Informatie

Kun je glucose vervangen door glycerol in celmedia?

Kun je glucose vervangen door glycerol in celmedia?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Om een ​​te voeden dierlijke cel in proces genaamd Ademhaling, kan ik glucose vervangen door glycerol?

De vergelijking hieronder: Glycerol + Zuurstof -> Water + Koolstofoxide


In de meeste gevallen is het geen goed idee om glucose te vervangen door glycerol in dierlijke celmedia. Dieren bezitten het vermogen om glycerol te metaboliseren, via een route die begint met het enzym glycerolkinase. Glycerolkinase komt echter alleen tot expressie in bepaalde celtypen, zoals levercellen en niercellen.

Referenties:

http://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=2.7.1.30 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22591/


Metabolisme van andere moleculen dan glucose

Je hebt geleerd over het katabolisme van glucose, dat energie levert aan levende cellen. Maar levende wezens verbruiken meer dan alleen glucose voor voedsel. Hoe levert een kalkoensandwich, die verschillende koolhydraten, lipiden en eiwitten bevat, energie aan uw cellen?

Kortom, al deze moleculen uit voedsel worden omgezet in moleculen die ergens in de cellulaire ademhalingsroute kunnen komen. Sommige moleculen komen binnen bij glycolyse, terwijl andere bij de citroenzuurcyclus binnenkomen. Dit betekent dat alle katabole routes voor koolhydraten, eiwitten en lipiden uiteindelijk aansluiten op glycolyse en de citroenzuurcyclusroutes. Metabole routes moeten als poreus worden beschouwd, dat wil zeggen dat stoffen via andere routes binnenkomen en andere stoffen naar andere routes gaan. Deze paden zijn geen gesloten systemen. Veel van de producten in een bepaalde route zijn reactanten in andere routes.


Samenvatting

Alcohol is fundamenteel voor het karakter van wijn, maar te veel kan een wijn uit balans brengen. Een wijn wordt als goed uitgebalanceerd beschouwd als het alcoholgehalte, de zuurgraad, de zoetheid, de fruitigheid en de tanninestructuur elkaar aanvullen, zodat geen enkel onderdeel in de mond domineert. Het balanceren van de positieve fruitsmaken van een wijn met de optimale absolute en relatieve alcoholconcentratie kan verrassend moeilijk zijn. In de afgelopen drie decennia hebben consumenten steeds meer gevraagd om wijn met rijkere en rijpere fruitsmaakprofielen. Als reactie hierop hebben druiven- en wijnproducenten de oogsttijden verlengd om de rijpheid van de druiven te vergroten en de mate van fruitsmaken en kleurintensiteit te verbeteren. Een hogere mate van rijpheid van de druiven resulteert echter in een verhoogde concentratie druivensuiker, wat op zijn beurt resulteert in wijnen met een verhoogde alcoholconcentratie. Gemiddeld steeg het alcoholgehalte van rode wijnen uit veel warme wijnproducerende regio's wereldwijd met ongeveer 2% (v/v) in deze periode. Hoewel veel van deze 'volle, fruitige' wijnen goed uitgebalanceerd en gewild zijn, is er ook een aanzienlijk consumentenmarktsegment dat op zoek is naar lichtere stijlen met minder van ethanol afgeleide 'hotness' in de mond. Op de consument gerichte wijnproducenten ontwikkelen en implementeren verschillende strategieën in de wijngaard en de wijnmakerij om de alcoholconcentratie in wijnen van goed gerijpte druiven te verminderen. In deze context, Saccharomyces cerevisiae wijngist is een cruciale strategie gebleken om de vorming van ethanol tijdens de fermentatie van druivenmost met een hoog suikergehalte te verminderen (> 240 g l −1 ). Een van de benaderingen was het ontwikkelen van 'alcoholarme' giststammen die werken door hun koolstofmetabolisme om te leiden van de productie van ethanol naar andere metabolieten, zoals glycerol. Dit artikel bespreekt de huidige uitdagingen van het produceren van glycerol ten koste van ethanol. Het werpt ook een nieuw licht op de ontwikkelingsprogramma's van giststammen die, ondersteund door synthetische genomica, deze uitdagingen mogelijk zouden kunnen overwinnen.


