidecomplex. EMBO J. 22, 5757–5768 (2003).

Hanisch, A., Wehner, A., Nigg, E.A. & Sillje, H.H. Verschillende Plk1-functies vertonen verschillende afhankelijkheden van door Polo-Box-domein gemedieerde targeting. Mol. Biol. Cel 17, 448–459 (2006).

Nigg, E. A. Mitotische kinasen als regulatoren van celdeling en zijn controlepunten. nat. ds. Mol. Cel Biol. 2, 21–32 (2001).

Mateo, F., Vidal-Laliena, M., Pujol, M.J. & Bachs, O. Acetylering van cycline A: een nieuw regelmechanisme voor de celcyclus. Biochem. Soc. Trans. 38, 83–86 (2010).

Hershko, A. Het ubiquitinesysteem voor eiwitafbraak en enkele van zijn rollen bij de controle van de celdelingscyclus. Celdood verschilt. 12, 1191–1197 (2005).

Li, W. & Ye, Y. Polyubiquitineketens: functies, structuren en mechanismen. Cel. Mol. Levenswetenschap. 65, 2397–2406 (2008).

Deshaies, R.J. SCF en op cullin/ring H2 gebaseerde ubiquitine-ligasen. Ann. Eerwaarde Cell Dev. Biol. 15, 435–467 (1999).

Petroski, M. D. & Deshaies, R. J. Functie en regulatie van cullin-RING ubiquitine-ligasen. nat. ds. Mol. Cel Biol. 6, 9–20 (2005).

Sumara, I., Maerki, S. & Peter, M. E3 ubiquitine-ligasen en mitose: de complexiteit omarmen. Trends Cell Biol. 18, 84–94 (2008).

Sumara, I. et al. Een op Cul3 gebaseerde E3-ligase verwijdert Aurora B van mitotische chromosomen, waardoor mitotische progressie en voltooiing van cytokinese in menselijke cellen wordt gereguleerd. ontwikkelaar Cel 12, 887–900 (2007).

Maerki, S. et al. De Cul3-KLHL21 E3 ubiquitine-ligase richt zich op aurora B tot microtubuli in de middenzone in anafase en is vereist voor cytokinese. J. Cell Biol. 187, 791–800 (2009).

Li, Y. & Benezra, R. Identificatie van een menselijk mitotisch controlepuntgen: hsMAD2. Wetenschap 274, 246–248 (1996).

Sumara, I. & Peter, M. Een op Cul3 gebaseerde E3-ligase reguleert de mitose en is vereist om het controlepunt van de spilassemblage in menselijke cellen te behouden. Celcyclus 6, 3004–3010 (2007).

Matsumura, S., Toyoshima, F. & Nishida, E. Polo-achtig kinase 1 vergemakkelijkt chromosoomuitlijning tijdens prometafase via BubR1. J. Biol. Chem. 282, 15217–15227 (2007).

Joseph, J., Liu, S.T., Jablonski, S.A., Yen, T.J. & Dasso, M. Het RanGAP1-RanBP2-complex is essentieel voor microtubule-kinetochoor-interacties in vivo. Curr. Biol. 14, 611–617 (2004).

Kim, W. et al. Systematische en kwantitatieve beoordeling van het ubiquitine-gemodificeerde proteoom. Mol. Cel 44, 325–340 (2011).

Wagner, S.A. et al. Een proteoom-breed, kwantitatief onderzoek van in vivo ubiquitylation-sites onthullen wijdverbreide regulerende rollen. Mol. Cel Proteomics 10, 013284 (2011).

Park, J.E. et al. Polo-box-domein: een veelzijdige bemiddelaar van de polo-achtige kinasefunctie. Cel Mol. Levenswetenschap. 67, 1957–1970 (2010).

Moghe, S. et al. De CUL3-KLHL18-ligase reguleert mitotische binnenkomst en alomtegenwoordig Aurora-A. Biol. Open 1, 82–91 (2012).

Pintard, L., Willems, A. & Peter, M. Op Cullin gebaseerde ubiquitine-ligasen: Cul3-BTB-complexen voegen zich bij de familie. EMBO J. 23, 1681–1687 (2004).

Villeneuve, N.F., Lau, A. & Zhang, D.D. Regulering van de Nrf2-Keap1-antioxidantrespons door het ubiquitine-proteasoomsysteem: een inzicht in ubiquitine-ligasen van cullin-ring. antioxidant. Redox. Signaal 13, 1699–1712 (2010).

Huotari, J. et al. Cullin-3 reguleert de late endosoomrijping. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 109, 823–828 (2012).

Boyden, L.M. et al. Mutaties in kelch-achtige 3 en cullin 3 veroorzaken hypertensie en elektrolytafwijkingen. Natuur 482, 98–102 (2012).

Yuan, W.C. et al. Een Cullin3-KLHL20 Ubiquitine-ligase-afhankelijke route richt zich op PML om HIF-1-signalering en de progressie van prostaatkanker te versterken. kanker cel 20, 214–228 (2011).

Hernandez-Munoz, I. et al. Stabiele inactivatie van X-chromosoom omvat het PRC1 Polycomb-complex en vereist histon MACROH2A1 en de CULLIN3/SPOP ubiquitine E3-ligase. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 102, 7635–7640 (2005).

Jin, L. et al. Ubiquitine-afhankelijke regulatie van COPII-vachtgrootte en -functie. Natuur 482, 495–500 (2012).

Howell, B.J. et al. Cytoplasmatisch dyneïne/dynactine stuurt kinetochoor-eiwittransport naar de spilpolen en speelt een rol bij de inactivatie van mitotische spilcontrolepunten. J. Cell Biol. 155, 1159–1172 (2001).

Varma, D., Monzo, P., Stehman, S.A. & Vallee, R.B. Directe rol van de dyneïnemotor in stabiele kinetochoor-microtubuli-bevestiging, oriëntatie en uitlijning. J. Cell Biol. 182, 1045–1054 (2008).

Yang, Z., Tulu, U. S., Wadsworth, P. & Rieder, C. L. Kinetochore dyneïne is vereist voor chromosoombeweging en congres onafhankelijk van het spilcontrolepunt. Curr. Biol. 17, 973–980 (2007).

Bennett, E.J., Rush, J., Gygi, S.P. & Harper, J.W. Dynamica van cullin-RING ubiquitine-ligasenetwerk onthuld door systematische kwantitatieve proteomics. Cel 143, 951–965 (2010).

Musacchio, A. & Salmon, E.D. Het controlepunt van de spindelassemblage in ruimte en tijd. nat. ds. Mol. Cel Biol. 8, 379–393 (2007).

Yun, S.M. et al. Structurele en functionele analyses van minimale fosfopeptiden gericht op het polo-box-domein van polo-achtig kinase 1. nat. structuur. Mol. Biol. 16, 876–882 (2009).

Steigemann, P. et al. Aurora B-gemedieerd abscissiecontrolepunt beschermt tegen tetraploïdisatie. Cel 136, 473–484 (2009).

Belov, G.A. et al. Bidirectionele toename van de permeabiliteit van de nucleaire envelop na poliovirusinfectie en bijbehorende veranderingen van nucleaire poriën. J. Virol. 78, 10166–10177 (2004).

Pedrioli, P.G. et al. Een gemeenschappelijke open weergave van massaspectrometriegegevens en de toepassing ervan op proteomics-onderzoek. nat. Biotechnologie. 22, 1459–1466 (2004).

MacLean, B., Eng, J.K., Beavis, R.C. & McIntosh, M. Algemeen raamwerk voor het ontwikkelen en evalueren van algoritmen voor het scoren van databases met behulp van de TANDEM-zoekmachine. Bio-informatica 22, 2830–2832 (2006).


Wat maakt een lymfocyt tot een B-cel?

De ontwikkeling van B-cellen bij muizen 24 en mensen 25 is uitgebreid bestudeerd en de functionele herschikking van de Ig-loci is een sine qua non. Dit gebeurt via een foutgevoelig proces waarbij de combinatorische herschikking van de V-, D- en J-gensegmenten in de H-ketenlocus en de V- en J-gensegmenten in de L-ketenloci betrokken zijn. 26 Susumu Tonegawa kreeg voor deze ontdekking in 1987 de Nobelprijs voor Fysiologie of Geneeskunde. Bij muizen en mensen komt dit voornamelijk voor in de foetale lever en volwassen beenmerg, wat culmineert in de ontwikkeling van een divers repertoire van functionele VDJH en VJL herschikkingen die coderen voor de B-celreceptor (BCR). Bij andere soorten (bijv. kippen en konijnen) vindt de ontwikkeling van het pre-immune Ig-repertoire echter voornamelijk plaats in GALT, en diversificatie van het repertoire maakt gebruik van het mechanisme van genconversie. 27,28 De ontdekking van de recombinatie activerende genen 1/2 (RAG-1/2) eind jaren tachtig door David Baltimore en collega's gaven de mechanistische verklaring voor de eerste stappen van DNA-strengbreuk in zowel Ig- als T-celreceptorherschikking (Schatz et al 29 en Oettinger et al 30).