PpNrg1 is een transcriptionele repressor voor glucose- en glycerolrepressie van AOX1 promotor in methylotrofe gist Pichia pastoris

De regulator in glycerolrepressie van Pichia pastoris AOX1 promotor (P AOX1) is nog onduidelijk.

Resultaten

een Cys2Zijn2 zinkvinger transcriptionele repressor PpNrg1 gelokaliseerd in de kern en nam deel aan de onderdrukking van P AOX1 in P. pastoris in glucose en glycerol. Kwantitatieve real-time PCR onthulde dat PpNrg1 de expressie onderdrukte van talrijke genen die betrokken zijn bij het gebruik van methanol en peroxisoombiogenese in 0,02% glucose en 1% (v/v) glycerol. Elektroforetische mobiliteitsverschuivingstest en DNase I footprinting-test onthulden dat PpNrg1 bond aan vijf plaatsen van P AOX1, waaronder twee bindingsplaatsen van PpMxr1, een onmisbare activator van P AOX1 in P. pastoris.

Conclusie

Transcriptionele repressor PpNrg1 onderdrukt P AOX1 in glucose en glycerol door direct te binden aan vijf plaatsen van P AOX1, waaronder twee bindingsplaatsen van transcriptionele activator PpMxr1.


Cryopreservatie van gameten en embryo's van vinvissen en schaaldieren

3.4 Selectie van extender en cryoprotectant

Extenders en cryoprotectanten zijn zeer goed bestudeerd omdat cryopreservatie zonder hen moeilijk is. Naast zaadvloeistof en het universele cryoprotectant, DMSO, zijn andere afzonderlijke cryoprotectanten, gecombineerde cryoprotectanten, cryoprotectanten met eigeel of sucrose gebruikt bij het cryopreserveren van gameten, blastomeren, nauplii of embryo's. Het lijkt erop dat er een uitgesproken soortspecificiteit is in de vereisten van extenders.

Kippeneigeel is in veel cryopreservatiestudies getest als additief in de extender of cryoprotectant. Bij zeevissen vertoonden de oplossing van Erdahl en Graham en eigeel een positief effect op milt van snoek, Esox Lucius L., met een verhoogde bevruchtingsgraad (Babiak et al., 1995). in cobia, Rachycentron canadum, 10% DMSO met 3 mM glucose en 10% eigeel gaf ongeveer 100% beweeglijkheid van sperma na cryoopslag bij -80 ° C gedurende 1 jaar (Caylor et al., 1994). Chereguini et al. (1997) mengde ook DMSO met eigeel in ingevroren tarbot (Scophthalmus maximus) sperma. Tarbot spermatozoa kunnen ook worden gecryopreserveerd met een hoge mate van succes in een sucrose-oplossing met 10% DMSO en 10% eigeel. In zoetwatervissen zoals Donauzalm (Hucho Hucho), 10% DMSO + 10% eigeel + 0,3 M glucose + 25 mM KCl was het meest geschikt voor cryopreservatie van milt, resulterend in eieren met 87,5% ogen (Glogowski et al., 1997a). Ciereszko et al. (1993) vergeleken twee gecombineerde cryoprotectanten en vonden dat 8% DMSO met 10% eidooier een significant hogere bevruchtingssnelheid gaf dan 20% glycerol met 0,3 M glucose in gele baars, Perea flavescenshile. Lahnsteiner et al. (1996b) wezen er verder op dat toevoeging van eigeel (7%, 20% van het totale volume van extender) en sucrose (0,5%) de kwaliteit van regenboogforel significant verhoogde (Oncorhynchus mykiss) sperma in vergelijking met dezelfde extender van DMSO en glycerol of DMSO, glycerol en propaandiol zonder deze additieven. Hoewel veel onderzoeken het positieve effect van het gebruik van eigeel als versnijder hebben aangetoond, is het mogelijk niet van toepassing op andere soorten. Piironen (1993) ontdekte dat de toevoeging van eigeel als verlengstuk voor cryopreservatie van sperma de bevruchtingssnelheid bij beekforel verhoogde (Salmo trutta m. lacustris L.) maar niet in Artie charr (Salvelinus alpinus L.). in asp, Aspius aspius, verminderde de aanwezigheid van eigeel in de versnijders het succes van cryopreservatie aanzienlijk (Babiak et al., 1998). De beschermende werking van dooier is blijkbaar soortspecifiek en kan afhangen van de bestanddelen van de extender en de cryopreservatieprocedure.

In enkele recente onderzoeken, N,N-dimethylacetamide (DMA) en N, N-dimethylformamide (DMF) werden toegepast als alternatieve cryoprotectanten. Wayman et al. (1996) evalueerden vier chemicaliën als cryoprotectanten bij de cryopreservatie van gevlekte zeeforel (Cynoscion nebulosus) sperma en vonden dat DMA, methanol en glycerol inferieur waren aan 10% DMSO. De Bauny et al. (1997) probeerde ook DMA bij het invriezen van regenboogforel (O. mykiss) sperma maar faalde. In het geval van medaka-spermatozoa, Aoki et al. (1997) gaven aan dat de beste resultaten werden verkregen met 50 l foetaal runderserum aangevuld met 10% DMF als cryoprotectanten. Bemestingstests toonden aan dat bevruchtingspercentages van 96-100% en uitkomstpercentages van 84-100% kunnen worden verkregen. Hun studie biedt voor het eerst een praktische methode voor het bewaren van medaka-spermatozoa.

Bij het invriezen van sperma van Japanse oester, C. gigas, werd een hoge bevruchtingssnelheid van 45,9% verkregen in een onderzoek waarbij een oplossing werd gebruikt die 8% DMSO, 50 mM sucrose en 6 mM gereduceerd glutathion bevat als een cryoprotectant en het miltmengsel bevriezing in vloeibare stikstofdamp (Usuki et al., 1997). Hetzelfde rapport gaf aan dat spermatozoa die gedurende 4 jaar gecryopreserveerd waren, een lagere levensvatbaarheid vertoonden dan de gecryopreserveerde spermatozoa op korte termijn. De verhouding van normale D-vormige larven en overlevingspercentage 6 dagen na de bevruchting was respectievelijk 78,0% en 77,4% bij gebruik van sperma dat gedurende 4 jaar gecryopreserveerd was.

De effectiviteit van methanol als verdunningsmiddel voor tilapia en zebravissperma werd gerapporteerd door Harvey (1983a,b). Een verdunningsmiddel met een pH van 7,35 en een osmotische druk van sperma 375 mosM/1, aandoeningen die de beweeglijkheid van spermatozoa voorkomen, werd met succes gebruikt om goudbrasem te cryopreserveren (Spa. aurata) sperma bij − 196 °C (Chambeyron en Zohar, 1990).


Conclusies

Een alternatief bioproces voor de productie van ethanol uit biomassa is met succes ontwikkeld met behulp van een genetisch gemanipuleerde stam om het gebruik van glucose in of uit te schakelen. E coli door een temperatuurschakelaar, waardoor het remmende effect van glucose op het gebruik van andere suikers wordt verlicht. De cellen die voor glucosegebruik zijn uitgeschakeld, kunnen bij voorkeur xylose en andere suikers die aanwezig zijn in lignocellulosehydrolysaten gebruiken voor celgroei, terwijl ingeschakelde cellen met glucosegebruik efficiënt glucose en andere suikers in ethanol kunnen omzetten tijdens de anaërobe fase voor ethanolfermentatie. Aanzienlijk werd de efficiëntie van het gebruik van suikers in lignocellulosehydrolysaten verbeterd en dat gold ook voor de economische haalbaarheid van de productie van ethanol uit biomassa.