Vroege B-celontwikkeling wordt gekenmerkt door de geordende herschikking van Ig H- en L-ketenloci, en Ig-eiwitten spelen zelf een actieve rol bij het reguleren van B-celontwikkeling. 31 Cruciaal om te begrijpen hoe de vroege ontwikkeling van B-cellen wordt gereguleerd, was de ontdekking van surrogaat-L-ketens (SLC's).Oorspronkelijk geïdentificeerd in muizen-B-lijncellen, 32 is de SLC een heterodimeer bestaande uit 2 verschillende eiwitten die oorspronkelijk werden aangeduid als λ5 en VpreB. Deze 2 eiwitten paren met de μH-keten om de zogenaamde pre-BCR te vormen in pre-B-cellen van muis en mens. 33 Pre-B-cellen ontstaan ​​uit voorlopercellen (pro-B) die noch pre-BCR noch oppervlakte-Ig tot expressie brengen (Figuur 1). Of pre-BCR-interacties met ligand(en) kunnen dienen als een proliferatieve stimulus en daardoor pre-B-cellen uitbreiden met functionele μH-ketenherrangschikkingen blijft onbekend. Hoewel potentiële pre-BCR-liganden zijn beschreven, suggereert de recente kristalstructuuroplossing van een oplosbare vorm van de menselijke pre-BCR dat ligandonafhankelijke oligomerisatie een waarschijnlijk mechanisme is van pre-BCR-gemedieerde signalering. 36 Vervolgens is BCR-expressie vereist voor de ontwikkeling en overleving van B-cellen in de periferie. 37

Door antigeen geïnduceerde B-celactivering en differentiatie in secundaire lymfoïde weefsels worden gemedieerd door dynamische veranderingen in genexpressie die aanleiding geven tot de germinal center (GC)-reactie (zie de sectie over B-celrijping). De GC-reactie wordt gekenmerkt door klonale expansie, klasse-switch-recombinatie (CSR) op de IgH-locus, somatische hypermutatie (SHM) van VH genen, en selectie op verhoogde affiniteit van een BCR voor zijn unieke antigene epitoop door affiniteitsrijping. MVO, ook wel isotype-switching genoemd, werd voor het eerst aangetoond bij de kip. 38 Tien jaar na de ontdekking van RAG1/2 hebben Honjo en zijn collega's (Muramatsu et al 39) aangetoond dat CSR en SHM worden gemedieerd door een enzym dat wordt aangeduid als activatie-geïnduceerd cytidinedeaminase (AID). Naar verwachting wordt B-cel AID-expressie geïnduceerd in GC's waar CSR en SHM voorkomen. Er zijn 2 theorieën over hoe AID werkt om diversificatie van antilichamen te bevorderen. Eén suggereert dat AID een "RNA-bewerkingsfunctie" uitvoert - niet per se de bron van hypermutatoractiviteit, maar samen te werken met een ander eiwit om SHM te mediëren. 40 Een meer heersende opvatting stelt dat AID directer deelneemt aan het bewerkstelligen van mutatie van IgH-genen op DNA-niveau. 41 Helaas kan het genereren van een divers beschermend Ig-repertoire schadelijk zijn omdat AID kan samenwerken met andere enzymen om chromosomale translocaties te genereren waarbij c-myc en de IgH-locus in sommige B-cellymfomen. 42

De ontwikkeling van lymfocyten vereist de gezamenlijke actie van een netwerk van cytokinen en transcriptiefactoren die genexpressie positief en negatief reguleren. Uit merg-stromacellen afgeleid interleukine-7 (IL-7) is een niet-redundante cytokine voor de ontwikkeling van muizen-B-cellen die de herschikking van V naar DJ bevordert en overlevings-/proliferatiesignalen doorgeeft. 43 FLT3-ligand en TSLP spelen een belangrijke rol bij de ontwikkeling van foetale B-cellen. 24 De cytokine(n) die de ontwikkeling van menselijke B-cellen reguleren, zijn niet zo goed begrepen. 25 De aanwezigheid van normale aantallen circulerende B-cellen bij patiënten met primaire immuundeficiëntie met mutaties in genen die coderen voor IL-7R, stelt echter dat de ontwikkeling van B-cellen in deze levensfase geen IL-7R-signalering vereist. 44 Een informatief experiment van de natuur zou een patiënt zijn met een nulmutatie in het IL-7-gen, maar een dergelijke patiënt is nog niet beschreven. De cytokine (of cytokinen) die de ontwikkeling van B-cellen in het merg in alle stadia van het menselijk leven bevorderen, is nog onbekend.

Ten minste 10 verschillende transcriptiefactoren reguleren de vroege stadia van B-celontwikkeling, waarbij E2A, EBF en Pax5 bijzonder belangrijk zijn bij het bevorderen van B-afstammingsverplichting en differentiatie. 45 Pax5, oorspronkelijk gekenmerkt door zijn vermogen om te binden aan promotorsequenties in Ig-loci, is mogelijk de meest multifunctionele transcriptiefactor voor B-cellen. 46 Pax5-deficiënte muizen hebben een stop in de ontwikkeling van B-cellen bij de overgang van DJ- naar VDJ-herschikking. Een belangrijke onthulling kwam van de ontdekking dat Pax5 genen kan activeren die nodig zijn voor de ontwikkeling van B-cellen en genen kan onderdrukken die een cruciale rol spelen bij de ontwikkeling van niet-B-cellen. Pax5-deficiënte pro-B-cellen hebben dus het vermogen om het lot van niet-B-lijn aan te passen en zich te ontwikkelen tot andere hematopoëtische lijnen. 47 Pax5 reguleert ook de expressie van ten minste 170 genen, waarvan een aanzienlijk aantal belangrijk is voor B-celsignalering, adhesie en migratie van rijpe B-cellen. 46 Voorwaardelijk Pax5 deletie in rijpe muizen-B-cellen kan onder bepaalde omstandigheden leiden tot dedifferentiatie tot een niet-gecommitteerde hematopoëtische voorloper en daaropvolgende differentiatie tot T-lijncellen. 48 Het is opmerkelijk dat het elimineren van de functie van deze enkele transcriptiefactor kan leiden tot zo'n ingrijpende verandering in het ontwikkelingslot. Een voor de hand liggende vraag is of een dergelijke dedifferentiatie optreedt bij normale muizen (of gezonde mensen)? Wijzigingen in de Pax5 locus kan ook ernstige gevolgen hebben muizen zonder Pax5 ontwikkelen vaak hoogwaardige lymfomen. 48 Bovendien herbergt tot 30% van de nieuw gediagnosticeerde gevallen van B-lijn bij kinderen ALL somatische PAX5 mutaties, die voornamelijk monoallele deleties vertegenwoordigen. 49 Dit biedt een nieuw perspectief op de bekende stopzetting van de rijping in de vroege ontwikkeling van B-cellen die in wezen alle ALL-gevallen in de kindertijd kenmerkt.


Resultaten

Membraanvereniging van Tiam1 is vereist voor membraanvervorming

We hebben eerder aangetoond dat Tiam1 (FL1591) van volledige lengte of een groot COOH-terminaal fragment van het Tiam1-eiwit (C1199) Rac1-afhankelijke inductie van membraanrimpeling in NIH3T3-fibroblastcellen veroorzaakt (Michiels et al., 1995). Gevestigde NIH3T3-cellijnen die een van deze eiwitten tot expressie brengen, zijn plat en epitheelachtig en bevatten veel membraanruches (Fig. 1,B), een fenotype dat ook wordt geïnduceerd door transfectie of micro-injectie van constitutief geactiveerde (V12)Rac1 (Ridley et al., 1992 Michiels et al., 1995 Van Leeuwen et al., 1995). Daarentegen induceerde een kleiner COOH-terminaal deel van het Tiam1-eiwit (C682), dat alleen het DH-domein en het aangrenzende PH-domein bevat, dit fenotype niet (Fig. 1,C). Zoals aangetoond door confocale laserscanning-immunofluorescentiemicroscopie, was het afgeknotte grote C1199 Tiam1-eiwit aanwezig in het cytoplasma en gecolokaliseerd met F-actine in membraanruches (Fig. 1,B). Daarentegen leek het korte C682 Tiam1-eiwit beperkt te zijn tot het cytoplasma (Fig. 1,C). Western blot-analyses (zie Fig. 4, lanen) 1–3) gaf aan dat beide eiwitten intact waren en gelijkelijk tot expressie werden gebracht. Dit suggereerde dat het verschil in fenotypes dat door deze afgeknotte eiwitten wordt geïnduceerd waarschijnlijk wordt veroorzaakt door een andere intracellulaire lokalisatie en niet door verschillen in stabiliteit. Immuno-elektronenmicroscopie (immuno-EM) bevestigde inderdaad dat het C1199 Tiam1-eiwit zowel in het cytoplasma als in het celmembraan en vooral in de membraanruches aanwezig is, terwijl het C682 Tiam1-eiwit bijna uitsluitend in het cytoplasma is gelokaliseerd (Fig. 2) . We veronderstelden daarom dat membraanlokalisatie van Tiam1 vereist is voor morfologische transformatie van NIH3T3-cellen, inclusief de vorming van membraanruches.