Abstract

Een hoge mate van afhankelijkheid van fossiele brandstoffen is een van de grootste problemen waarmee moderne samenlevingen worden geconfronteerd. d -Glucose en glycerol zijn de afgelopen jaren naar voren gekomen als potentiële vervangers voor fossiele brandstoffen die worden gebruikt bij de productie van hoogwaardige chemicaliën, en naar verwachting zullen celvrije bioproductieroutes een cruciale rol spelen in dergelijke processen. Onlangs zijn verschillende synthetische cascades beschreven die worden gebruikt voor de celvrije biotransformaties van d-glucose en glycerol tot pyruvaat en meer. Deze werden echter beperkt door de zeer langzame dehydratatiestap van d-glyceraat tot pyruvaat gekatalyseerd door een dehydratase uit Sulfolobus solfataricus (ssDHAD), waardoor deze stap verreweg het grootste knelpunt is. Door het enorme aantal beschikbare genomen te combineren met een op sequenties gebaseerde ontdekkingsbenadering, hebben we kenmerkende sequenties geïdentificeerd die hebben geleid tot de ontdekking van twee verschillende klassen van dehydratasen die veelbelovende activiteit en totaal omzetgetal (TTN) ten opzichte van d-glyceraat vertonen. Met name de dehydratase van Paralcaligenes ureilyticus (PuDHT) vertoonde een >100-voudig hogere activiteit en TTN voor d-glyceraat in vergelijking met ssDAD. In aanvulling, PuDHT vertoonde uitzonderlijk hoge activiteit en TTN tegen d-gluconaat. De vervanging van ssDAD door PuDHT in onze modelcascade van d-glucose naar ethanol verhoogde de productiesnelheid met een factor 10 en bereikte een theoretische opbrengst van 92% bij 50 °C. PuDHT was ook geschikt voor de omzetting van glycerol in pyruvaat bij omgevingstemperatuur, wat leidde tot een >5-voudige verbetering van de productiesnelheid in vergelijking met het systeem dat gebruikmaakt van ssDHAD bij 50 °C en bereikt 97% van de theoretische opbrengst. PuDHT was ook compatibel wanneer ruwe glycerol als substraat werd gebruikt, en veroorzaakte niet langer een knelpunt in de enzymatische cascade.


Metabolische engineering van Escherichia coli om de productie van acetol uit glycerol te verbeteren

Acetol, een C3-ketoalcohol, is een belangrijk tussenproduct dat wordt gebruikt om polyolen en acroleïne te produceren. Om de productie van acetol uit glycerol te verbeteren door: Escherichia coli, werd een mutant (HJ02) geconstrueerd door de inheemse gpK gen met het allel from E coli Lin 43 en overexpressie van yqhD, dat codeert voor aldehydeoxidoreductase YqhD dat methylglyoxal omzet in acetol. Vergeleken met de controlestam zonder de gpK vervanging had HJ02 een 5,5 keer hogere acetolproductie en een 53,4% hogere glycerolconsumptie. Vervolgens werd glucose toegevoegd als een co-substraat om de beschikbaarheid van NADPH te verbeteren en de ptsG gen werd verwijderd in HJ02 (HJ04) om de repressie van koolstofkatabolieten te verlichten, wat leidde tot een toename van 30% in het NADPH-niveau en NADPH/NADP+. Bijgevolg accumuleerde HJ04 tot 1,20 g/L acetol, wat 69,0% hoger is dan die van HJ02. Verder is de gapA gen in HJ04 werd tot zwijgen gebracht door antisense RNA (HJ05) om de acetolproductie verder te verbeteren. De door HJ05 geproduceerde acetolconcentratie bereikte 1,82 g/L, wat 2,1 en 1,5 keer hoger was dan die van HJ02 en HJ04.

Realtime PCR-analyse geeft aan dat glucosekatabolisme werd omgeleid van glycolyse naar de oxidatieve pentosefosfaatroute in HJ05.

Dit is een voorbeeld van abonnementsinhoud, toegang via uw instelling.