De NH2-terminal PH-domein is essentieel voor membraanlokalisatie van Tiam1

Om te onderzoeken welke van de geconserveerde domeinen in Tiam1 de intracellulaire lokalisatie bepaalt, werden kleine deleties gemaakt in elk van deze domeinen binnen het C1199-construct (zie Fig. 3 en Materialen en Methoden). Deze mutante eiwitten werden tijdelijk tot expressie gebracht in COS-7-cellen om hun intracellulaire lokalisatie en het vermogen om membraanrimpeling te induceren te analyseren. Transfectie van deze mutante Tiam1-constructen in NIH3T3-cellen resulteerde in dezelfde fenotypische veranderingen (niet getoond). Hoewel Tiam1 endogeen tot expressie wordt gebracht in COS-7-cellen en NIH3T3-cellen, zijn de niveaus te laag om zichtbaar te maken met immunocytochemie of Western-blotting. Als fenotypische veranderingen werden geïnduceerd door de transfectie van Tiam1-mutanten, werden ze gevonden in >80% van de getransfecteerde cellen.

Zoals getoond in Fig. 3,B, was het C1199 Tiam1-eiwit met een kleine interne deletie in het geconserveerde COOH-terminale deel van het DH-aangrenzende PH-domein (C1199-ΔPHc) nog steeds in staat om membraanrimpeling te induceren. Dit was een onverwachte bevinding aangezien deleties in het DH-aangrenzende PH-domein van andere GDS-eiwitten hun goede werking verstoorden (Hart et al., 1994 Whitehead et al., 1995B), en mutaties in dit gebied van het PH-domein van β-Ark maakten een einde aan interacties met zowel Gβγ eiwitten en fosfolipiden (Touhara et al., 1995). Daarentegen induceerde een C1199 Tiam1-eiwit met een deletie in het DH-domein (C1199ΔDH) geen membraanrimpeling (Fig. 3,C), wat een eerder voorgestelde katalytische functie voor het DH-domein bevestigt (Hart et al., 1994). Deletie van het grootste deel van het DHR-gebied (C1199-ΔDHR) had geen invloed op de rimpelvorming (Fig. 3,NS), wat aangeeft dat het DHR-domein niet vereist is voor de inductie van membraanruches. Echter, een kleine schrapping in de NH2-terminaal PH-domein (C1199-ΔPHn), vergelijkbaar met de deletie gemaakt in het COOH-terminale PH-domein, maakte volledig een einde aan membraanrimpeling (Fig. 3,E). Western-blot-analyses toonden aan dat alle mutante eiwitten de voorspelde grootte hadden en op vergelijkbare niveaus tot expressie werden gebracht (zie Fig. 4, banen 4–9), hoewel iets minder dan het C1199 Tiam1-eiwit. Dit sluit de mogelijkheid uit dat deze resultaten te wijten waren aan grote verschillen in eiwitstabiliteit. We concluderen dat zowel het katalytische DH-domein als het NH2-terminaal PH-domein zijn essentieel voor door Tiam1 geïnduceerde membraanrimpeling.

Immuno-EM-analyses van getransfecteerde COS-cellen toonden aan dat alle mutante eiwitten gelijkelijk aanwezig waren in het cytoplasma en op het plasmamembraan (Fig. 5), behalve mutant C1199 Tiam1, die een deletie in het NH bevat.2terminal PH-domein (C1199-ΔPHn). Dit eiwit was bijna uitsluitend gelokaliseerd in het cytoplasma (Fig. 5,NS), vergelijkbaar met het C682 Tiam1-eiwit (Fig. 2,B). Het C1199-ΔDH Tiam1-eiwit, dat een deletie in het katalytische DH-domein draagt ​​en geen membraanrimpeling induceert, was nog steeds in staat om te associëren met het plasmamembraan (Fig. 5 B). Dit toont duidelijk aan dat membraanlokalisatie van Tiam1 geen gevolg is van de inductie van membraanruffling. Daarom kan worden geconcludeerd dat de NH2-terminaal PH-domein essentieel is voor de membraanlokalisatie van C1199 Tiam1 en dat deze membraanlokalisatie nodig is voor de vorming van membraanruches.

De NH2-terminal PH-domein van Tiam1 kan functioneel worden vervangen door het c-Src-membraanlokalisatiedomein, maar niet door andere PH-domeinen

Om te bepalen of membraanlokalisatie de enige functie is van de NH2-terminaal PH-domein, we hebben de NH . gefuseerd2terminale 20 aminozuren van c-Src, die de myristoyleringsplaats en een basisgebied bevatten, voor een C580 Tiam1-eiwit, resulterend in MS-C580 Tiam1 (zie Materialen en Methoden). C580 Tiam1 omvat de COOH-terminale 580 aminozuren en codeert voor het DH-domein en het aangrenzende PH-domein (Fig. 6,EEN). Vergelijkbaar met het C682 Tiam1-eiwit (zie Fig. 2,B), induceerde het C580 Tiam1-eiwit geen membraanrimpeling en was niet gelokaliseerd op het plasmamembraan (Fig. 6,EEN en 7,EEN). Daarentegen induceerde het MS-C580 Tiam1-eiwit rimpelvorming in zowel NIH3T3-cellen als COS-7-cellen (Fig. 6,B), zij het minder uitgebreid dan C1199 Tiam1 (Fig. 3,EEN). Er werden geen verschillen waargenomen in de expressieniveaus van deze eiwitten (Fig. 4, lanen). 10–12). Immuno-EM toonde aan dat MS -C580 Tiam1 in staat was om te associëren met het plasmamembraan (Fig. 7,B), hoewel dit eiwit meer naar binnen leek te zijn gelokaliseerd dan de mutante C1199 Tiam1-eiwitten (vergelijk figuren 5 en 7,B). Verder was een deel van het tot expressie gebrachte MS-C580 Tiam1-eiwit aanwezig rond blaasjesachtige structuren in het cytoplasma, vergelijkbaar met andere MS-bevattende Tiam1-fusie-eiwitten (zie bijvoorbeeld Fig. 6 E, inzet). Een fusie-eiwit dat de NH . bevat2-terminaal Src-domein voor het C1199-ΔPHn Tiam1-eiwit was ook in staat om zich op het plasmamembraan te lokaliseren en rimpels te veroorzaken (gegevens niet getoond). Het Src-membraanlokalisatiedomein stelt C580 Tiam1 en C1199-ΔPHn dus in staat om membraanrimpeling te induceren door deze eiwitten aan het plasmamembraan te binden.

Om te testen of de NH2-terminaal PH-domein van Tiam1 voldoende is voor membraanlokalisatie, we hebben een gebied dat dit PH-domein bevat gefuseerd met het C580 Tiam1-eiwit (zie materialen en methoden). Het resulterende eiwit veroorzaakte echter geen rimpeling van het membraan en was niet geassocieerd met het plasmamembraan (Michiels, F. en J.C. Stam, niet-gepubliceerde resultaten). Dit zou kunnen beweren dat extra sequenties nodig zijn om membraanlokalisatie te verzekeren. Als alternatief zou de juxtapositie van het PH-domein met het DH-domein de juiste vouwing van deze domeinen kunnen verstoren. Een construct dat alleen het gebied uitdrukt dat de NH . bevat2-terminaal PH-domein functioneerde niet als een dominant-negatieve Tiam1-mutant. C1199-ΔDH, dat een deletie in het katalytische DH-domein bevat, interfereert echter ook niet met de inductie van membraanrimpeling door Tiam1. De reden hiervoor is op dit moment niet duidelijk.

Om de specificiteit van de NH . te analyseren2-terminaal PH-domein van Tiam1, een regio die dit PH-domein bevat, werd verwisseld voor de overeenkomstige regio's die het PH-domein van DbL, het PH-domein van β-ARK of het COOH-terminale PH-domein van Tiam1 bevatten (zie Materialen en methoden). Geen van deze mutante Tiam1-eiwitten was echter gelokaliseerd op het plasmamembraan en veroorzaakte membraanrimpeling (gegevens niet getoond). Dit betekent dat ofwel extra sequenties nodig zijn voor het correct functioneren van deze PH-domeinen ofwel dat de primaire functie van de NH2terminale PH-domein, namelijk om Tiam1 te lokaliseren via specifieke interacties met componenten van het plasmamembraan, kan niet worden vervangen door andere PH-domeinen.

De NH2-terminaal PH-domein is vereist voor de inductie van membraanruches door het Tiam1-eiwit over de volledige lengte

Het Tiam1-eiwit van volledige lengte (FL1591) draagt ​​een consensusmyristoylatiesequentie op de NH2 eindpunt. Door te labelen met [ 3 H]myristaat hebben we bevestigd dat de NH2 uiteinde van Tiam1 is gemyristoyleerd (niet getoond). Om te testen of de myristoylering voldoende is voor de membraanassociatie van Tiam1 van volledige lengte, werd ook een kleine deletie gemaakt in de NH2-terminaal PH-domein van FL1591 Tiam1 van volledige lengte. Echter, vergelijkbaar met C1199-ΔPHn, was mutant Tiam1 van volledige lengte (FL1591-ΔPHn) niet in staat om membraanrimpeling in NIH3T3-cellen of COS-cellen te induceren (Fig. 6, C en NS), en immuno-EM toonde aan dat het eiwit niet gelokaliseerd was op het plasmamembraan (gegevens niet getoond). Blijkbaar heeft de NH2-terminale myristoylering van Tiam1 van volledige lengte alleen is niet voldoende voor membraanlokalisatie. Om dit verder te onderbouwen heeft de NH2-terminale c-Src-sequenties werden gefuseerd voor het FL1591-ΔPHnl Tiam1-eiwit. Dit gebied van Src bevat een basisgebied dat nodig is voor optimale membraantranslocatie naast de myristoyleringssequentie, terwijl andere Src-achtige tyrosinekinasen een gepalmitoyleerd cysteïne in dit gebied bevatten (Superti-Furga en Courtneidge, 1995). Beide aanvullende sequenties zijn afwezig in Tiam1. Cellen die het MS-FL1591-ΔPHn1 Tiam1-eiwit tot expressie brachten, vertoonden opnieuw membraanrimpeling, hoewel minder uitgebreid dan cellen die FL1591 Tiam1 tot expressie brengen (Fig. 6, C–E). Nogmaals, er werden geen belangrijke verschillen in expressieniveaus waargenomen tussen deze eiwitten (gegevens niet getoond). Immuno-EM bevestigde dat het MS-FL1591-aPHn1 Tiam1-eiwit aanwezig was op en dichtbij het plasmamembraan, zoals gevonden voor MS-C580 Tiam1 (gegevens niet getoond). Blijkbaar functioneert het accessoire basisgebied van c-Src ook om MS -FL1591ΔPHn1 Tiam1 correct te lokaliseren. Net als bij MS-C580 leidde de expressie van MS FL1591-ΔPHn Tiam1 tot de vorming van kleine cytoplasmatische blaasjesachtige structuren, en het eiwit bevond zich ook rond deze structuren (Fig. 6). E). Deze waarnemingen geven aan dat de NH2-terminaal PH-domein dient ook als een essentiële membraantag, of misschien membraananker, voor Tiam1 over de volledige lengte.

Gecontroleerde cellulaire lokalisatie van Tiam1

PH-domeinen zijn in andere signaalmoleculen geïdentificeerd als eiwit-eiwit- en/of eiwit-fosfolipide-interactiemotieven die nodig zijn voor de gecontroleerde targeting van deze eiwitten naar het plasmamembraan (Lemmon et al., 1996). In weefselcoupes van huid en bepaalde carcinomen is endogeen Tiam1 voornamelijk aanwezig in het cytoplasma. Ook in sommige cellijnen, waar we endogene Tiam1 kunnen zien door middel van Western blotting, waaronder T-lymfoomcellen en neuronale cellen, is het voornamelijk gelokaliseerd in de cytoplasmatische fractie (gegevens niet getoond), wat suggereert dat Tiam1 zich kan verplaatsen naar het plasmamembraan na receptor stimulatie. Tot nu toe hebben we echter geen receptor-gemedieerde signaalroute kunnen identificeren waarbij Tiam1-activering betrokken is. Om te onderzoeken of membraantranslocatie van exogeen Tiam1 kon worden gevisualiseerd in NIH3T3-cellen, analyseerden we of serum de lokalisatie en het vermogen van Tiam1 om membraanrimpeling te induceren zou kunnen beïnvloeden. Zoals getoond in Fig. 8,EENNIH3T3-cellen die het C1199 Tiam1-eiwit tijdelijk tot expressie brachten, vertoonden geen membraanrimpeling na serumverhongering gedurende 24 uur. Er was bijna geen Tiam1-eiwit aanwezig op het plasmamembraan en F-actine was voornamelijk geconcentreerd in lamellipodia in de cellen die Tiam1 tot expressie brengen. Omdat deze optische secties op de basale plaats van de cellen zijn genomen om de lamellipodia te illustreren, zijn ook stressvezels zichtbaar. Merk op dat na uithongering van het serum gedurende 24 uur, NIH3T3-cellen nog steeds enkele stressvezels bevatten, in tegenstelling tot Zwitserse 3T3-cellen. Immuno-EM bevestigde dat de meeste cellen significant minder Tiam1 op het plasmamembraan bevatten na serumverhongering (Fig. 8, NS en F). De resterende membraan-geassocieerde Tiam1 zou onder deze omstandigheden voldoende kunnen zijn voor de aanwezigheid van lamellipodia. Toevoeging van door serum geïnduceerde membraanlokalisatie en daaropvolgende rimpeling van cellen die C1199 Tiam1 tot expressie brengen na 2 uur (Fig. 8, B en E), op welk tijdstip de door serum geïnduceerde stressvezels al zijn afgenomen. Een kwantificering van deze resultaten wordt gepresenteerd in Fig. 8,F. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met FL1591 Tiam1, C1199-ΔPHc en C1199ΔDHR Tiam1 (gegevens niet getoond). Daarentegen bleef het MS-C580 Tiam1-eiwit na 24 uur uithongering in serum op het plasmamembraan en induceerde het nog steeds membraanrimpeling (Fig. 8 C). Dit suggereert dat de serum-geïnduceerde membraantranslocatie van Tiam1 wordt gemedieerd door de NH2-terminaal PH-domein.

Onverwacht kon noch PDGF noch insuline serum vervangen bij de inductie van membraanrimpeling (gegevens niet getoond). Beide groeifactoren induceren de vorming van lamellipodia in NIH3T3-cellen binnen 5 minuten, wat gemakkelijk kan worden onderscheiden van de door Tiam1 geïnduceerde rimpeling. Dit kan erop wijzen dat Tiam1 niet wordt geactiveerd door PDGF of insuline.

Membraan-geassocieerde Tiam1 activeert JNK

Om te onderzoeken of membraanassociatie van Tiam1 ook vereist is voor de inductie van andere Rac-gemedieerde signaalroutes naast membraanruffling, werd de activiteit van JNK bepaald na cotransfectie met verschillende Tiam1-mutanten (zie Materialen en Methoden). Zowel in COS-7-cellen als in NIH3T3-cellen leidde cotransfectie van Tiam1 van volledige lengte tot een bijna zevenvoudige stimulatie van JNK-activiteit, vergelijkbaar met constitutief geactiveerd (V12)Rac1 (Fig. 9,EEN). Cotransfectie van gelabeld mitogeen-geactiveerd proteïnekinase (MAPK) met volledige of mutant Tiam1 of (V12)Rac resulteerde niet in activering van MAPK (niet getoond). De stimulatie van JNK door Tiam1 was afhankelijk van de activering van Rac, aangezien cotransfectie van dominantnegatieve (N17)Rac1 de activering van JNK door Tiam1 gedeeltelijk blokkeerde (Fig. 9,EEN). Hogere hoeveelheden (N17)Rac verstoorden de expressie van JNK. Bovendien verhinderde een deletie in het katalytische DH-domein van Tiam1 JNK-activering (niet getoond). Cotransfectie van dominant-negatieve (N17) Cdc42 interfereerde niet met de activering van JNK door Tiam1 (gegevens niet getoond). Transfectie van C1199 Tiam1 stimuleerde JNK-activiteit in dezelfde mate als FL1591 (Fig. 9,B). Kortere COOH-terminale Tiam1-fragmenten zoals C682 en C580 Tiam1, die niet op het plasmamembraan waren gelokaliseerd, waren echter niet in staat om JNK boven achtergrondniveaus te activeren. Ook mutant C1199-ΔPHn Tiam1, die zich niet op het plasmamembraan lokaliseerde vanwege de deletie in de NH2-terminaal PH-domein, was niet in staat om JNK te activeren (Fig. 9,B). MS -C580 Tiam1 veroorzaakte geen stimulatie van JNK-activiteit (Fig. 9,B), en ook MS-C1199-ΔPHn of MS-FL1591-ΔPHn Tiam1-eiwitten niet (gegevens niet getoond). Deze eiwitten veroorzaakten echter rimpelvorming in het membraan en waren aanwezig op het plasmamembraan (Fig. 6). Een mogelijke verklaring voor dit enigszins onverwachte resultaat is dat activering van endogeen Rac door MS-bevattende Tiam1-eiwitten voldoende is voor inductie van membraanrimpeling, maar niet voor stimulering van JNK. Als alternatief wordt het gebrek aan inductie van JNK-activiteit veroorzaakt door de verschillende ultrastructurele lokalisatie van het MS-C580 Tiam1-eiwit (vergelijk de figuren 5 en 7) of kan het de behoefte aan een intact NH weerspiegelen.2-terminaal PH-domein. Interessant is dat vergelijkbare resultaten werden verkregen met membraangericht p110-fosfoinositide-3-kinase dat in staat was om membraanverstoring te stimuleren, maar niet gentranscriptie van de Jun-induceerbare Fos-promoter (Reif et al., 1996). Wat het mechanisme ook is, deze resultaten geven aan dat de lokalisatie van Tiam1 op het plasmamembraan ook vereist is voor Rac-gemedieerde stimulatie van JNK-activiteit.