Materialen en methodes

Stammen, media en groeiomstandigheden

De gebruikte stammen en plasmiden staan ​​vermeld in Tabel 2 en Tabel S1. Tabellen S2, S3, S4 en S5 geven een lijst van de gebruikte oligonucleotiden. Kweken werden gekweekt bij 37°C in LB. Mutantselectie omvatte de antibiotica ampicilline (100 g ml 1), chlooramfenicol (25 g ml 1), kanamycine (50 g ml 1 wanneer resistentiegenen op plasmiden zaten en 25 μg ml −1 voor genen op chromosomen), apramycine ( 50 g ml 1) en nourseothricine (10-40 g ml 1, verkregen van Jena Bioscience GmbH, Jena, Duitsland). M9 minimaal medium (Sambrook et al. 1989) werd gebruikt met 0,4% (w/v) ofwel glucose ofwel glycerol. Gemodificeerd M9hP (M9 hoog of 100 mmol l −1 fosfaat) werd gebruikt voor biotransformatie: 500 ml 1·15x M9hP-zouten, 0,5 ml 0,1 M CaCl2, 0,5 ml 1 M MgSO4, 0,2 ml 10 mg ml −1 thiamine. De voorraadoplossing van 1·15x M9hP-zouten bestond uit 20·47 g Na2HPO4·2 H2O, 15·65 g KH2PO4, 1·15 g NaCl, 2·30 g NH4Cl en 2 l H2O.

Stam of plasmide Relevante genen/eigenschappena een (Amp R ), (Apr R ), (Cml R ), (Kan R ) of (Nou R ) = resistentie tegen ampicilline, apramycine, chlooramfenicol, kanamycine of nourseothricine aac(3)IV = aminoglycoside-3-N-acetyltransferase-gen, bla = β-lactamase-gen, kat = chlooramfenicolacetyltransferase-gen, nat1 = nourseothricine-acetyltransferase-gen.
Referentie of constructie
stammen
BW25113 lacI Q rrnBT14 ΔlacZWJ16 hsdR514 ΔaraBADAH33 ΔrhaBADLD78 Datsenko en Wanner ( 2000 )
WA66x BW25113 Lac +xthA::FRT Wegerer, A., IIGb B IIG = Instituut voor Industriële Genetica, Universiteit van Stuttgart
ss173 WA66xldhA::FRT-aac(3)IV-FRT ΔpokkenB::FRT ΔpflB::FRT P1 (MW4) x (ss171)c C P1 (A) × (B) = P1-transductie van genen van stam A naar stam B
ss195 WA66xpykF::FRT ΔpykA::FRT-kan-FRT ΔldhA::FRT ΔpokkenB::FRT ΔpflB::FRT ΔtdcE::FRT-aac(3)IV-FRT P1 (ss145) x (ss182)c C P1 (A) × (B) = P1-transductie van genen van stam A naar stam B
ss251 ss195 (geselecteerd voor snellere groei op glycerol, transfer #16) seriële passages
ss271 ss251gldA::mrpS-nat1-mrpS P1 (ss262) x (ss251)c C P1 (A) × (B) = P1-transductie van genen van stam A naar stam B
ss274 ss251pps::mrpS-nat1-mrpS P1 (ss266) x (ss251)c C P1 (A) × (B) = P1-transductie van genen van stam A naar stam B
ss279 ss251gldA::mrpS ss271 (pJOE5555·1)d NS (pJOE5555·1) Verwijdering van de weerstandsmarkering door plaatsspecifieke recombinatie tussen twee mrpS plaatsen met behulp van het door plasmide gecodeerde recombinase MrpA.
ss281 ss251mgsA::mrpS-nat1-mrpS ΔgldA::mrpS P1 (ss231) x (ss279)c C P1 (A) × (B) = P1-transductie van genen van stam A naar stam B
ss310 ss251maeA::mrpS-nat1-mrpS ΔgldA::mrpS P1 (ss296) x (ss279)c C P1 (A) × (B) = P1-transductie van genen van stam A naar stam B
ss374 ss251ppc::mrpS-nat1-mrpS ΔgldA::mrpS P1 (ss225) x (ss279)c C P1 (A) × (B) = P1-transductie van genen van stam A naar stam B
ss431 ss251maeB::mrpS-nat1-mrpS ΔmaeA::mrpS ΔgldA::mrpS P1 (ss415) x (ss430)
Plasmiden
pCP20 flp bla (Versterker R) kat (CmlR) repA101 Cherepanov en Wackernagel (1995)
pIJ773 FRT-aac(3)IV-FRT (Apr R ) bla (Versterker R) Windvlaag et al. ( 2003 )
pIJ790 kat (CmlR) repA101 araC λ-ROOD (gam, weddenschap, exo) Windvlaag et al. ( 2003 )
pJOE5555·1 Praag-mrpEen kat (CmlR) repA101 Altenbuchner, J., IIGb B IIG = Instituut voor Industriële Genetica, Universiteit van Stuttgart
pJOE6038·1 Aanvullend recA op plasmide pIJ790 Altenbuchner, J., IIGb B IIG = Instituut voor Industriële Genetica, Universiteit van Stuttgart
pWA38·4 bla (Versterker R) mrpS-kan-mrpS (Kan R) Wegerer, A., IIGb B IIG = Instituut voor Industriële Genetica, Universiteit van Stuttgart
pSS55·11 bla (Versterker R) mrpS-nat1-mrpS (Nou R ) Uitwisseling van resistentiegen in pWA38·4
pSS57·2 bla (Versterker R) mrpS-aac(3)IV-mrpS (Apr R ) Uitwisseling van resistentiegen in pSS55·11
  • een(Amp R ), (Apr R ), (Cml R ), (Kan R ) of (Nou R ) = resistentie tegen ampicilline, apramycine, chlooramfenicol, kanamycine of nourseothricine aac(3)IV = aminoglycoside-3-N-acetyltransferase-gen, bla = β-lactamase-gen, kat = chlooramfenicolacetyltransferase-gen, nat1 = nourseothricine-acetyltransferase-gen.
  • B IIG = Instituut voor Industriële Genetica, Universiteit van Stuttgart
  • C P1 (A) × (B) = P1-transductie van genen van stam A naar stam B
  • NS (pJOE5555·1) Verwijdering van de weerstandsmarkering door plaatsspecifieke recombinatie tussen twee mrpS plaatsen met behulp van het door plasmide gecodeerde recombinase MrpA.