Inhoud

De microbe-specifieke moleculen die door een bepaalde PRR worden herkend, worden pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP's) genoemd en omvatten bacteriële koolhydraten (zoals lipopolysaccharide of LPS, mannose), nucleïnezuren (zoals bacterieel of viraal DNA of RNA), bacteriële peptiden (flagelline, microtubuli-verlengingsfactoren), peptidoglycanen en lipoteichoïnezuren (van Gram-positieve bacteriën), N-formylmethionine, lipoproteïnen en schimmelglucanen en chitine.

Endogene stresssignalen worden schade-geassocieerde moleculaire patronen (DAMP's) genoemd en omvatten urinezuur en extracellulair ATP, naast vele andere verbindingen. [2]

Er zijn verschillende subgroepen van PRR's. Ze worden geclassificeerd volgens hun ligandspecificiteit, functie, lokalisatie en/of evolutionaire relaties. Op basis van hun lokalisatie kunnen PRR's worden onderverdeeld in membraangebonden PRR's en cytoplasmatische PRR's.

Membraangebonden PRR's Bewerken

Receptorkinasen

PRR's werden voor het eerst ontdekt in planten. [6] Sindsdien zijn veel plant-PRR's voorspeld door genomische analyse (370 in rijst 47 in Arabidopsis). In tegenstelling tot dierlijke PRR's, die geassocieerd zijn met intracellulaire kinasen via adapter-eiwitten (zie niet-RD-kinasen hieronder), zijn PRR's van planten samengesteld uit een extracellulair domein, transmembraandomein, juxtamembraandomein en intracellulair kinasedomein als onderdeel van een enkel eiwit.

Toll-like receptoren (TLR) Bewerken

Herkenning van extracellulaire of endosomale pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen wordt gemedieerd door transmembraaneiwitten die bekend staan ​​als toll-like receptors (TLR's). [7] TLR's delen een typisch structureel motief, de Leucine rich repeats (LRR), die ze hun specifieke uiterlijk geven en ook verantwoordelijk zijn voor TLR-functionaliteit. [8] Toll-like receptoren werden voor het eerst ontdekt in Drosophila en triggeren de synthese en secretie van cytokinen en activering van andere gastheerafweerprogramma's die nodig zijn voor zowel aangeboren als adaptieve immuunresponsen. Tot nu toe zijn 10 functionele leden van de TLR-familie bij mensen beschreven. [5] Er is ook onderzoek gedaan naar TLR11 en het is aangetoond dat het flagelline en profiline-achtige eiwitten in muizen herkent. [9] Niettemin is TLR11 slechts een pseudogen bij mensen zonder directe functie of functionele eiwitexpressie. Van elk van de TLR's is aangetoond dat ze interageren met een specifieke PAMP. [5] [10] [11]

De TLR-signalering Bewerken

TLR's hebben de neiging om te dimeriseren, TLR4 vormt homodimeren en TLR6 kan dimeriseren met TLR1 of TLR2. [10] Interactie van TLR's met hun specifieke PAMP wordt gemedieerd via ofwel MyD88-afhankelijke route en triggert de signalering via NF-KB en de MAP-kinase-route en daardoor de secretie van pro-inflammatoire cytokinen en co-stimulerende moleculen of TRIF-afhankelijke signalering pad. [2] [5] [10] MyD88-afhankelijke route wordt geïnduceerd door verschillende PAMP's die de TLR's op macrofagen en dendritische cellen stimuleren. MyD88 trekt het IRAK4-molecuul aan, IRAK4 werft IRAK1 en IRAK2 aan om een ​​signaalcomplex te vormen. Het signaleringscomplex reageert met TRAF6, wat leidt tot TAK1-activering en bijgevolg de inductie van inflammatoire cytokines. De TRIF-afhankelijke route wordt geïnduceerd door macrofagen en DC's na TLR3- en TLR4-stimulatie. [2] Moleculen die vrijkomen na een TLR-activeringssignaal naar andere cellen van het immuunsysteem, waardoor TLR's sleutelelementen zijn van aangeboren immuniteit en adaptieve immuniteit. [2] [12] [13]

C-type lectinereceptoren (CLR)

Veel verschillende cellen van het aangeboren immuunsysteem brengen een groot aantal CLR's tot expressie die de aangeboren immuniteit vormen dankzij hun patroonherkenningsvermogen. [14] Hoewel de meeste klassen van menselijke pathogenen worden gedekt door CLR's, zijn CLR's een belangrijke receptor voor de herkenning van schimmels: [15] [16] desalniettemin zijn in onderzoeken ook andere PAMP's geïdentificeerd als doelwitten van CLR's, b.v. mannose is het herkenningsmotief voor veel virussen, schimmels en mycobacteriën, op dezelfde manier presenteert fucose hetzelfde voor bepaalde bacteriën en wormen en glucanen zijn aanwezig op mycobacteriën en schimmels. Bovendien komen veel van verworven niet-zelf-oppervlakken, b.v. neo-antigenen van het carcino-embryonaal/oncofoetaal type die een pathogeenpatroon van het type "interne gevarenbron"/"zelf-gedraaide niet-zelf" dragen, worden ook geïdentificeerd en vernietigd (bijv. door complementfixatie of andere cytotoxische aanvallen) of afgezonderd (gefagocyteerd of omhuld) door het immuunsysteem dankzij de CLR's. De naam lectine is een beetje misleidend omdat de familie eiwitten omvat met ten minste één C-type lectinedomein (CTLD), een specifiek type koolhydraatherkenningsdomein. CTLD is een ligandbindend motief dat wordt aangetroffen in meer dan 1000 bekende eiwitten (meer dan 100 bij mensen) en de liganden zijn vaak geen suikers. [17] Als en wanneer het ligand suiker is, hebben ze Ca2+ nodig - vandaar de naam "C-type", maar velen van hen hebben niet eens een bekend suikerligand, dus ondanks het feit dat ze een vouwstructuur van het lectine-type hebben, zijn sommige technisch niet "lectine" in functie.

CLR-signalering Bewerken

Er zijn verschillende soorten signalering betrokken bij door CLR's geïnduceerde immuunrespons. Er is een belangrijk verband geïdentificeerd tussen TLR- en CLR-signalering, daarom maken we onderscheid tussen TLR-afhankelijke en TLR-onafhankelijke signalering. DC-SIGN leidend tot RAF1-MEK-ERK cascade, BDCA2-signalering via ITAM en signalering via ITIM behoren tot de TLR-afhankelijke signalering. TLR-onafhankelijke signalering zoals Dectin 1 en Dectin 2 - mincle signalering leidt tot activering van MAP-kinase en NFkB. [18] [15]

Membraanreceptor CLR's zijn onderverdeeld in 17 groepen op basis van structuur en fylogenetische oorsprong. [19] Over het algemeen is er een grote groep die koolhydraten herkent en bindt, de zogenaamde koolhydraatherkenningsdomeinen (CRD's) en de eerder genoemde CTLD's.

Een andere mogelijke karakterisering van de CLR's kan betrekking hebben op mannose-receptoren en asialoglycoproteïne-receptoren. [18]

Groep I CLR's: de mannose-receptoren

De mannosereceptor (MR) [20] is een PRR die voornamelijk aanwezig is op het oppervlak van macrofagen en dendritische cellen. Het behoort tot de calciumafhankelijke meervoudige CRD-groep. [15] De MR behoort tot de multilectinereceptoreiwitgroep en vormt, net als de TLR's, een verband tussen aangeboren en adaptieve immuniteit. [21] [22] Het herkent en bindt zich aan herhaalde mannose-eenheden op de oppervlakken van infectieuze agentia en de activering ervan veroorzaakt endocytose en fagocytose van de microbe via het complementsysteem. In het bijzonder triggert mannose-binding de rekrutering van MBL-geassocieerde serineproteasen (MASP's). De serineproteasen activeren zichzelf in een cascade en versterken de immuunrespons: MBL interageert met C4, bindt de C4b-subeenheid en laat C4a op dezelfde manier vrij in de bloedbaan, binding van C2 veroorzaakt afgifte van C2b. Samen staan ​​MBL, C4b en C2a bekend als de C3-convertase. C3 wordt gesplitst in zijn a- en b-subeenheden en C3b bindt het convertase. Deze samen worden de C5 convertase genoemd. Evenzo is C5b gebonden en wordt C5a vrijgegeven. C5b werft C6, C7, C8 en meerdere C9's aan. C5, C6, C7, C8 en C9 vormen het membraanaanvalscomplex (MAC).

Groep II CLR's: asialoglycoproteïne-receptorfamilie

Dit is een andere grote superfamilie van CLR's die:

  1. De klassieke asialoglycoproteïne receptor macrofaag galactose-type lectine (MGL) (CLEC4L) (CLEC4K) (CLEC5A)
  2. DC-geassocieerde C-type lectine 1 (Dectin1) subfamilie die omvat:
      /CLEC7A /CLEC9A
  3. Myeloïde C-type lectine-achtige receptor (MICL) (CLEC12A)
  4. CLEC2 (ook wel CLEC1B genoemd) - de bloedplaatjesactiveringsreceptor voor podoplanine op lymfatische endotheelcellen en invasieve fronten van sommige carcinomen.
    1. /CLEC4A /CLEC6A
    2. Bloed-DC-antigeen 2 (BDCA2) (CLEC4C), d.w.z. macrofaag-induceerbaar C-type lectine (CLEC4E)

    De nomenclatuur (mannose versus asialoglycoproteïne) is een beetje misleidend omdat deze asialoglycoproteïne-receptoren niet noodzakelijk galactose (een van de meest voorkomende buitenste residuen van asialoglycoproteïne) specifieke receptoren zijn en zelfs veel van deze familieleden kunnen zich ook binden aan mannose, waarna de andere groep wordt genoemd.

    Cytoplasmatische PRR's Bewerken

    NOD-achtige receptoren (NLR) Bewerken

    Zie NOD-achtige receptor voor meer details.

    De NOD-achtige receptoren (NLR's) zijn cytoplasmatische eiwitten, die bacteriële peptidoglycanen herkennen en een pro-inflammatoire en antimicrobiële immuunrespons veroorzaken. [23] Ongeveer 20 van deze eiwitten zijn gevonden in het zoogdiergenoom en omvatten nucleotide-bindend oligomerisatiedomein (NOD's), dat nucleosidetrifosfaat bindt. De belangrijkste zijn onder andere: de MHC Klasse II transactivator (CIITA), IPAF, BIRC1 etc. [24]

    NLR signalering Bewerken

    Sommige van deze eiwitten herkennen endogene of microbiële moleculen of stressreacties en vormen oligomeren die bij dieren inflammatoire caspases activeren (bijv. caspase 1) die splitsing en activering van belangrijke inflammatoire cytokinen zoals IL-1 veroorzaken, en/of de NF-KB activeren signaalroute om de productie van ontstekingsmoleculen te induceren.

    De familie NLR is bekend onder verschillende namen, waaronder de familie CATERPILLER (of CLR) of NOD-LRR. [24] [25] De belangrijkste leden van de NLR's zijn NOD1 en NOD2. Ze voelen de geconserveerde microbiële peptidoglycanen in het cytoplasma van de cel en vertegenwoordigen daarom een ​​ander niveau van immuunrespons na membraangebonden receptoren zoals TLR's en CLR's. [23] Deze familie van eiwitten is enorm uitgebreid in planten en vormt een kerncomponent van het immuunsysteem van planten. [26]

    NOD's bewerken
    NLRP's Bewerken
    Andere NLR's Bewerken

    RIG-I-achtige receptoren (RLR)

    Tot dusver zijn drie RLR-helicases beschreven: RIG-I en MDA5 (die respectievelijk 5'-trifosfaat-RNA en dsRNA herkennen), die antivirale signalering activeren, en LGP2, dat lijkt te werken als een dominant-negatieve remmer. RLR's initiëren de afgifte van inflammatoire cytokinen en type I interferon (IFN I). [2]

    RLR-signalering Bewerken

    RLR's zijn RNA-helicases waarvan is aangetoond dat ze deelnemen aan intracellulaire herkenning van viraal dubbelstrengs (ds) en enkelstrengs RNA die factoren rekruteren via dubbele N-terminale CARD-domeinen om antivirale genprogramma's te activeren, die kunnen worden benut bij de therapie van virale infecties. [32] [33] Er is gesuggereerd dat het belangrijkste antivirale programma dat door RLR wordt geïnduceerd, gebaseerd is op ATPase-activiteit. [34] RLR's werken vaak samen en creëren overspraak met de TLR's bij de aangeboren immuunrespons en bij de regulatie van adaptieve immuunrespons. [35]

    RIG-I en Mda5-gemedieerde signaalroute.

    Planten bevatten een aanzienlijk aantal PRR's die opmerkelijke structurele en functionele overeenkomsten vertonen met drosophila TOLL en zoogdier-TLR's. De eerste PRR die bij planten of dieren werd geïdentificeerd, was het Xa21-eiwit, dat resistentie verleende tegen de Gram-negatieve bacteriële pathogeen Xanthomonas oryzae blz. oryzae. [6] [36] Sindsdien zijn twee andere planten PRR's, Arabidopsis FLS2 (flagelline) en EFR (elongation factor Tu receptor) geïsoleerd. [37] De corresponderende PAMP's voor FLS2 en EFR zijn geïdentificeerd. [37] Na ligandherkenning transduceren de plant-PRR's "PAMP-triggered immuniteit" (PTI). [38] Immuunsystemen van planten coderen ook voor resistentie-eiwitten die lijken op NOD-achtige receptoren (zie hierboven), die NBS- en LRR-domeinen bevatten en ook andere geconserveerde interactiedomeinen kunnen dragen, zoals het TIR-cytoplasmatische domein dat wordt aangetroffen in Toll- en Interleukinereceptoren. [39] De NBS-LRR-eiwitten zijn nodig voor effector-getriggerde immuniteit (ETI).

    PRR's worden gewoonlijk geassocieerd met of bevatten leden van een monofyletische groep van kinasen, de interleukine-1-receptor-geassocieerde kinase (IRAK)-familie, waaronder Drosophila Pelle, menselijke IRAK's, rijst XA21 en Arabidopsis FLS2. Bij zoogdieren kunnen PRR's ook associëren met leden van de receptor-interacting protein (RIP)-kinasefamilie, verre verwanten van de IRAK-familie. Sommige kinasen van de IRAK- en RIP-familie vallen in een kleine functionele klasse van kinasen die niet-RD worden genoemd, waarvan vele de activeringslus niet autofosforyleren. Een onderzoek van de gist-, vlieg-, worm-, menselijke, Arabidopsis- en rijstkinasen (3.723 kinasen) onthulde dat ondanks het kleine aantal niet-RD-kinasen in deze genomen (9%–29%), 12 van de 15 bekende of voorspelde kinasen om te functioneren in PRR-signalering vallen in de niet-RD-klasse. In planten behoren alle tot nu toe gekarakteriseerde PRR's tot de niet-RD-klasse. Deze gegevens geven aan dat kinasen geassocieerd met PRR's grotendeels kunnen worden voorspeld door het ontbreken van een enkel geconserveerd residu en nieuwe potentiële planten-PRR-subfamilies onthullen. [40] [41]

    Een aantal PRR's blijft niet geassocieerd met de cel die ze produceert. Complementreceptoren, collectines, ficolines, pentraxines zoals serumamyloïde en C-reactief eiwit, lipidetransferasen, peptidoglycaanherkenningseiwitten (PGRP's) [42] en de LRR, XA21D [43] zijn allemaal uitgescheiden eiwitten. Een zeer belangrijk collectine is mannan-bindend lectine (MBL), een belangrijke PRR van het aangeboren immuunsysteem dat zich bindt aan een breed scala aan bacteriën, virussen, schimmels en protozoa. MBL herkent voornamelijk bepaalde suikergroepen op het oppervlak van micro-organismen, maar bindt ook fosfolipiden, nucleïnezuren en niet-geglycosyleerde eiwitten. [44] Eenmaal gebonden aan de liganden, rekruteren MBL- en Ficolin-oligomeren MASP1 en MASP2 en initiëren ze de lectineroute van complementactivatie die enigszins vergelijkbaar is met de klassieke complementroute.