Constructie van gendeleties met het λ-Red-recombinatiesysteem

Chromosomale gendeleties werden geconstrueerd met behulp van het λ-Red-recombinatiesysteem (Baba et al. 2006) en de E coli stam WA66x pJOE6038·1. WA66x is een Lac+-derivaat van BW25113 verkregen door P1-transductie (niet gepubliceerd). Het plasmide pJOE6038·1 is een derivaat van het recombinatieplasmide pIJ790, dat de heeft E. coli recA gen geïntegreerd naast de λ-Red exo, inzet en gam genen. De resistentiegencassettes geflankeerd door plaatsspecifieke recombinatieplaatsen voor de recombinasen, FLP en MrpA, werden geamplificeerd uit de volgende plasmiden: pWA38·4 (mrpS-KmR-mrpS), pIJ773 (FRT-aac(3)IV-FRT), pSS55·11 (mrpS-nat1-mrpS) en pSS57·2 (mrpS-aac(3)IV-mrpS). De voor gendeletie gebruikte oligonucleotiden zijn samengevat in Tabel S3. Elektroporatie van WA66x pJOE6038·1 werd uitgevoerd zoals beschreven door Gust et al. (2003). De chromosomale regio's met de antibioticaresistentiecassettes en bijbehorende gendeleties die zijn ontworpen in E coli WA66x pJOE6083·1 werden getransduceerd met behulp van de bacteriofaag P1kc zoals beschreven door Lennox (1955). Ter verificatie werd een bacteriekolonie die uit een LB-agarplaat was geplukt, opnieuw gesuspendeerd in 100 l water en gecentrifugeerd, en de cellen werden opnieuw gesuspendeerd in 100 l water en bewaard bij -20 ° C tot verder gebruik. 5 l van deze suspensie werd geamplificeerd door PCR (50 l reactievolume) volgens de instructies van de fabrikant met behulp van Taq DNA-polymerase. Analyse van de deleties en genvervangingen van pykA, pykF en tdcE door PCR in stammen ss195, ss251, ss279 en, als een controle, in ss173 wordt getoond in Fig. S1.