    Onderzoeksgroepen hebben onlangs uitgebreid onderzoek gedaan naar de betrokkenheid en het mogelijke gebruik van het immuunsysteem van de patiënt bij de behandeling van verschillende ziekten, de zogenaamde immunotherapie, waaronder monoklonale antilichamen, niet-specifieke immunotherapieën, oncolytische virustherapie, T-celtherapie en kankervaccins . [45] NOD2 is door functieverlies en -winst in verband gebracht met de ontwikkeling van de ziekte van Crohn en sarcoïdose met vroege aanvang. [23] [46] Mutaties in NOD2 in samenwerking met omgevingsfactoren leiden tot het ontstaan ​​van chronische ontstekingen in de darm. [23] [47] Daarom is gesuggereerd om de ziekte te behandelen door de kleine moleculen te remmen, die de NOD2-signalering kunnen moduleren, met name RIP2. Tot dusver zijn door de FDA twee therapieën goedgekeurd die de fosforylering op RIP2 remmen, wat nodig is voor een goede werking van NOD2, gefitinib en erlotinib. [48] ​​[49] Daarnaast is er onderzoek gedaan naar GSK583, een zeer specifieke RIP2-remmer, die veelbelovend lijkt in het remmen van NOD1- en NOD2-signalering en daardoor ontstekingen veroorzaakt door NOD1-, NOD2-signaleringsroutes. [50] Een andere mogelijkheid is om de sensor voor NOD2 te verwijderen, wat in muizenmodellen efficiënt is gebleken bij het onderdrukken van de symptomen van de ziekte van Crohn. [51] Type II-kinaseremmers, die zeer specifiek zijn, hebben veelbelovende resultaten laten zien bij het blokkeren van de TNF die voortkomt uit NOD-afhankelijke routes, wat een hoog potentieel laat zien bij de behandeling van met ontstekingen geassocieerde tumoren. [52]

    Een andere mogelijke exploitatie van PRR's in de menselijke geneeskunde houdt ook verband met tumortumoren van de darmen. Helicobacter pylori is aangetoond door studies om significant te correleren met de ontwikkeling van gastro-intestinale tumoren. Bij een gezond individu Helicobacter pylori infectie is het doelwit van de combinatie van PRR's, namelijk TLR's, NLR's, RLR's en CLR DC-SIGN. In het geval van hun storing zijn deze receptoren ook in verband gebracht met carcinogenese. Wanneer de Helicobacter pylori Als de infectie in de darm verder gaat, ontwikkelt het zich tot chronische ontsteking, atrofie en uiteindelijk dysplasie, wat leidt tot de ontwikkeling van kanker. Aangezien alle soorten PRR's een rol spelen bij de identificatie en uitroeiing van de infectie, bouwen hun specifieke agonisten een sterke immuunrespons op tegen kankers en andere PRR-gerelateerde ziekten. Het is aangetoond dat de remming van TLR2 significant correleert met een verbeterde toestand van de patiënt en onderdrukking van het maagadenocarcinoom. [53]

    De PRR's zijn ook nauw verbonden met de goede functie van neuronale netwerken en weefsels, vooral vanwege hun betrokkenheid bij de ontstekingsprocessen, die essentieel zijn voor een goede werking maar onherstelbare schade kunnen veroorzaken als ze niet onder controle zijn. De TLR's komen tot expressie op de meeste cellen van het centrale zenuwstelsel (CZS) en spelen een cruciale rol bij steriele ontstekingen. Na een blessure leiden ze tot een verslechtering van de axonale groei en vertragen of stoppen ze het herstel zelfs helemaal.Een andere belangrijke structuur die betrokken is bij en mogelijk bruikbaar is bij therapie na een blessure, is het inflammasoom. Door de inductie van pro-inflammatoire cytokinen, IL-1β en IL-18, is voorgesteld dat remming van inflammasoom ook kan dienen als een efficiënte therapeutische methode. [54] De betrokkenheid van inflammasoom is ook onderzocht bij verschillende andere ziekten, waaronder experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE), de ziekte van Alzheimer en Parkinson en bij atherosclerose die verband houdt met type II diabetes bij patiënten. De voorgestelde therapieën omvatten afbraak van NLRP3 of remming van de pro-inflammatoire cytokines. [54]


    Slotopmerkingen

    Op basis van de gegevens die in deze review zijn besproken, stellen we voor dat het evolutionaire behoud van twee CPC-centromeer-rekruteringsarmen ervoor zorgt dat voldoende hoeveelheden actieve Aurora B zich ophopen in de buurt van kinetochoren. We suggereren dat het het KT-MT-foutcorrectiesysteem robuust maakt, waardoor delende cellen veerkrachtiger worden tegen omstandigheden die het mitotische controlepunt zouden verzwakken of die de kans zouden vergroten op het verkrijgen van foutieve KT-MT-aanhechtingen, zoals verstoringen in de geometrie van de mitotische spil (Ertych et al., 2014). Met andere woorden, het kan de getrouwheid van de chromosoomsegregatie in afwijkende situaties waarborgen. Bovendien kan de lokalisatie van de binnenste centromeer van Aurora B nog steeds relevant zijn om de fosforyleringsstatus van een aantal buitenste kinetochoorsubstraten te regelen, maar niet allemaal. Dit hangt waarschijnlijk ook af van de regulatie van de fosfatase die een bepaald substraat defosforyleert. Als het antagoniserende fosfatase in relatief grote hoeveelheden aanwezig is in het kinetochoor, kan zelfs een kleine verandering in de kinase-substraatafstand een dramatisch effect hebben op de fosforyleringsstatus van het substraat. Ten slotte opent het besef dat de CEN-module van de CPC de centromeercohesie versterkt en betrokken is bij de assemblage van de binnenste kinetochoren, de mogelijkheid dat de �tiviteit” van de CEN-module lokalisatie van het binnenste centromeer vereist.


    DISCUSSIE

    In deze studie hebben we de rollen onderzocht van de N- en C-terminale regio's van P4-ATPasen met betrekking tot hun cellulaire lokalisatie. Belangrijk is dat we vonden dat de NT-regio's van de ATP10-familie en de CT-regio's van de ATP11-familie cruciaal zijn voor hun cellulaire lokalisatie, wat suggereert dat deze cytoplasmatische regio's specifieke membraantargeting- en/of retentiesignalen bevatten. Bovendien dienen de N-terminus van ATP10B en de C-terminus van ATP11B als endosomale richtsignalen voor deze enzymen. De N-termini van ATP9B en ATP13A2, een P5-ATPase, zijn vereist voor respectievelijk hun Golgi- en late endosomale lokalisatie (Takatsu et al., 2011 Holemans et al., 2015). Bovendien zijn de N-termini van ATP9B en ATP13A2 alleen voldoende voor hun lokalisatie door hun interacties met de membranen van specifieke organellen. De N-terminus van ATP10B en de C-terminus van ATP11B waren echter niet voldoende voor targeting op specifieke endosomale membranen omdat de N- en C-terminus gedistribueerd bleven in het cytosol wanneer ze alleen tot expressie werden gebracht (supplementaire figuur S1). Door een opvallend contrast, wanneer de op het plasmamembraan gerichte Lyn11 sequentie werd gefuseerd met ATP10B-NT of ATP11B-CT, werden de chimere constructen gelokaliseerd in specifieke endosomale compartimenten (respectievelijk late endosomen of vroege/recyclerende endosomen) maar niet op het plasmamembraan. Daarom dienen ATP10B-NT en ATP11B-CT waarschijnlijk als signalen voor intracellulair verkeer en targeting om de eiwitten van het plasmamembraan naar specifieke endosomale compartimenten te leiden. Veel transmembraaneiwitten die zich in intracellulaire compartimenten bevinden, waaronder Lamp-1, TGN46 en mannose-6-fosfaatreceptor, circuleren tussen het plasmamembraan en endosomen (Dell'Angelica et al., 1999 Ishizaki et al., 2008 Nakai et al., 2013), en ATP11A en ATP11C, die zich op het plasmamembraan bevinden, wisselen ook tussen het plasmamembraan en endosomen (Steinberg et al., 2013 Takatsu et al., 2017). De celoppervlakte-expressie van ATP11A en ATP11C is verminderd in SNX27- of VPS35-uitgeputte cellen (Steinberg et al., 2013). Zo reguleren SNX27 en het retromeercomplex de recycling van ATP11A en ATP11C van endosomen naar het plasmamembraan. Alles bij elkaar genomen suggereren deze gegevens dat ATP10B en ATP11B verkeer tussen intracellulaire compartimenten en het plasmamembraan, en dat ze een endosomaal targeting- en/of retentiesignaal hebben in respectievelijk hun NT- en CT-regio's.