Excisie van antibioticaresistentiegencassettes

Het plasmide pCP20, dat een temperatuurgevoelig replicon bevat dat de thermische inductie van FLP-synthese mogelijk maakt, werd gebruikt om antibioticaresistentiegencassettes uit te snijden, geflankeerd door FRT plaatsen zoals beschreven door Cherepanov en Wackernagel (1995). Dezelfde procedure werd toegepast op het plasmide pJOE5555·1 dat het recombinase-gen draagt mrpA en mrpS sites die antibioticaresistentiegencassettes flankeren (Warth et al. 2011). De uitdrukking van mrpA werd geïnduceerd door de platen aan te vullen met 0,2% (w/v) 1-rhamnose. Meer details over deze en andere gebruikte methoden zijn te vinden in de studie van Söllner (2012).

Bepaling van de groeisnelheid

Een kweek gedurende de nacht in M9-medium werd gebruikt om kweken te inoculeren in Erlenmeyerkolven van 100 ml gevuld met 15 ml groeimedium dat ofwel glucose ofwel glycerol als koolstofbronnen bevatte. Er werden geen antibiotica toegevoegd. De kolven werden geïncubeerd bij 37°C [Gio Gyrotory ® Shaker NBS (Edison, NJ, VS) bij C. 200 omw min −1 ] de initiële celdichtheid lag tussen 0,01 en 0,1 OD600. De resulterende parameter μ (h −1 ) geeft de maximale groeisnelheid per uur naar de basis e aan.

Aerobe selectie voor snellere groei op glycerol

Als een selectie van snellere groei, de pykAF mutant ss195 werd herhaaldelijk gekweekt in M9-medium met glycerol. Uitgaande van een voorkweek in M9 met 0,4% glucose werd 100 ml M9-medium met 0,4% glycerol in een schudkolf van 500 ml geënt bij een OD600 van 0,01 (transfer #1) en aëroob geïncubeerd bij 37°C. Wanneer een OD600 van ongeveer 1 werd bereikt, werden de cellen opnieuw overgebracht naar nieuw medium. Het volume van het entmateriaal voor de volgende kweek werd aangepast aan de groeisnelheid van de kweken, zodat volgende kweken een celdichtheid van 1 OD konden bereiken600 binnen 24 uur.

Herschikking van het hele genoom en gegevensanalyse

Deformatie E coli ss251 werd gesequenced door GATC Biotech AG (Konstanz, Duitsland) op het Illumina/Solexa SBS-platform. De individuele aflezingen (zowel voorwaartse als achterwaartse richtingen) waren 51 bp lang, de sequentiegegevens werden geanalyseerd met het softwarepakket Geneious Pro trial 5.6.5 (Biomatters Ltd., Newark, NJ, VS). De uitlezingen werden toegewezen aan het referentiegenoom van E coli K12 MG1655 (inschrijvingsnummers: NC_000913.2/GI:49175990), en vervolgens werd er gezocht naar nucleotide-uitwisselingen en -deleties.

Kleinschalige biotransformatietest in plastic bekers van 1,5 ml

Een overnachtkweek van 5 ml in M9 met 0,4% glucose en het betreffende antibioticum werd gebruikt om een ​​voorkweek van 15 ml te inoculeren in een kolf van 100 ml met M9 aangevuld met 0,4% glycerol als koolstofbron (in het geval van stammen ss310 en ss431, de voorkweek werd bovendien aangevuld met 10 mmol l −1 pyruvaat). De kweek werd 4 uur bij 37°C geïncubeerd tot een celdichtheid van C. 0,6 OD600 was bereikt. De cellen werden gepelleteerd en opnieuw gesuspendeerd in 5 ml 1.15x M9hP zonder enige koolstofbron en op ijs bewaard. Een biotransformatie-oplossing werd bereid door de cellen te mengen met 1·15x M9hP-oplossing, 150 l 20% (w/v) glycerol en 600 μl 1 M NaHCO3 tot een eindvolume van 6 ml (1x M9hP). De celdichtheid van een standaard biotransformatietest was 0,5 OD600. Porties van 1,2 ml werden overgebracht in plastic bekers van 1,79 ml en de deksels werden stevig gesloten (resterende luchtruimte = 0,59 ml) om anaërobe of microaërobe omstandigheden te creëren. De plastic bekers werden bij 37°C geïncubeerd (rotator, Neolab, C. 10 rev min −1, straal 10 cm) en slechts één keer geopend om de celdichtheid te bepalen en de extracellulaire metabolieten te analyseren met behulp van HPLC. De cellen werden gepelleteerd en het supernatant werd bewaard bij -20°C voor daaropvolgende analyse.