    Omdat de NT-sequenties divers zijn onder de ATP10-eiwitten, kunnen deze regio's specifieke rollen spelen in individuele eiwitten (supplementaire figuur S2). In overeenstemming hiermee is de N-terminus van cruciaal belang voor het bepalen van de lokalisatie van ATP10A, ATP10B en ATP10D, en is de N-terminus van ATP10B voldoende voor de late endosomale targeting van plasmamembraaneiwitten, waaronder Lyn11-EGFP. Bovendien bevat ATP10B-NT een dileucine-achtig ExxxLL-motief (aanvullende figuur S2), en inderdaad zijn de twee leucine-residuen vereist voor de handel in Lyn11-EGFP-ATP10B-NT van het plasmamembraan naar late endosomen (Figuur 7), terwijl het Glu-residu overbodig lijkt te zijn. De P1B-ATPases, ATP7A en ATP7B, herbergen ook de dileucine-achtige intracellulaire mensenhandelsignalen in hun CT-regio's (Greenough et al., 2004 Lalioti et al., 2014). Het moet nog worden opgehelderd of ATP10B van het plasmamembraan naar late endosomen wordt getransporteerd of tijdens biosynthese rechtstreeks van het Golgi-complex naar endosomen wordt getransporteerd. Niettemin, wanneer ATP10B naar het plasmamembraan wordt getransporteerd, dient het dileucine-motief als een mensenhandelsignaal voor targeting op late endosomen (Figuur 8). Met name, hoewel D-ATP10B gelokaliseerd is op het plasmamembraan, Lyn11-EGFP-ATP10D-NT verscheen in sommige punctaatstructuren in het cytoplasma en op het plasmamembraan. Daarom kan het N-uiteinde van ATP10D ook een signaal voor endocytose bevatten.

    We hebben eerder aangetoond dat de C-terminale SVRPLL-sequentie van ATP11C-a dient als een dileucine-achtig motief wanneer de Ser wordt gefosforyleerd door proteïnekinase C (PKC) α en vervolgens naar beneden wordt gereguleerd door endocytose (supplementaire figuur S3 Takatsu et al., 2017). Bovendien is de C-terminale LLxYKH-sequentie van ATP11C-b van cruciaal belang voor zijn gepolariseerde lokalisatie (Takayama et al., 2019). Daarom spelen de C-termini van ATP11-eiwitten een sleutelrol bij de regulatie van hun cellulaire lokalisatie en enzymatische activiteit op het plasmamembraan. De C-terminus kan inderdaad de lokalisatie van ATP11A, ATP11B en ATP11C bepalen (Figuur 4), en de C-terminus van ATP11B is voldoende om plasmamembraaneiwitten te targeten, waaronder Lyn11-EGFP, tot vroege/recycling endosomen (Figuur 6). Hoewel de endocytische signaalresiduen van ATP11B-CT onbekend zijn, kan er een signaal zijn voor mensenhandel en/of targeting naar endosomen.

    Het C-terminale cytoplasmatische gebied van Drs2p bindt aan fosfatidylinositol-4-fosfaat (PI4P), en deze interactie reguleert de enzymatische activiteit van Drs2p. Het C-uiteinde van Drs2p vertoont auto-inhiberende activiteit en de interactie met PI4P lijkt het remmende effect te verlichten (Natarajan et al., 2009 Zhou' et al., 2013 Azouaoui et al., 2017 Timcenko et al., 2019). Bovendien ondergaat het C-uiteinde van ATP8A2 fosforylering die de auto-inhibitie ervan verlicht (Chalat et al., 2017). Bovendien bindt het C-terminale GYAFS-motief van ATP8A1 aan het N-domein van ATP8A1 in de E2P-toestand (Hiraizumi et al., 2019). Daarom lijkt de C-terminus betrokken te zijn bij de regulatie van de enzymatische activiteiten van deze eiwitten. Aan de andere kant behield het verwisselen van de N- of C-termini van ATP10-eiwitten hun enzymatische activiteit of substraatspecificiteit (Figuur 3), en het verwisselen van de C-terminus van ATP11C had geen invloed op de PS/PE-flipping-activiteit (Takatsu et al., 2017). Omdat er veel variatie is tussen de NT- en CT-sequenties van P4-ATPasen (aanvullende figuren S2 en S3), kunnen deze cytoplasmatische regio's specifieke regulerende rollen spelen met betrekking tot hun enzymatische activiteit en intracellulair verkeer.


    Verschil tussen T-cellen en B-cellen

    Definitie

    T-cellen: T-cellen zijn een type lymfocyt, die zich in de thymus ontwikkelt, in het bloed en de lymfe circuleert en de immuunrespons tegen kwaadaardige of geïnfecteerde cellen in het lichaam bemiddelt door de afscheiding van lymfokinen of door direct contact.

    B-cellen: B-cellen zijn een type lymfocyt, die zich in het beenmerg ontwikkelt, in het bloed en de lymfe circuleert, en bij herkenning van een bepaalde ziekteverwekker differentieert tot een plasmacelkloon, waarbij specifieke antilichamen en een geheugencelkloon worden uitgescheiden, voor de daaropvolgende ontmoeting van dezelfde ziekteverwekker.

    Oorsprong

    T-cellen: T-cellen ontstaan ​​in het beenmerg en rijpen in de thymus.

    B-cellen: B-cellen ontstaan ​​en rijpen in het beenmerg.

    Positie

    T-cellen: Rijpe T-cellen komen voor in de lymfeklieren.

    B-cellen: Rijpe B-cellen komen voor buiten de lymfeklieren.

    Membraan receptor

    T-cellen: T-cellen dragen TCR-receptor.

    B-cellen: B-cellen dragen BCR-receptor.

    Herkenning van antigenen

    T-cellen: T-cellen herkennen virale antigenen aan de buitenkant van de geïnfecteerde cellen.

    B-cellen: B-cellen herkennen antigenen op het oppervlak van bacteriën en virussen.

    Verdeling

    T-cellen: T-cellen komen voor in de parafolliculaire gebieden van de cortex van de lymfeklieren en de periarteriolaire lymfoïde omhulling van de milt.

    B-cellen: B-cellen komen voor in de kiemcentra, subcapsulaire en medullaire strengen van lymfeklieren, milt, darm en de luchtwegen.

    Levensduur

    T-cellen: De T-cellen hebben een langere levensduur.

    B-cellen: De levensduur van de B-cellen is kort.

    Oppervlakte-antilichamen

    T-cellen: De T-cellen missen oppervlakte-antigenen.

    B-cellen: De B-cellen hebben oppervlakte-antigenen.

    Afscheiding

    T-cellen: De T-cellen scheiden lymfokinen uit.

    B-cellen: De B-cellen scheiden antilichamen af.

    Type immuniteit

    T-cellen: De T-cellen zijn betrokken bij de celgemedieerde immuniteit (CMI).

    B-cellen: De B-cellen zijn betrokken bij de humorale of de antilichaam-gemedieerde immuniteit (AMI).

    Verhoudingen in het bloed

    T-cellen: De 80% van de bloedlymfocyten zijn T-cellen.

    B-cellen: De 20% van de bloedlymfocyten zijn B-cellen.

    Types

    T-cellen: De drie soorten T-cellen zijn helper-T-cellen, cytotoxische T-cellen en suppressor-T-cellen.

    B-cellen: De twee soorten B-cellen zijn plasmacellen en geheugencellen.

    Verplaatsing naar de geïnfecteerde site

    T-cellen: De T-cellen verplaatsen zich naar de plaats van infectie.

    B-cellen: De B-cellen verplaatsen zich niet naar de plaats van infectie.

    Tumorcellen en transplantaties

    T-cellen: De T-cellen werken tegen tumorcellen en transplantaties.

    B-cellen: De B-cellen werken niet tegen tumorcellen of transplantaties.

    Remmend effect

    T-cellen: De suppressor T-cellen hebben een remmend effect op het immuunsysteem.

    B-cellen: De B-cellen hebben geen remmend effect op het immuunsysteem.

    Verdedigen tegen

    T-cellen: De T-cellen verdedigen tegen de ziekteverwekkers, waaronder virussen, protisten en schimmels die de cellen in het lichaam binnendringen.

    B-cellen: De B-cellen verdedigen tegen bacteriën en virussen in de bloedbaan of lymfe.

    Conclusie

    T-cellen en B-cellen zijn twee soorten lymfocyten die een immuunrespons opwekken tegen lichaamsvreemde stoffen. T-cellen herkennen de vreemde antigenen op het oppervlak van de APS's. De helper-T-cellen stimuleren de aanmaak van antilichamen door plasmacellen. De cytotoxische T-cellen vernietigen pathogenen door apoptose te induceren. De B-cellen produceren specifieke antilichamen tegen verschillende pathogenen door de antigenen in het circulatiesysteem te herkennen. Het belangrijkste verschil tussen T-cellen en B-cellen is hun methode om antigenen te herkennen.


    Bekijk de video: Review of B cells, CD4+ T cells and CD8+ T cells. NCLEX-RN. Khan Academy (September 2022).


Opmerkingen:

  1. Medwin

    Jij de abstracte persoon

  2. Brale

    Ik ben er stevig van overtuigd dat je niet gelijk hebt. De tijd zal het leren.

  3. Pietro

    Heb ik iets gemist?



Schrijf een bericht