Analytics

De concentraties van glycerol, lactaat, acetaat, formiaat, succinaat en ethanol werden bepaald met behulp van een Agilent 1200-serie HPLC-systeem uitgerust met een REZEX ROA-kolom (300 × 7·8 mm, Phenomenex, Aschaffenburg, Duitsland) die de detectie van organische zuren mogelijk maakte 5 mmol l −1 H2DUS4 werd gebruikt als mobiele fase. De monsters werden als volgt bereid: 1 ml verdund monster werd gemengd met 45 l 4 M NH3 (pH 10·2) en 100 μl 1,2 M MgSO4 en gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd om fosfaat neer te slaan als magnesiumammoniumfosfaathexahydraat. Na 5 min centrifugeren werd 500 l van het supernatant gemengd met 500 μl 0,1 M H2DUS4. Na een incubatieperiode van 15 minuten en centrifugeren van 15 minuten werd het supernatant gebruikt voor HPLC-analyse.

13 C-analyse

Om kooldioxidefixatie te meten, werden de hierboven beschreven ‘kleinschalige’ (1,5 ml) biotransformaties uitgevoerd met behulp van volledig gelabeld NaH 13 CO3 (98 atoom% 13 C, Isotec ™, Miamisburg, OH, VS) in plaats van de natuurlijk gelabelde (12 C) waterstofcarbonaatisotoop. De resulterende metabolietlabelpatronen werden geanalyseerd met behulp van een TurboMass GC-MS-systeem (PerkinElmer LAS, Rodgau, Duitsland) zoals beschreven door Vielhauer et al. (2011). De resulterende MS-meetgegevensset moest verder worden herzien om de natuurlijk voorkomende 13C-labels te scheiden van die welke kunstmatig zijn bereikt door toepassing van de op software gebaseerde massa-isotoopcorrectiemethode (MATLAB-gebaseerde softwaretool), beschreven door Wahl et al. ( 2004 ).


Hoe bewegen aminozuren en glucose door het celmembraan?

Aminozuren, glucose en andere onoplosbare verbindingen met grote membranen bewegen door het celmembraan via een proces dat bekend staat als gefaciliteerde diffusie. Dit proces omvat transmembraaneiwitten, die een klein met water gevuld kanaal openen waardoor de moleculen de cel in of uit kunnen gaan.

Glucose ondergaat gefaciliteerde diffusie door te binden aan een transporteiwit, dat vervolgens zijn configuratie verandert om glucose in de cel af te geven. Dit proces wordt gecontroleerd door insuline, dat het membraan stimuleert om het aantal glucosetransporteiwitten aan het oppervlak te verhogen. Wanneer de cel meer glucose nodig heeft, leidt het verhoogde aantal transporteiwitten tot verhoogde glucosediffusie in de cel.

Elk van de verschillende aminozuren en andere in vet onoplosbare moleculen heeft zijn eigen specifieke transporteiwit waaraan het zich bindt om in de cel te diffunderen. Deze transporteiwitten zijn ook verantwoordelijk voor het indien nodig verwijderen van overtollige moleculen uit de cellen, omdat het diffusieproces altijd volledig omkeerbaar is en wordt gecontroleerd door hetzelfde transporteiwit. Diffusie wordt beschouwd als passief transport, omdat het geen energie vereist, terwijl andere moleculen de cellen moeten binnenkomen via actief transport dat energie vereist. Water is de enige verbinding die door het celmembraan kan gaan zonder diffusie of actief transport.


Bekijk de video: DIFUSI ASAM SALISILAT PADA MEDIA AGAR5C (Februari 2023).